羔羊不同超排方法的篩選及其對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

劉昱成，王晶晶，張振良，倪建宏，劉長(zhǎng)彬，傅祥偉，石國(guó)慶，萬鵬程*，崔炳燦

(1. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；2. 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；3. 新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 昌吉 831100)

超數(shù)排卵是人為通過外源促性腺激素刺激母畜卵巢，誘發(fā)卵泡發(fā)育，并排出卵子的過程[1]。1～2月齡羔羊的卵巢對(duì)生殖激素非常敏感，卵泡發(fā)育出現(xiàn)閉鎖現(xiàn)象較少[2]。羔羊在自然情況下出生后的前2個(gè)月卵巢生長(zhǎng)較快，羔羊卵巢上的卵泡數(shù)量在1～2月齡時(shí)達(dá)到一個(gè)高峰，隨后逐漸減少，直到33周齡時(shí)卵泡數(shù)量保持不變。通過對(duì)1～2月齡羔羊用外源性促性腺激素誘導(dǎo)，進(jìn)行超數(shù)排卵，平均每只羔羊可獲得80～160個(gè)卵細(xì)胞，約為成年母羊通過超排卵獲得的卵子數(shù)的10倍，而且世代間隔僅為成年羊的1/3，大大加快了羊群的繁殖速度[3]。

羔羊的卵巢上沒有優(yōu)勢(shì)卵泡化的發(fā)生，卵泡發(fā)育數(shù)量不受出生季節(jié)和體重影響[4]。通過利用激素誘導(dǎo)羔羊進(jìn)行超數(shù)排卵，可以提高卵母細(xì)胞生產(chǎn)效率，挖掘優(yōu)秀個(gè)體的遺傳潛能，提高綿羔羊優(yōu)良品種的繁殖性，促進(jìn)育種及保種的工作[5]。

使用不同的激素產(chǎn)生不同的超排效果，主要以孕馬血清促性腺激素(PMSG)、黃體生成素(LH)、促卵泡素(FSH)為主。閆文龍等[6]采用FSH+LH激素方案對(duì)山羊進(jìn)行超排，超排效果顯著。吳海鳳等[7]對(duì)6月齡的高山細(xì)毛羊進(jìn)行超數(shù)排卵，F(xiàn)SH+PMSG方案獲得發(fā)育卵泡數(shù)顯著高于采用FSH+LH方案。陳童等[8]采用FSH+PMSG方案對(duì)4～9周齡的超細(xì)型澳洲美利奴進(jìn)行超數(shù)排卵，超排效果優(yōu)于不注射PMSG。應(yīng)用超排卵技術(shù)改善激素的內(nèi)源性分泌，提高幼畜生產(chǎn)力，縮短世代間隔、加速育種進(jìn)程，目前已經(jīng)取得了一定的成果[9]。

本試驗(yàn)通過不同超排方案的篩選，探究不同超排方法對(duì)綿羔羊卵巢的反應(yīng)性、卵巢的大小及卵母細(xì)胞體外成熟的影響，優(yōu)化和完善幼畜超排方法，探索綿羔羊適宜的超排方案，穩(wěn)定綿羔羊超排效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和耗材

M199培養(yǎng)基(購(gòu)于美國(guó)Sigma-aldrich化學(xué)試劑公司，Gibco-31100-03)，激素PMSG(寧波三生生物科技有限公司，規(guī)格1 000 U)，F(xiàn)SH(寧波第二激素廠，規(guī)格1 000 U)；其他化學(xué)品均購(gòu)自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO，USA)。四孔板(NUNC公司，109199)。

1.2 體外培養(yǎng)及超排試劑配制

發(fā)情羊血清：抽取50 mL發(fā)情母羊血液，析出血清移入15 mL離心管，6 000g離心10～15 min，吸上清液移入新管，56 ℃水浴30 min，過濾分裝，-20 ℃保存。

洗卵液：2.375 g M199粉末、0.55 g NaHCO3、12.5 mg慶大霉素、25 mg肝素鈉、250 mg牛血清白蛋白(BSA)-V，用Mill-Q H2O定容至250 mL，0.22 μm濾器過濾，4 ℃保存，1個(gè)月用完。

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液：970 mg M199粉末、220 mg NaHCO3、10 mg慶大霉素、100 μL Mill-Q H2O，用0.22 μm濾器過濾，4 ℃保存，2個(gè)月用完。

卵母細(xì)胞體外成熟液：47 mg HEPES(鹽)、4 mg丙酮酸鈉(鹽)、18 mL基礎(chǔ)母液、2 mL發(fā)情羊血清，20 μL FSH(10萬U)，20 μL LH(10萬U)，20 μL雌二醇(E2，0.000 1 g)；用0.22 μm濾器過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用，4 ℃ 保存，2個(gè)星期用完。

微滴受精(SOF)液：0.2 μmol/L青霉胺+0.1 μmol/L亞牛磺酸+10 μg/mL肝素+ 10% 發(fā)情綿羊血清。

體外培養(yǎng)液(IVC)：含有2%必需氨基酸(BME)，1%非必需氨基酸(MEM)，0.1 mmol/L谷氨酰胺，0.5 mg/mL Mys-肌醇和0.8% 的SOF培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

紫泥泉種羊場(chǎng)1～2月齡美利奴細(xì)毛羊母羔12只，體重8.65～12.5 kg，試驗(yàn)羊分為3組，每組4只。其中方案Ⅰ和方案Ⅱ組(見表1)注射激素為試驗(yàn)超排組，另一組為對(duì)照組，未注射激素。

表1 超排方案

1.4 超排方案

12 h后進(jìn)行活體采卵。先用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組羔羊的卵巢長(zhǎng)軸直徑大小，采集卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率。

1.5 卵母細(xì)胞采集

采用常規(guī)手術(shù)法活體采集卵母細(xì)胞，試驗(yàn)前用0.02 mg/kg的靜松靈麻醉，仰臥保定，手術(shù)部位局部先碘伏后酒精消毒后，切開腹部，用食指和中指將卵巢牽引到腹腔外。

用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵巢表面可見卵泡的直徑，觀察兩側(cè)卵巢上的可用卵泡數(shù)，裝有2～3 mL采卵液的一次性注射器吸取直徑>2 mm卵泡的卵泡液，將吸取的卵泡液收集在預(yù)先加入3～5 mL采卵液的培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。采集形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，并記錄每只羔羊獲得的可用卵母細(xì)胞數(shù)。

卵母細(xì)胞采集完成后，用37 ℃生理鹽水沖洗卵巢防止粘連。手術(shù)結(jié)束后，進(jìn)行術(shù)后縫合，傷口處涂抹紅霉素，并注射青霉素及地塞米松。

1.6 體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞

檢出胞質(zhì)均勻、卵丘細(xì)胞3層或3層以上的COCs，用提前預(yù)熱的洗卵液洗3次，成熟液洗2次。采用100 μL培養(yǎng)滴培養(yǎng)，每個(gè)液滴放入16～22枚卵母細(xì)胞，并在培養(yǎng)皿中覆蓋石蠟油，在5% CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，38.5 ℃培養(yǎng)24 h。

1.7 卵母細(xì)胞的成熟鑒定

成熟培養(yǎng)結(jié)束后，將卵母細(xì)胞放入0.1%的透明質(zhì)酸酶中，反復(fù)吹打卵母細(xì)胞，直至將卵母細(xì)胞吹打干凈，完全除去卵丘細(xì)胞。將干凈的卵母細(xì)胞放入洗卵液中洗滌干凈，撥動(dòng)卵母細(xì)胞，觀察極體，每組重復(fù)3次，每組卵母細(xì)胞數(shù)>30枚，記錄排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量。

1.8 體外受精

卵母細(xì)胞成熟后，將每組30個(gè)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到40 μL SOF的受精微滴中。冷凍-解凍的精液來自單一的公羊。用10 mL HEPES-TALP培養(yǎng)基沖洗精子2次，并通過以1 000g沉淀離心10 min。然后在室溫下將精子重懸于0.6～0.8 mL的HEPES-TALP培養(yǎng)基中。棄去上清液后，將精子沉淀重新懸浮在獲能培養(yǎng)基中，并再次洗滌。在HSOF(添加HEPES的SOF)中將精子稀釋至5×106個(gè)精子/mL。 然后，將10 μL過濾的精子懸浮液加入到每個(gè)IVF滴中，以產(chǎn)生1×106～2×106個(gè)/mL的最終精子濃度。將精子和成熟的卵母細(xì)胞在38.5 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.9 胚胎體外發(fā)育

體外培養(yǎng)后，通過溫和移液將卵丘細(xì)胞洗掉，收集卵母細(xì)胞。然后用IVC培養(yǎng)基洗滌卵母細(xì)胞2次并移入50 μL液滴(15～20個(gè)卵/滴)的IVC培養(yǎng)基中，在38.5 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，根據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)估胚胎發(fā)育，評(píng)估并統(tǒng)計(jì)卵裂率。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超排方案對(duì)羔羊卵巢卵泡發(fā)育的影響

如表2所示，對(duì)照組羔羊卵巢無反應(yīng)；方案Ⅱ的發(fā)育卵泡數(shù)(直徑>2 mm)為348.00±8.25，顯著高于方案Ⅰ的發(fā)育卵泡數(shù)(265.00±6.32)，P<0.05；方案Ⅱ采卵數(shù)(282.00±11.63)顯著高于方案Ⅰ采卵數(shù)(200.00±12.45)，P<0.05。結(jié)果表明：方案Ⅰ、Ⅱ均能獲得較多的可用卵泡數(shù)及可用卵母細(xì)胞，且方案Ⅱ的超排效果顯著高于方案Ⅰ。

表2 不同處理方法對(duì)卵巢反應(yīng)性的影響

2.2 不同處理方法對(duì)羔羊卵巢大小的影響

羔羊超排后兩側(cè)卵巢上均清晰可見多個(gè)卵泡，表明超排效果良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。精確測(cè)量羔羊左右側(cè)卵巢的長(zhǎng)軸直徑，對(duì)羔羊卵巢大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可見，方案Ⅰ和Ⅱ組的羔羊左右側(cè)卵巢的直徑與對(duì)照組羔羊相比差異顯著(P<0.05)，而2個(gè)方案組間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同超排方案對(duì)羔羊卵母細(xì)胞成熟的影響

觀察卵母細(xì)胞形態(tài)正常，卵丘細(xì)胞清晰可見，對(duì)可用卵母細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見圖1、圖2、圖3。

圖1 羔羊體外未成熟卵母細(xì)胞

圖2 羔羊體外成熟卵母細(xì)胞

箭頭：囊胚；三角：桑葚胚。

體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞24～26 h后，方案Ⅰ卵母細(xì)胞的體外成熟率(32.20±3.45)%顯著低于方案Ⅱ卵母細(xì)胞的體外成熟率(45.40±4.33)%，P<0.05；方案Ⅰ和方案Ⅱ的卵母細(xì)胞數(shù)、第一極體釋放數(shù)、卵裂率均無明顯差異，P>0.05(表4)。

表4 不同的超排處理方法對(duì)羔羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

3 討論

3.1 不同超排方案對(duì)羔羊卵巢的影響

幼畜超排胚胎移植技術(shù)(JIVET)技術(shù)體系的基礎(chǔ)是通過促性腺激素對(duì)幼畜進(jìn)行超排，使幼畜卵巢中的卵泡發(fā)育從而獲得大量的卵母細(xì)胞。常用超排方法是利用促性腺激素FSH、PMSG和LH誘導(dǎo)幼畜卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育[10]。

幼畜超排的激素量一般參照成年羊超排方案：多次注射FSH或者單次注射馬絨毛膜促性腺激素(eCG)，具體促性腺激素劑量根據(jù)年齡、品種、體重等而制定。Currin等[11]在犢牛超數(shù)排卵研究中認(rèn)為，6次×12 h間隔、共72 h 長(zhǎng)時(shí)效 FSH方案的大卵泡比率、優(yōu)質(zhì)COCs比率和囊胚率均顯著優(yōu)于3次×12 h 間隔、共36 h短時(shí)效方案。Mao等[12]采用PMSG 處理5～8周齡羔羊，超數(shù)排卵后的卵母細(xì)胞數(shù)量顯著高于10周齡羔羊。秦雪等[13]用FSH+PMSG方案獲得發(fā)育卵泡數(shù)顯著高于FSH+LH方案。

魯彥等[14]發(fā)現(xiàn)，采用加拿大生產(chǎn)的激素對(duì)新疆細(xì)毛羊羔羊的超排效果，與寧波生產(chǎn)的激素超排效果差異不顯著，超排處理均達(dá)到較好效果[15-16]。本試驗(yàn)采用國(guó)產(chǎn)寧波激素進(jìn)行羔羊超排，通過不斷優(yōu)化超排效果，達(dá)到了比較穩(wěn)定且較好的效果。

張興會(huì)等[17]采用不同國(guó)家生產(chǎn)、不同劑量的FSH，并用4種超排方案對(duì)以遼寧絨山羊進(jìn)行超數(shù)排卵，發(fā)現(xiàn)3次注射FSH 40 mg、1次注射PMSG 400 U效果最好。Kelly等[18]對(duì)9周齡的羔羊分4次注射FSH的超排效果要優(yōu)于1次注射FSH的效果。與本試驗(yàn)中分3 d注射FSH，并配合PMSG使用的效果優(yōu)于分2 d注射FSH結(jié)果一致，超排反應(yīng)好的羔羊卵巢直徑顯著大于無反應(yīng)的羔羊卵巢直徑，更利于生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行操作。

3.2 不同超排方案對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響

Morton等[19]通過超排30～40日齡的羔羊只均得到(86.2±7.9)枚卵母細(xì)胞。Ptakt等[20]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1月齡羔羊放置孕酮栓8 d后撤栓，在5～7 d連續(xù)3 d中，每天注射2次FSH，獲得卵母細(xì)胞平均29只。胡鵬飛等[21]利用促性腺激素超排2月齡的雜種羊后，平均獲得15枚卵母細(xì)胞。本試驗(yàn)用4～8周齡羔羊超數(shù)排卵后，試驗(yàn)組卵巢體積顯著增大，卵泡數(shù)量顯著增加，而對(duì)照組羔羊卵巢體積很小，看不到發(fā)育卵泡分布。為進(jìn)一步探明超排處理方法對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響，本研究將兩種超排方案得到的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，試驗(yàn)組均獲得了較好的成熟率(32.2% &45.4%)，表明羔羊超排卵泡卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，大部分的卵子可以發(fā)育成為成熟卵母細(xì)胞。吳海鳳[5]采用FSH+LH 超排方案的卵裂率顯著高于FSH+PMSG方案的卵裂率，與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異。激素超排效果受廠家、批次和超排方案的影響，同時(shí)不同羔羊?qū)に卮碳さ姆磻?yīng)都存在相當(dāng)大的差異，常出現(xiàn)個(gè)體對(duì)激素誘導(dǎo)無任何反應(yīng)現(xiàn)象。激素刺激方式對(duì)刺激反應(yīng)變化的影響尚不清楚，但總體效果上以連續(xù)3 d注射FSH方案效果最優(yōu)。

4 結(jié)論

幼畜超排技術(shù)的應(yīng)用可以提高綿羊生產(chǎn)效益，為我國(guó)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供助力。由于對(duì)激素刺激機(jī)制的進(jìn)一步研究改進(jìn)，以及對(duì)成年和青春期前動(dòng)物卵母細(xì)胞之間差異的進(jìn)一步了解，JIVET效率的持續(xù)提高將促進(jìn)該技術(shù)走向商業(yè)化。