非洲豬瘟病毒MGF-505R基因缺失株雙重熒光RPA檢測方法的建立及應用

鄧俊花，呂繼洲，陳冬杰，袁向芬，魏方，趙文軍，2，吳紹強，2*

(1. 中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2. 三亞中國檢科院生物安全中心，海南 三亞 572025)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬的一種烈性、高度接觸性出血性傳染病。2018年8月3日我國沈陽市首次報道ASF疫情，基因型為基因Ⅱ型，與Georgia2007/1株同源性一致[1-2]。隨后疫情傳至我國多省市自治區(qū)，防控形勢十分嚴峻。由于自然的基因突變及基因敲除疫苗中試產(chǎn)品的泄露，我國ASFV田間毒株較為復雜。2021年報道，我國山東和河南流調(diào)臨床樣品中分離出2株分離株(HeN/ZZ-P1/21和SD/DY-I/21)，均為基因I型，并且出現(xiàn)了MGF-505R基因缺失[3-4]。

ASFV的多基因家族(MGFs)包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530等。其中，MGF-505R基因作為免疫逃逸基因，敲除后可降低毒力，增加宿主的免疫應答[5-11]。MGF-505R基因單獨敲除或者聯(lián)合CD2v基因敲除等的ASFV缺失株屢見報道，但均由于安全性、保護力等原因而未能獲批大規(guī)模生產(chǎn)使用。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳發(fā)布《關于進一步嚴厲打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為的通知》(農(nóng)辦牧〔2020〕39號)中明確，嚴打非法疫苗的制造、銷售及使用等行為，所涉及的基因缺失株即包含了MGF-505R缺失疫苗。

重組酶聚合酶擴增技術 (recombinase polymerase amplification，RPA)是于2006年Piepenburg等研發(fā)的一種不同于LAMP技術的等溫擴增技術，該技術主要依附重組酶UvsX、單鏈結(jié)合蛋白Gp32和鏈置換DNA聚合酶Bsu，能在37～42 ℃恒溫條件下快速完成指數(shù)量級的DNA擴增，且反應時間為15 min左右。實時熒光RPA技術結(jié)合了RPA的快速反應和熒光信號的實時監(jiān)測特點，極大推動了RPA的快速靈敏優(yōu)勢。目前，RPA已成功用于多種病原的快速檢測[12-18]，但基于ASFV MGF-505R基因缺失株的實時熒光RPA檢測方法尚未報道。

本研究以ASFV MGF-505R基因為靶標，與ASFV保守的B646L基因檢測組合建立了一種MGF-505R基因缺失株的雙重熒光RPA快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)及豬細小病毒(PPV)均是我國商品化弱毒或滅活疫苗，采用核酸提取試劑盒提取核酸，實驗室保存?zhèn)溆茫?66份臨床核酸樣品，包括105份豬血液、8份豬糞便、51份新鮮豬肉以及2份豬火腿樣品，均是實驗室保存的DNA核酸；MGF-505R基因缺失株質(zhì)粒Mut-MGF-505R-He21/SD21，分別根據(jù)HeN/ZZ-P1/21和SD/DY-1/21分離株基因序列，選擇20336-18988(GenBank:MZ945536.1)及21034-19686(GenBank：MZ945537.1)分別人工合成并插入載體中構建質(zhì)粒并保存。

TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit購自北京寶日醫(yī)生物公司；DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)，購自濰坊安普未來生物科技有限公司。

1.2 RPA引物和探針設計

基于ASFV B646L、MGF-505R相對保守基因序列，設計RPA引物及exo探針(見表1)，通過BLAST分析表明可適用ASFV 所有基因型。所有引物及探針均由華大基因生物科技有限公司合成。

表1 RPA引物及探針序列

1.3 ASFV MGF-505R/B646L質(zhì)粒參比品的制備

根據(jù)GenBank 中ASFV Pig/HLJ/2018株(NC MK333180.1)MGF-505R和B646L基因序列信息，由華大基因生物公司合成并克隆至pUC-57載體中，分別命名為pUC-B646L、pUC-MGF-505R。將相應質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞JM109，過夜培養(yǎng)后選擇白色單克隆菌落，采用測序鑒定后，培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒并測定濃度。根據(jù)下列公式，換算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies)/μL=6.02×1023(copies/mol)×質(zhì)粒濃度(ng/μL)/(質(zhì)粒長度×660)。

1.4 雙重熒光RPA反應體系建立

采用DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)，制備50 μL RPA反應體系如下：其中MGF-RPA-F/R(10 μmol/L)以及B646L-RPA-F/R(10 μmol/L)均為0.5～2.5 μL，MGF-RPA-P(10 μmol/L)/B646L-RPA-P(10 μmol/L)均為0.4～1.0 μL，含有反應mix的A buffer 29.4 μL，含有MgAc的B buffer 2.5 μL，含B646L和MGF-505R重組質(zhì)?；旌夏０?比例1∶1)適量，補ddH2O至50 μL。將模板和B buffer之外的所有試劑加入干粉反應管中，加入鋼珠。將B buffer加入反應管蓋內(nèi)，再加入模板，蓋緊后渦旋混勻后瞬時離心，放入恒溫熒光檢測儀(型號：WL-16-Ⅱ)中。熒光檢測程序設置為：反應溫度為37～42 ℃。每30 s采集一次FAM/VIC通道熒光值，反應時間15 min。優(yōu)化反應體系，以建立相應熒光RPA檢測方法。

1.5 雙重熒光RPA方法敏感性檢測

將pUC-MGF-505R、pUC-B646L重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋，對應的拷貝數(shù)分別為2.5×10-1～2.5×105copies/μL(對應100～106copies/反應)，進行實時熒光RPA檢測，以確定方法的最低檢測線。

1.6 雙重熒光RPA方法特異性檢測

以CSFV、PRRSV、PPV、PRV、PCV2核酸、Mut-MGF-505R-He21/SD21質(zhì)粒為模板，設立pUC-MGF-505R pUC-B646L重組質(zhì)粒為陽性質(zhì)控，進行熒光RPA方法特異性評價。

1.7 雙重熒光RPA方法重復性檢測

分別采用pUC-MGF-505R、pUC-B646L重組質(zhì)粒2.5×102copies/μL、2.5×103copies/μL 2個濃度，重復檢測6次，分析該熒光RPA方法的重復性。

1.8 臨床應用評價

采用雙重實時熒光RPA方法對來自臨床豬全血、火腿、豬肉、糞便等266份組織樣品進行檢測，并與世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)推薦熒光定量PCR方法檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重實時熒光RPA方法的建立

優(yōu)化反應程序后，確定雙重實時熒光RPA方法50 μL反應體系：MGF-RPA-F/R(10 μmol/L)以及B646L-RPA-F/R(10 μmol/L)均為2 μL，MGF-RPA-P(10 μmol/L)/B646L-RPA-P(10 μmol/L)均為0.8 μL，含有反應mix的A buffer 29.4 μL，含有MgAc的B buffer 2.5 μL，含B646L和MGF-505R重組質(zhì)?；旌夏０?比例1∶1)8 μL，補ddH2O至50 μL。最佳反應溫度為42 ℃，反應時間為15 min。結(jié)果判定：當FAM熒光通道有擴增曲線判定為MGF-505R核酸陽性；當VIC熒光通道有擴增曲線判定為B646L核酸陽性；當FAM和VIC熒光通道無擴增曲線時，判定為MGF-505R、B646L核酸陰性。

2.2 雙重實時熒光RPA反應體系優(yōu)化

MGF-505R(F/R)與B646L(F/R)一套反應體系；MGF-505R(F/R2)與B646L(F/R)一套反應體系。2套反應體系引物擴增結(jié)果見圖2。2套反應體系效果對比表明，MGF-505R(F/R)與B646L(F/R)反應體系效果比較好。

圖1 雙重熒光RPA引物探針篩選結(jié)果

FAM(A)以及VIC(B)通道擴增曲線標注樣品濃度為101～106 copies/反應。

2.3 雙重熒光RPA方法敏感性檢測

采用雙重實時熒光RPA方法檢測不同濃度pUC-MGF-505R、pUC-B646L重組質(zhì)粒參比品。檢測結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示該方法中MGF-505R基因和B646L基因均可達到10 copies/反應的檢測量。

2.4 雙重熒光RPA方法特異性檢測

以CSFV、PRRSV、PPV、PRV、PCV2核酸進行特異性試驗，結(jié)果表明僅pUC-MGF-505R、pUC-B646L為模板時可產(chǎn)生特異性熒光曲線，其余皆為核酸陰性(圖3A)，證明所建立的雙重熒光RPA方法可同時檢測ASFV的B646L、MGF-505R基因，與其他病原核酸無交叉反應，具有良好特異性。

A. 雙重熒光RPA雙通道特異性檢測；B. 雙重熒光RPA雙通道MGF-505R基因缺失株檢測。

此外，以Mut-MGF-505R-He21/SD21為模板進行雙重熒光RPA方法檢測，結(jié)果無擴增曲線(圖3B)，進一步驗證了本檢測方法的特異性。

2.5 雙重熒光RPA方法重復性檢測

不同稀釋濃度的pUC-MGF-505R、pUC-B646L重組質(zhì)粒為模板，采用優(yōu)化后的熒光RPA方法進行重復性檢測，結(jié)果顯示FAM以及VIC通道各組內(nèi)變異系數(shù)在0.4%～0.65%之間，均小于2%。表明建立的雙重熒光RPA方法具有良好的重復性。

2.6 臨床應用評價

采用雙重實時熒光RPA方法同時檢測266份臨床核酸樣品，檢測見表2。10份豬血液樣品、2份豬火腿樣品檢測結(jié)果均為核酸陽性，其余254份樣品均為陰性。雙重實時熒光RPA方法中MGF-505R基因、B646L基因檢測均與WOAH推薦熒光PCR方法一致。表明該方法中涉及臨床樣本均是非洲豬瘟野毒株，未檢測到臨床MGF-505R基因缺失株。

表2 實時熒光RPA和熒光PCR對臨床樣品檢測結(jié)果的比較

3 討論

非洲豬瘟嚴重阻礙世界各國的經(jīng)濟以及養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。非洲豬瘟的疫苗研究一直為各國疫情防控努力的方向。步志高等[19]及扈榮良等[20]研究了針對非洲豬瘟病毒MGF 360505R基因缺失及CD2v/MGF 360505R聯(lián)合基因缺失的2種疫苗株，均能夠?qū)SFV中國流行強毒株產(chǎn)生100%免疫保護。鄭海學團隊為進一步減弱對豬的致病性和免疫抑制性，獲得更加安全有效的疫苗候選毒株，以ASFV CN/GS/2018為親本毒株，得到同時敲除MGF110-9L和MGF505-7R的雙基因缺失毒株，該毒株對豬無臨床致病性，免疫攻毒試驗結(jié)果表明它能夠產(chǎn)生很好的免疫保護效果[21]。目前研究的關于MGF的減毒疫苗或基因缺失疫苗安全性及可持續(xù)性均尚未成熟。截至目前，包括中國在內(nèi)的世界各國均未批準上市銷售使用非洲豬瘟商品化疫苗。我國市場流通領域出現(xiàn)“非洲豬瘟非法假疫苗”的現(xiàn)象。同時，在非洲豬瘟疫情監(jiān)測中，我國ASF田間流行毒株已呈現(xiàn)出一定程度的復雜化。因此，非洲豬瘟基因缺失株和流行株的鑒別刻不容緩。

目前，已有非洲豬瘟流行毒株及基因缺失株的鑒定方法研究[22-25]，但均是采用熒光PCR技術建立的鑒別方法。為進一步鑒別篩查臨床生豬非洲豬瘟感染情況及市場上非法疫苗的制售行為，建立適合現(xiàn)場、快速的鑒別診斷技術，對制定非洲豬瘟復雜的疫情防控措施以及促進非洲豬瘟疫苗開發(fā)都具有極其重要的意義。

實時熒光RPA技術，可在接近常溫的恒溫條件下擴增靶標產(chǎn)物，相比于熒光PCR技術，不僅檢測時間從常規(guī)的1 h縮短至15 min，并且簡化了儀器要求，更適合現(xiàn)場應用。本研究基于MGF-505R基因及B646L基因，設計特異性的引物/探針，在反應體系內(nèi)同時加入MGF-505R基因和B646L基因的2套特異性引物/探針，建立快速的雙重實時熒光RPA檢測方法，最低檢測線均達到10 copies/反應，具備較高的靈敏度且特異性，可以滿足現(xiàn)場非洲豬瘟病毒快速篩查的需求。同時，本方法基于266份不同類型的臨床樣品，包含血液、肉組織、糞便、火腿產(chǎn)品等，對該方法的臨床檢測效果進行綜合評估，與WOAH推薦的熒光PCR檢測結(jié)果一致。雖然，臨床樣品檢測評估均為ASFV野毒株感染，無MGF-505R基因缺失株，但是通過該方法特異性檢驗表明，該方法適合MGF-505R基因缺失株的診斷。該方法不僅能在15 min內(nèi)完成檢測反應，同時可以實時監(jiān)測樣品的檢測狀態(tài)，大大縮短了病毒核酸鑒定的時間[22]。本研究方法反應體系中加入了鋼珠，便于試劑處于均勻反應狀態(tài)，改善常規(guī)RPA試劑反應效果差的問題。

綜上，本研究建立的非洲豬瘟MGF-505R基因缺失株的雙重熒光RPA檢測方法，敏感性可達10 copies/反應，特異性強，同時可在15 min內(nèi)實時監(jiān)測并獲取樣品檢測結(jié)果，優(yōu)于熒光PCR的檢測時間，更適合現(xiàn)場快速篩查。該方法的建立具有較高的臨床應用價值，推廣前景廣泛，為后續(xù)我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供一種新的ASFV現(xiàn)場快速檢測技術支持。