“益氣健脾方”對肝郁脾虛型慢加急性肝衰竭患者臨床療效及外周血中性粒細胞功能的影響
——附31例臨床資料

趙 強 王 希 趙 容 陳小妹 梁重鋒 譚善忠

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院，江蘇南京 210003）

慢加急性肝衰竭（acute on chronic liver failure，ACLF）是在慢性肝?。ㄈ缏砸倚透窝撞《靖腥净蚓凭愿窝祝┗A(chǔ)上因急性肝代謝失調(diào)導(dǎo)致的一種危急癥候群，易發(fā)生多器官功能衰竭[1]。ACLF發(fā)病迅速，病情較為嚴重，且并發(fā)癥較多，具有極高的死亡率。ACLF發(fā)生發(fā)展過程中，外周血中性粒細胞百分比增加，但其吞噬功能卻顯著降低，形成中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的能力增強，此現(xiàn)象在預(yù)后不良的ACLF患者中尤為明顯[2]。NETs是以DNA為骨架，嵌有各種殺菌蛋白如組蛋白Histone H3的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，Histone H3是真核生物體細胞中的一種堿性蛋白質(zhì)組分，其和DNA共同組成核小體結(jié)構(gòu)，在DNA修復(fù)、復(fù)制和維持染色體穩(wěn)定性中發(fā)揮核心作用[3]，而NETs的過度生成是造成肝臟損傷的重要原因[4]。

近年來，中醫(yī)藥治療ACLF的臨床研究日益增多，中西醫(yī)結(jié)合治療方案在改善ACLF患者臨床癥狀，促進肝功能恢復(fù)，提高生存率等方面優(yōu)勢漸顯[5]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎（以下簡稱乙肝）病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）以正虛為主要病機特點，在內(nèi)科綜合用藥基礎(chǔ)上加用具有補氣健脾、利濕退黃功效的益氣健脾方能明顯減輕該類患者肝損傷程度，且能提升外周血淋巴細胞百分比以恢復(fù)免疫功能，進而改善預(yù)后[6]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上進一步觀察了聯(lián)合用藥對HBV-ACLF肝郁脾虛證患者總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平、凝血酶原活動度（prothrombin time activity，PTA）及中性粒細胞百分比等的影響，并基于中性粒細胞功能調(diào)控探索益氣健脾方的藥理作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2016年4月至2022年12月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科收治的基礎(chǔ)病變?yōu)槁砸腋位蚋斡不冶鏋楦斡羝⑻撟C的ACLF患者65例，按隨機數(shù)字表法隨機分為治療組31例與對照組34例。治療組男21例，女10例；年齡44～69歲，平均年齡（52.43±13.92）歲；平均病程（16.32±4.40）d。對照組男22例，女12例；年齡37～60歲，平均年齡（50.84±12.31）歲；平均病程（15.58±5.81）d。2組患者性別、年齡、病程等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會批準（批號：2015-ly-ky030，2017-ly-kt015）。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 參照《乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭診斷與預(yù)后評估的中國標準》[7]中HBVACLF的診斷標準制定：極度乏力，并有明顯厭食、嘔吐和腹脹等嚴重消化道癥狀；黃疸進行性加深，TBIL≥171 μmol/L或每日上升≥17.1 μmol/L；有出血傾向，30%＜PTA≤40%，或1.5＜國際標準化比值（INR）＜1.9；排除肝性腦病或其他并發(fā)癥。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 參照《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準（2017年版）》[8]擬定HBV-ACLF肝郁脾虛證辨證標準：脅肋脹痛，腹脹或便溏，情志抑郁，身倦乏力，舌質(zhì)淡有齒痕、苔白或白膩，脈弦細。

1.3 納入標準 符合HBV-ACLF西醫(yī)診斷標準及肝郁脾虛證中醫(yī)辨證標準；年齡18～70歲，男女不限；半年內(nèi)未使用免疫抑制劑；自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 急性肝衰竭、亞急性肝衰竭，或B超/CT等影像檢查提示有肝癌者；有明顯腹水、消化道及其他器官出血傾向者；肝腎綜合征、肝性腦病者；細菌或真菌感染者；妊娠或哺乳期婦女；有精神疾病者。

2 治療方法

2.1 對照組 予內(nèi)科綜合用藥：丁二磺酸腺苷蛋氨酸（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號82302041A，規(guī)格0.5 g/支），2.0 g/d，靜脈滴注；異甘草酸鎂注射液（正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，批號221212104，規(guī)格50 mg/支），200 mg/d，靜脈滴注；HBV-DNA陽性者予恩替卡韋（北京百奧藥業(yè)有限責任公司，批號A25421210，規(guī)格0.5 mg/片），0.5 mg/d，口服。

2.2 治療組 在對照組治療基礎(chǔ)上加用中藥湯劑益氣健脾方口服，基本方藥物組成：炙黃芪30 g，太子參30 g，炒白術(shù)30 g，陳皮10 g，當歸10 g，茯苓10 g，酒女貞子10 g，酒黃芩10 g，炙甘草3 g。隨證加減：濕偏重者，加茵陳30 g、生大黃10 g、虎杖15 g；熱偏重者，加金錢草30 g、赤芍15 g、梔子8 g。中藥湯劑由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院中藥房提供。每日1劑，水煎200 mL，分早晚飯后溫服。

2組均連續(xù)治療4周。

3 療效觀察

3.1 觀察指標

3.1.1 肝功能指標和中性粒細胞百分比 于治療前和治療2周、4周后采集2組患者晨起空腹靜脈血5 mL，采用全自動生化分析儀（雅培，型號：C8000）檢測TBIL、PTA水平；采用血細胞分析儀（Mindray，型號：BC-20）檢測中性粒細胞百分比。

3.1.2 中性粒細胞Histone H3蛋白水平 于治療前隨機提取6例患者（治療組、對照組各3例）晨起空腹靜脈血中性粒細胞樣本，參考前期研究方法[9]，使用濃度分別為0.1、0.2、0.4 mg/mL的益氣健脾方藥液對中性粒細胞樣本進行培養(yǎng)。前期研究表明，濃度在0.8 mg/mL以上的益氣健脾方藥液會對細胞產(chǎn)生毒性，因此本研究所選濃度在安全范圍[9]。將中性粒細胞樣本隨機分為4組，分別為益氣健脾方低、中、高劑量組和空白對照組，每組樣本數(shù)為3，加相應(yīng)濃度的益氣健脾方藥液和生理鹽水培養(yǎng)24 h后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測各組中性粒細胞Histone H3蛋白水平。運用Image Lab 6.0.1軟件分析條帶灰度值。

3.2 療效判定標準 治療4周后判定2組患者臨床療效，療效標準參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[10]擬定。臨床治愈：癥狀消失或基本消失，肝功能指標正?；蜉p微異常（TBIL≤34 μmol/L或PTA≥40%）；顯效：癥狀明顯減輕，肝功能指標明顯好轉(zhuǎn)（TBIL較治療前下降50%以上或PTA較治療前提高50%以上），且穩(wěn)定在2周以上，無明顯波動者；有效：癥狀有所改善，肝功能有所好轉(zhuǎn)（TBIL較治療前下降25%以上，或PTA較治療前提高25%以上），且穩(wěn)定在2周以上，無明顯波動者；無效：癥狀無改善，TBIL、PTA無恢復(fù)甚至加重，或病情繼續(xù)惡化。總有效率（%）=[（臨床治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)]×100%。

3.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。本研究計量資料均符合正態(tài)分布，用均值±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以例或百分比表示，率的比較采用Fisher確切概率法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 治療結(jié)果

3.4.1 2組患者臨床療效比較 治療后治療組臨床總有效率為67.74%，對照組為52.94%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 治療組與對照組患者臨床療效比較

3.4.2 2組患者治療前及治療2周、4周后中性粒細胞百分比、肝功能指標比較 治療前2組患者TBIL水平、PTA、中性粒細胞百分比比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療2周后，治療組患者TBIL較治療前改變并不明顯，對照組反而有上升趨勢。治療4周后，治療組患者TBIL水平較本組治療前、本組治療2周后明顯降低（P＜0.05），也明顯低于同期對照組（P＜0.05）；而對照組TBIL水平明顯低于本組治療2周后（P＜0.05）。治療2周后，治療組患者PTA較本組治療前明顯升高（P＜0.05），也顯著高于同期對照組（P＜0.05），對照組此指標與本組治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療4周后，2組患者PTA均明顯高于本組治療前（P＜0.05），治療組明顯高于同期對照組（P＜0.05）。治療2周后，2組患者中性粒細胞百分比與本組治療前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療4周后，2組患者中性粒細胞百分比均明顯低于本組治療前和治療2周后（P＜0.05），治療組明顯低于同期對照組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 治療組與對照組患者治療前及治療2周、4周后中性粒細胞百分比和肝功能指標比較（x-±s）

3.4.3 經(jīng)不同濃度藥物干預(yù)后中性粒細胞Histone H3蛋白相對表達量比較 益氣健脾方中、高劑量組中性粒細胞Histone H3蛋白相對表達量明顯低于空白對照組（P＜0.05），其中益氣健脾方高劑量組Histone H3蛋白相對表達量明顯低于低劑量組（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組中性粒細胞Histone H3 蛋白電泳圖

表3 各組中性粒細胞Histone H3 蛋白水平比較（x-±s）

4 討論

ACLF患者在發(fā)病初期即出現(xiàn)嚴重的肝功能障礙，中性粒細胞最先被招募至損傷部位，但中性粒細胞的核心功能發(fā)生缺陷，即吞噬作用和脫顆粒作用下降，而產(chǎn)生NETs的能力增強，加重了ACLF患者肝損傷[11]。活化的免疫細胞功能耗竭，代償性抗炎應(yīng)答存在缺陷，導(dǎo)致病情進展迅速，病死率高。因此，有效改善患者的免疫抑制狀態(tài)是阻止ACLF進展的關(guān)鍵。目前尚無針對ACLF的特異性治療方法，主要采用內(nèi)科綜合支持治療、人工肝治療或肝移植，肝移植是目前治療ACLF最有效的方法，但因供肝緊缺、術(shù)后需長期使用抑制劑等因素，臨床應(yīng)用受到很大限制。

根據(jù)ACLF臨床表現(xiàn)，可將其歸于中醫(yī)學(xué)“黃疸”“急黃”“肝瘟”等范疇[12]。本病病理因素包括毒、熱、濕、虛、瘀等，病性屬正虛邪實，病位在肝、腎、脾。HBV-ACLF是在慢性乙肝或肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的嚴重肝臟損害，病程較長。久病必虛，因虛致實，故本病以本虛標實為主要證候特點[13-14]。筆者團隊發(fā)現(xiàn)，本病之虛以氣虛、血虛為多，實以濕邪為主，瘀為主要兼證，加之病程較長，正氣耗傷嚴重，故而正虛之象尤為明顯?！耙姼沃?，知肝傳脾，當先實脾”，針對HBV-ACLF本虛標實的證候要點，我們法以益氣養(yǎng)肝、健脾補血治其本，清熱利濕、理氣疏肝治其標，運用益氣健脾方標本兼治，臨床取效良好。益氣健脾方化裁自當歸補血湯和四君子湯，方中重用炙黃芪益氣健脾，太子參補氣健脾兼可生津，與黃芪相伍增益氣養(yǎng)陰之功，共為君藥；當歸養(yǎng)血活血，與黃芪配伍取當歸補血湯之意，補氣以生血，酒女貞子滋補肝腎陰精，共為臣藥；佐以炒白術(shù)、茯苓、陳皮、酒黃芩等健脾藥，兼清熱利濕、理氣疏肝；炙甘草調(diào)和諸藥為使。藥理研究表明，黃芪可通過降低血小板黏附性、抑制血小板聚集從而改變血液流變性，同時具有保護血管內(nèi)皮細胞、抗肝纖維化等藥理作用[15-16]。

TBIL和PTA是預(yù)測和判定ACLF病情程度和療效評價的重要指標，TBIL升高表明肝臟出現(xiàn)病變或者膽管阻塞，導(dǎo)致肝臟代謝功能下降，大量的膽紅素聚集肝臟，嚴重時可引起肝衰竭和多臟器功能衰竭[17]；而PTA是反映肝臟損害的特異性指標，PTA≤40%是診斷ACLF的重要依據(jù)，且PTA越低預(yù)示預(yù)后越差[18]。本研究結(jié)果顯示，2 種治療方案均能明顯改善HBV-ACLF患者PTA、TBIL水平，聯(lián)合治療方案改善效果更明顯，且在治療2 周時已有效果顯現(xiàn)。本研究也觀察了不同濃度益氣健脾方體外干預(yù)對HBV-ACLF患者中性粒細胞Histone H3蛋白相對表達量的影響，結(jié)果表明，在安全濃度范圍內(nèi)的益氣健脾方藥液能明顯降低HBV-ACLF患者中性粒細胞Histone H3蛋白水平，間接抑制NETs的生成，其抑制能力隨著藥物濃度的增加呈上升趨勢，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

綜上所述，在內(nèi)科綜合用藥基礎(chǔ)上加用益氣健脾方能顯著提高HBV-ACLF患者的臨床療效，減輕肝損傷，其機制可能與抑制中性粒細胞Histone H3的表達從而降低NETs的生成有關(guān)。我們將繼續(xù)收集病例進行臨床研究，增加療效指標以驗證益氣健脾方治療HBV-ACLF的有效性，同時進行分子生物學(xué)實驗以探索ACLF發(fā)生時中性粒細胞的變化與肝細胞損傷之間的內(nèi)在聯(lián)系，為建立和完善益氣健脾方對HBV-ACLF患者中性粒細胞干預(yù)作用的循證醫(yī)學(xué)提供更多的科學(xué)證據(jù)。