應(yīng)用于RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果可視化的膠體金試紙條制備與評(píng)價(jià)

楊晨，薛俊欣，林雅娟，王小妹，蔣蔚，張曼玉，王權(quán)*，孫衛(wèi)東

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3. 中華人民共和國(guó)上海海關(guān)，上海 200002)

膠體金側(cè)向免疫層析試紙條(GICS)是以膠體金為示蹤標(biāo)記物、基于抗原抗體免疫反應(yīng)的側(cè)流層析技術(shù)，它在病原微生物抗原檢測(cè)、藥物殘留監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。通過(guò)在核酸擴(kuò)增時(shí)將不同的標(biāo)簽引入核酸鏈的兩端，基于相應(yīng)抗體或配體與標(biāo)簽的相互作用，對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生可視化的現(xiàn)象，GICS便可應(yīng)用于核酸檢測(cè)[1]。楊賢等[2]使用異硫氰酸熒光素標(biāo)簽修飾的上游引物和生物素標(biāo)簽修飾的下游引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，在擴(kuò)增產(chǎn)物上引入的2個(gè)標(biāo)簽?zāi)芊謩e被抗熒光素抗體和金標(biāo)鏈霉親和素(streptavidin，SA)識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而在60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)乙肝病毒核酸的GICS檢測(cè)。PCR-GICS方法的檢測(cè)速度明顯快于常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳(AGE)和實(shí)時(shí)熒光 PCR，無(wú)需借助電泳儀或熒光定量系統(tǒng)就能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)結(jié)果的可視化，龐璐等[3]還指出該方法可提高檢測(cè)的靈敏度。但PCR需要專業(yè)的儀器和操作人員，不能運(yùn)用PCR-GICS方法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)則彌補(bǔ)了PCR、熒光定量PCR等熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的不足，降低了設(shè)備要求，具有簡(jiǎn)便、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)。目前常用的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、重組酶-聚合酶擴(kuò)增(RPA)、滾環(huán)核酸擴(kuò)增 (RCA)、鏈替代擴(kuò)增(SDA)等[4]。RPA是發(fā)展最快的方法之一，該方法能在低溫(37～42 ℃恒溫下)、短時(shí)間內(nèi)(≤30 min)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物，目前已實(shí)現(xiàn)較為成熟的市場(chǎng)化[5]。英國(guó)TwistDxTM公司開發(fā)了TwistAmp?Basic、TwistAmp?exo、TwistAmp?nfo等商品化RPA反應(yīng)試劑盒，其中RPA nfo試劑盒及其配套的側(cè)流試紙條Milenia HybriDetect 1/2是最常用的RPA-GICS技術(shù)，能在10～35 min內(nèi)完成核酸擴(kuò)增及試紙條檢測(cè)[6]，然而該試紙條價(jià)格昂貴、成本較高。本研究基于金標(biāo)6-羧基熒光素(6-FAM)單克隆抗體及生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，自主研發(fā)了用于RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果可視化的膠體金免疫層析試紙條，降低了檢測(cè)成本，為實(shí)現(xiàn)RPA-GICS技術(shù)的國(guó)產(chǎn)化，建立核酸快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6-FAM、鏈霉親和素購(gòu)自阿拉丁公司；卵白蛋白(OVA)、聚乙二醇購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京威萊博生物技術(shù)有限公司；1，2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷購(gòu)自梯希愛(上海)化工貿(mào)易有限公司；氯金酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RPA nfo反應(yīng)所用的引物及探針，F(xiàn)-B探針(6-FAM，Biotin雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，其序列為5′-(6-FAM)-TTTTTT-Biotin-3′，它們均由生工生物工程股份有限公司合成；BALB/c雌鼠購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司；SBA Clonotyping System-HRP購(gòu)自美國(guó)Southern Biotech公司；Protein G Agarose (Fast Flow，抗體純化用)和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TwistAmp?nfo和Milenia HybriDetect 2(Milenia Biotec-MGHD1)購(gòu)自英國(guó)TwistDxTM公司；PVC底板、吸水墊、加樣墊、硝酸纖維膜(Sartorius CN95，孔徑15 μm)均購(gòu)自上海捷寧生物科技有限科技公司。

1.2 抗6-羧基熒光素(6-FAM)單克隆抗體的制備

1.2.1 抗6-FAM完全抗原的制備與鑒定

參考Wang等[7]的文獻(xiàn)，采用活性酯法制備完全免疫原(6-FAM-1-BSA)和完全包被原(6-FAM-1-OVA)。取20 mg BSA/OVA溶于3.5 mL 0.05 mol/L 2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(MES)中(pH值4.5～7.2)，加入0.5 mL碳二亞胺溶液(EDC)(7.52 mg/mL MES緩沖液溶解)和0.5 mL N-羥基琥珀酰亞胺溶液(NHS)(6 mg/mL MES緩沖液溶解)并混勻；加入15 μL 1，2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷，冰浴攪拌4 h，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)透析3 d，作為A液。取15 mg 6-FAM溶于400 μL DMF中，各加入100 μL EDC溶液和NHS溶液，均為100 mg/mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴振蕩過(guò)夜，作為B液。將B液緩慢滴加至A液中，4 ℃攪拌12 h，1×PBS透析 7 d。運(yùn)用紫外-可見光(UV-Vis)掃描對(duì)所制備的完全抗原進(jìn)行鑒定，并對(duì)成功偶聯(lián)的完全抗原液進(jìn)行分裝、冷凍干燥。

1.2.2 小鼠免疫與血清6-FAM多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

將偶聯(lián)成功的完全免疫原6-FAM-1-BSA與佐劑1∶1混合、震蕩乳化，免疫8周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠，具體程序如表1。在二免、三免和四免后10 d分別對(duì)免疫鼠進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血，血凝后離心取上層血清，運(yùn)用間接ELISA方法測(cè)定效價(jià)：使用包被抗原6-FAM-1-OVA包被酶標(biāo)板(設(shè)置5、2.5、1.25、0.625及0.312 5 μg/mL 5個(gè)濃度)，4 ℃過(guò)夜，洗板；1%明膠37 ℃封閉2 h，洗板；在相同抗原包被濃度下加入梯度稀釋的血清作為一抗，37 ℃孵育1.5 h，洗板；加入1∶20 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG作為二抗，37 ℃孵育1 h，洗板；TMB顯色液37 ℃孵育15 min，2 mol/L H2SO4終止顯色，測(cè)定OD450。在四免后第14天選擇血清效價(jià)最高的免疫鼠進(jìn)行腹腔沖擊免疫。

表1 完全免疫原(6-FAM-1-BSA)的小鼠免疫程序

1.2.3 誘生腹水瘤法單克隆抗體的制備及評(píng)價(jià)

腹腔沖擊免疫后第3天，使用PEG誘導(dǎo)免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，再用HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。融合后第7天，觀察并標(biāo)記96孔板中細(xì)胞團(tuán)的個(gè)數(shù)，待細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)到占孔大小1/16～1/8時(shí)，酶標(biāo)板包被1.25 μg/mL 6-FAM-1-OVA，吸取細(xì)胞上清液作為一抗，運(yùn)用間接ELISA篩選陽(yáng)性孔，對(duì)OD450值較高的陽(yáng)性孔先后進(jìn)行3次亞克隆，篩選能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

運(yùn)用誘生腹水法，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞用生理鹽水重懸，腹腔注射至已預(yù)先注射石蠟油的BALB/c雌鼠。待小鼠腹部膨大且處于瀕死狀態(tài)時(shí)，收集腹水，離心棄去上層石蠟油及下層細(xì)胞沉淀后，置于-80 ℃長(zhǎng)期保存。同1.2.2，運(yùn)用間接ELISA方法測(cè)定腹水6-FAM單抗的效價(jià)。依照SBA Clonotyping System-HRP試劑盒說(shuō)明書，分別對(duì)單抗腹水及單抗細(xì)胞上清液進(jìn)行抗體分型檢測(cè)。

單抗腹水使用Protein G瓊脂糖抗體純化柱純化，收集的洗脫液經(jīng)4 ℃透析(0.005 mol/L PB，pH值7.2)、濃縮后，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度。參考非競(jìng)爭(zhēng)ELISA單克隆抗體親和力測(cè)定方法[8-9]，以2、1、0.5、0.25 μg/mL 6-FAM-1-OVA包被酶標(biāo)板，以倍比稀釋的不同濃度梯度的純化抗體為一抗，以1∶1×104稀釋的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行間接ELISA測(cè)定。再以O(shè)D450值為縱坐標(biāo)，以純化抗體濃度(mol/L)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線，計(jì)算在抗原抗體50%結(jié)合時(shí)，即50%ODmax值(每條曲線的最大OD450值)所對(duì)應(yīng)的抗體濃度，最后根據(jù)以下公式計(jì)算出親和力常數(shù)(Ka)。

其中n、[Ab′]t和[Ab]t分別為每組中2個(gè)包被濃度的倍數(shù)及各自對(duì)應(yīng)的50%ODmax值。

1.3 膠體金標(biāo)記6-FAM單克隆抗體與膠體金免疫層析試紙條的制備

1.3.1 試紙條的組裝

在PVP底板中間貼上硝酸纖維素(NC)膜，并在NC膜上、下分別覆蓋吸水墊、加樣墊，與NC膜重疊0.3 mm左右。每條試紙條寬度4 mm。

1.3.2 膠體金的燒制及其與6-FAM單抗最佳標(biāo)記條件的優(yōu)化

采用檸檬酸鈉還原法燒制粒徑15 nm的膠體金，取100 mL 0.01%氯金酸加熱至沸騰，迅速加入2 mL 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌加熱，反應(yīng)液由黃色依次變?yōu)榛易稀⒕萍t，待顏色不再變化時(shí)停止加熱，冷卻后即制得透亮的膠體金溶液，經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描測(cè)得溶液的最大吸收峰為519 nm。

通過(guò)高濃度NaCl破壞試驗(yàn)，優(yōu)化制備金標(biāo)6-FAM單抗的標(biāo)記pH值和抗體標(biāo)記量：在1 mL膠體金溶液中，設(shè)置0.1 mol/L K2CO3投入量分別為0、10、20、30、40、50 μL，混勻后測(cè)得pH值分別為6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0，各加入10 μg 6-FAM純化抗體，混勻靜置10 min，再加入100 μL 10% NaCl，混勻靜置2 h后觀察顏色變化；在最佳標(biāo)記pH值下，分別加入抗體終濃度為0、2.5、5、10、15、20 μg/mL的膠體金，同樣加入10% NaCl并觀察顏色變化。若標(biāo)記效果不佳，加入高濃度NaCl后破壞膠體金的負(fù)電斥力，改變其疏水膠體的狀態(tài)，形成死金的情況，表現(xiàn)為膠體金變淺、變紫、甚至變黑沉淀。

確定最佳pH值和最佳抗體標(biāo)記量后，在最低標(biāo)記量10 μg/mL膠體金的基礎(chǔ)上增加20%[10]，向膠體金溶液中加入6-FAM純化單抗，邊攪拌邊逐滴加入，室溫避光反應(yīng)30 min，再逐滴加入10% BSA至終濃度1%，攪拌20 min后再靜置1 h，4 ℃下9 200g離心30 min，慢慢吸去上清液，下層松散沉淀用重懸液重懸至原膠體金溶液的1/10。

1.3.3 膠體金免疫層析試紙條鏈霉親和素線包被緩沖液的優(yōu)化

蛋白質(zhì)主要通過(guò)靜電荷力、疏水力、氫鍵等包被于NC膜上，考慮到pH值及離子強(qiáng)度對(duì)鏈霉親和素與NC膜之間吸附作用的影響，分別測(cè)試表2中4種溶液對(duì)包被效果的影響，控制檢測(cè)(T)線鏈霉親和素的包被濃度均為1 mg/mL，質(zhì)控(C)線包被1 mg/mL羊抗鼠IgG，37 ℃烘干。如圖2，DNA模板使用RPA nfo試劑盒擴(kuò)增后，產(chǎn)生帶有6-FAM和Biotin標(biāo)簽的擴(kuò)增產(chǎn)物，可用6-FAM和Biotin雙標(biāo)記的F-B探針代替該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行試紙條的性能優(yōu)化。向100 μL 0.01 mol/L pH值7.0 PB層析液中加入終濃度為50 nmol/L的F-B探針模擬陽(yáng)性樣本，不含F(xiàn)-B探針的層析液模擬陰性樣本，在陽(yáng)性樣本和陰性樣本中各加入3 μL金標(biāo)抗體，混勻后上樣，觀察條帶顏色深淺。

圖2 RPA nfo試劑盒進(jìn)行DNA擴(kuò)增的示意圖

表2 T線包被緩沖液

1.4 膠體金免疫層析試紙條RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物可用性試驗(yàn)

1.4.1 膠體金免疫層析試紙條最佳層析液的優(yōu)化

使用所設(shè)計(jì)的派氏異尖線蟲RPA引物及探針，以1 μL派氏異尖線蟲質(zhì)粒(1 copy/μL)模板進(jìn)行RPA nfo擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物作為陽(yáng)性樣本；以UP水為空白對(duì)照，進(jìn)行RPA nfo擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物作為陰性樣本。在相同T線和C線包被濃度下(均為1 mg/mL)，分別使用3種層析液(表3)，將5 μL反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至100 μL，再加入10 μL金標(biāo)6-FAM單抗充分混合，上述混合液全部加至試紙條加樣墊上，5 min后觀察使用不同層析液所對(duì)應(yīng)的條帶深淺。

表3 GICS層析液

1.4.2 膠體金免疫層析試紙條T線最佳包被濃度的優(yōu)化

設(shè)置T線SA包被濃度為0.5、0.75、1、1.5 mg/mL，使用最佳層析液將5 μL陽(yáng)性樣本與10 μL金標(biāo)6-FAM單抗充分混合，加至試紙條加樣墊，5 min后觀察不同T線包被濃度所對(duì)應(yīng)的條帶深淺。

1.4.3 膠體金免疫層析試紙條最佳反應(yīng)產(chǎn)物用量及金標(biāo)抗體用量?jī)?yōu)化

采用控制變量法：先設(shè)置反應(yīng)產(chǎn)物用量為2、5、8 μL，金標(biāo)抗體用量為10 μL，摸索最佳反應(yīng)產(chǎn)物用量；再在最佳反應(yīng)產(chǎn)物用量下，金標(biāo)抗體用量設(shè)為5、10、15 μL，測(cè)得最佳金標(biāo)抗體用量。

1.4.4 自主研發(fā)的膠體金免疫層析試紙條與商品化試紙條性能對(duì)比

確立最佳條件后，分別使用自主研發(fā)的膠體金免疫層析試紙條與商品化試紙條Milenia HybriDetect 2，檢測(cè)以1 μL不同濃度(0.5×106～1×106copies/μL)質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性樣本和以1 μL超純水為模板的陰性樣本，5 min后對(duì)比條帶有無(wú)及顏色深淺。

2 結(jié)果

2.1 完全抗原紫外-可見光吸收光譜鑒定

在275～575 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別對(duì)6-FAM、BSA、OVA以及制備的完全抗原6-FAM-1-BSA和6-FAM-1-OVA進(jìn)行紫外-可見光掃描，結(jié)果見圖3。6-FAM、BSA、OVA分別在497、285、284 nm處有最大吸收峰。偶聯(lián)后，6-FAM-1-BSA在284 nm和497 nm存在吸收峰，6-FAM-1-OVA在283 nm和496 nm存在吸收峰，充分透析的完全抗原的紫外-可見光吸收光譜出現(xiàn)了6-FAM的特征吸收峰，初步說(shuō)明偶聯(lián)成功。

圖3 6-FAM-1-BSA與6-FAM-1-OVA的紫外-可見光吸收光譜

2.2 免疫鼠血清6-FAM多克隆抗體效價(jià)

運(yùn)用間接ELISA測(cè)定小鼠血清多抗效價(jià)，結(jié)果如圖4和表4所示。隨著免疫次數(shù)的增多，小鼠血清效價(jià)逐步提高，四免后4只小鼠的6-FAM多抗效價(jià)均高于1∶80 000。選擇效價(jià)最高的4號(hào)小鼠進(jìn)行腹腔沖擊免疫，沖擊后第3天測(cè)定該鼠的血清效價(jià)比四免時(shí)更高，已達(dá)到1∶320 000。

圖4 免疫鼠血清(1∶80 000稀釋)6-FAM多克隆抗體效價(jià)

表4 4號(hào)免疫鼠在沖擊免疫后第3天的血清效價(jià)

2.3 免疫鼠腹水6-FAM單克隆抗體評(píng)價(jià)

4號(hào)免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0融合后經(jīng)陽(yáng)性孔鑒定、3次亞克隆后，篩選出陽(yáng)性率100%、生長(zhǎng)狀態(tài)良好且效價(jià)最高的細(xì)胞株2d-3 F12株，將該株細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后腹腔注射小鼠、收集單抗腹水。運(yùn)用間接ELISA測(cè)定腹水中6-FAM單克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果見表5，效價(jià)達(dá)到1∶1 280 000。

表5 免疫鼠腹水6-FAM單克隆抗體效價(jià)

抗體亞型測(cè)定的結(jié)果見表6。鑒定結(jié)果表明：6-FAM單克隆抗體的重鏈為IgG2a型，輕鏈為Kappa型。

表6 6-FAM單克隆抗體亞型鑒定

腹水抗體使用Protein G瓊脂糖抗體純化柱純化，測(cè)定純化抗體濃度為0.954 mg/mL。純化抗體以1∶320倍稀釋后濃度為1.99×10-8mol/L，將其倍比稀釋至1.52×10-13mol/L，共18個(gè)濃度梯度，進(jìn)行親和力測(cè)定，繪制親和力曲線，見圖5。通過(guò)公式計(jì)算出該株細(xì)胞所分泌的抗體的親和力常數(shù)為5.38×109L/mol，其介于107～1012L/mol之間，屬于高親和力抗體。

cAg單位為μg·mL。

2.4 膠體金與6-FAM純化單抗最佳標(biāo)記條件

用高濃度NaCl破壞試驗(yàn)分別考察了膠體金與6-FAM純化單抗的最佳標(biāo)記pH值和最佳抗體標(biāo)記量。如圖6所示，當(dāng)標(biāo)記pH<7.0時(shí)，金標(biāo)液變淺；當(dāng)標(biāo)記pH>8.0時(shí)，金標(biāo)液變紫，金顆粒粒徑增大或發(fā)生了金顆粒的聚集。由于制備金標(biāo)抗體時(shí)加入封閉液(10% BSA)后會(huì)使金標(biāo)液的pH值降低，通過(guò)試驗(yàn)確定了pH=8.0時(shí)標(biāo)記效果更好，因此最佳標(biāo)記pH值為8.0。

圖6 膠體金與6-FAM純化單抗最佳標(biāo)記pH值優(yōu)化結(jié)果

如圖7所示：當(dāng)6-FAM單抗標(biāo)記量<10 μg/mL膠體金時(shí)，金標(biāo)液變紫甚至變灰；標(biāo)記量≥10 μg/mL膠體金時(shí)，金標(biāo)液均呈鮮亮的紅色；因此以12 μg/mL膠體金(在最低標(biāo)記量10 μg/mL膠體金的基礎(chǔ)上增加20%[10])為最佳抗體標(biāo)記量。

圖7 膠體金與6-FAM純化單抗最佳抗體標(biāo)記量?jī)?yōu)化結(jié)果

2.5 膠體金膠體金免疫層析試紙條鏈霉親和素線最佳包被緩沖液

理論上模擬陽(yáng)性樣本的T線和C線均為紅色條帶。模擬陰性樣本僅C線呈紅色，圖8中T線包被液優(yōu)化結(jié)果顯示，使用包被液Ⅰ、Ⅳ的T線均較淺，包被液Ⅲ的T線肉眼不可見，而包被液Ⅱ所對(duì)應(yīng)的T線條帶最為清晰，因此，包被液Ⅱ?yàn)樽罴训陌痪彌_液。

+為陽(yáng)性樣本，-為陰性結(jié)果；下同。

2.6 膠體金免疫層析試紙條對(duì)RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)的可用性試驗(yàn)

同上，陽(yáng)性樣本的GICS結(jié)果能觀察到紅色的T線和C線，陰性樣本的GICS結(jié)果僅能觀察到紅色的C線，其他情況則說(shuō)明結(jié)果不可靠。如圖9所示：使用層析液B和C均能使陽(yáng)性樣本的GICS結(jié)果呈陽(yáng)性、陰性樣本的GICS結(jié)果呈陰性；相同時(shí)間下層析液C對(duì)應(yīng)的SA條帶最明顯；而陰性樣本使用層析液A結(jié)果呈假陽(yáng)性。因此，以層析液C為最佳層析液。

圖9 最佳層析液確定

確立最佳層析液后，對(duì)T線包被濃度進(jìn)行了優(yōu)化，見圖10。當(dāng)SA包被濃度為0.5 mg/mL時(shí)，條帶較淺，隨著濃度升高，條帶顏色加深。包被濃度為1 mg/mL和1.5 mg/mL時(shí)，肉眼觀察它們的條帶顏色無(wú)明顯差別，為降低成本，以1 mg/mL為最佳T線包被濃度。

圖10 最佳T線包被濃度確定

在1 mg/mL T線最佳包被濃度下，又先后優(yōu)化了反應(yīng)產(chǎn)物用量及金標(biāo)抗體用量2個(gè)條件。如圖11所示：不同反應(yīng)產(chǎn)物用量均能觀察到較為清晰的條帶，2 μL的條帶色度<5 μL的條帶色度，約等于8 μL的條帶色度。金標(biāo)抗體用量同樣考察了3個(gè)梯度，結(jié)果如圖12。加入5 μL金標(biāo)抗體時(shí)，C線條帶較淺；加入15 μL金標(biāo)抗體時(shí)，背景顏色略深，而加入10 μL金標(biāo)抗體時(shí)背景顏色淺且條帶清晰，易于觀察。最終選擇最佳反應(yīng)產(chǎn)物用量為5 μL、最佳金標(biāo)抗體用量為10 μL。

圖11 最佳RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物用量確定

圖12 最佳金標(biāo)抗體用量確定

條件優(yōu)化后，使用T線和羊抗鼠IgG線均為1 mg/mL包被的試紙條，以5 μL最佳反應(yīng)產(chǎn)物用量、10 μL最佳金標(biāo)抗體用量，使用自主研發(fā)的試紙條檢測(cè)不同拷貝數(shù)模板的RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物，并與商品化試紙條的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖13。兩者對(duì)RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物可視化判定的結(jié)果一致，條帶清晰易判定，即質(zhì)粒模板的每微升拷貝數(shù)≥1時(shí)，T線有明顯的條帶呈陽(yáng)性，每微升拷貝數(shù)<1時(shí)，T線無(wú)條帶呈現(xiàn)，且以超純水為模板的陰性樣本T線無(wú)條帶呈陰性，與理論相符。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的派氏異尖線蟲RPA nfo-自制的GICS相配套的檢測(cè)方法的靈敏度為每微比拷貝數(shù)≥1，與RPA nfo-GICS(商品化)的檢測(cè)靈敏度相同，自主研發(fā)的試紙條能替代商品化試紙條實(shí)現(xiàn)對(duì)RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果可視化。

圖13 自主研發(fā)試紙條與商品化試紙條RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物可視化結(jié)果對(duì)比

3 討論

本研究在6-FAM單克隆抗體制備的基礎(chǔ)上，分別利用6-FAM與6-FAM單抗、生物素與鏈霉親和素[11]之間的特異性結(jié)合作用，研制了能檢測(cè)RPA nfo反應(yīng)產(chǎn)物的膠體金免疫層析試紙條。由于6-FAM是小分子半抗原，不具有免疫原性，需要連接載體蛋白形成完全抗原后才能在免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[12]。由于6-FAM修飾核酸的方式通常是在DNA與6-FAM的6-COOH之間形成六個(gè)或十二個(gè)碳的“間隔臂”[13]，本文運(yùn)用活性酯法制備的完全抗原在6-FAM與BSA或OVA之間偶聯(lián)了六碳的1，2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷，一方面避免了大分子蛋白質(zhì)的空間位阻對(duì)小分子抗原的影響，同時(shí)使完全抗原的結(jié)構(gòu)盡可能與6-FAM標(biāo)記核酸的結(jié)構(gòu)接近，保證所制備的單克隆抗體能準(zhǔn)確識(shí)別其中的6-FAM。少量多次免疫完全免疫原6-FAM-1-BSA的小鼠均獲得了1∶80 000以上的效價(jià)，運(yùn)用雜交瘤法融合免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0，經(jīng)陽(yáng)性孔篩選、亞克隆、擴(kuò)大培養(yǎng)、小鼠誘生腹水等步驟獲取了高親和力6-FAM單克隆抗體，其效價(jià)達(dá)到1∶1 280 000，親和力常數(shù)為5.38×109L/mol，使用該株單抗與膠體金偶聯(lián)制備了金標(biāo)6-FAM單抗，為GICS的開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在實(shí)際核酸樣本檢測(cè)時(shí)，只需要設(shè)計(jì)RPA nfo的上、下游引物及探針，并使用RPA nfo試劑盒和自主研發(fā)的試紙條，就能對(duì)靶基因進(jìn)行快速擴(kuò)增及可視化檢測(cè)[14]。本文使用派氏異尖線蟲ITS區(qū)的上游引物、5′端和3′端分別標(biāo)記6-FAM和C3 Spacer的探針(距離3′端第16個(gè)堿基修飾為dSpacer)及5′端標(biāo)記生物素的下游引物，DNA模板經(jīng)RPA nfo試劑盒反應(yīng)后獲得陽(yáng)性樣本，擴(kuò)增產(chǎn)物兩端帶有6-FAM和生物素。擴(kuò)增產(chǎn)物與金標(biāo)6-FAM單抗混合后形成金標(biāo)6-FAM單抗-(6-FAM-DNA-生物素)復(fù)合物，層析液經(jīng)過(guò)GICS的T線時(shí)，復(fù)合物上的生物素被鏈霉親和素捕獲；繼續(xù)層析時(shí)未反應(yīng)的金標(biāo)6-FAM與C線的羊抗鼠IgG結(jié)合，T線和C線均呈明顯的紅色條帶。使用該試紙條對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行初步檢測(cè)，在上樣后5 min內(nèi)即可肉眼觀察到清晰、明確的檢測(cè)結(jié)果，與商品化試紙條相比，對(duì)陽(yáng)性或陰性反應(yīng)的判定結(jié)果一致，均能檢測(cè)≥1 copy/μL模板的陽(yáng)性樣本，靈敏度高，自主研發(fā)的試紙條能替代商品化試紙條，初步實(shí)現(xiàn)了RPA nfo-GICS的國(guó)產(chǎn)化，為今后繼續(xù)自主研發(fā)RPA nfo試劑盒，建立完整的RPA nfo-GICS體系奠定了基礎(chǔ)。