清熱涼血復(fù)方防治大腸桿菌對(duì)緊密連接ZO-1蛋白造成的損傷

鄧 倩,王奕凱,張思邈,尉嘯涵,郭大偉,劉曉曄,*,董 虹,*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥) 北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京102206;2.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心,北京 102206)

大腸桿菌是臨床上最常見(jiàn)的一種革蘭陰性菌,能引起多種動(dòng)物病理性感染[1]。有研究表明,大腸桿菌可以引起家禽群的局部或全身感染以及引起全身性急性奶牛乳房炎,能夠破壞仔豬腸道屏障進(jìn)而降低斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能,同時(shí)也是引起人類腹瀉的主要原因之一[2-5]。因此,大腸桿菌感染給養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生命安全威脅。

大腸桿菌可以損傷腸道屏障,ZO-1經(jīng)常被用于評(píng)估腸道屏障的損傷程度,也是腸道屏障緊密連接的一個(gè)主要標(biāo)記蛋白[6-7],起著維持整個(gè)細(xì)胞通透性的作用[8-9]。當(dāng)ZO-1表達(dá)降低時(shí),提示細(xì)胞屏障可能遭到破壞,與此同時(shí),細(xì)菌和細(xì)菌毒力因子也更容易進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)造成進(jìn)一步的損傷。所以,當(dāng)受到大腸桿菌感染時(shí),恢復(fù)ZO-1的正常表達(dá)對(duì)腸道屏障功能至關(guān)重要。

清熱涼血方是由2味及2味以上單味藥組成的方劑,廣泛的作用靶點(diǎn)是相比于其他藥物所具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)之一[10-11]。清熱涼血方講究的是“扶正”和“祛邪”,一方面可以通過(guò)靶向細(xì)菌產(chǎn)生抗菌作用,同時(shí)也可以通過(guò)靶向宿主產(chǎn)生抗菌作用,雙效齊下,恢復(fù)機(jī)體陰陽(yáng)平衡[12]。清熱涼血方是否可以防治大腸桿菌引起的緊密連接ZO-1蛋白損傷目前尚不清楚。

本研究探究清熱涼血方對(duì)大腸桿菌的直接抑菌作用以及大腸桿菌對(duì)緊密連接ZO-1蛋白損傷的防治作用。此外,還進(jìn)一步檢測(cè)了清熱涼血方中含有的有效活性成分,為下一步對(duì)清熱涼血方抗菌的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌和細(xì)胞大腸桿菌(ATCC25922)和IPEC-J2均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室自行凍存。所有細(xì)胞和細(xì)菌均在含有5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

A.白頭翁湯;B.牛角地黃湯;C.清營(yíng)湯;D.清瘟敗毒飲

A.清熱涼血方預(yù)防處理后ZO-1表達(dá)變化;B.清熱涼血方治療處理后ZO-1表達(dá)變化。 ns.P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01。下同

A.細(xì)胞熒光拍攝結(jié)果;B.ZO-1蛋白熒光強(qiáng)度量化

1.2 主要試劑及藥材改良馬丁培養(yǎng)基(生產(chǎn)批號(hào):02-037)購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;硝酸鋁(貨號(hào):A800886)、三氯化鐵(貨號(hào):I811935)、苯酚(貨號(hào):P815401)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;ZO-1 Monoclonal Antibody(貨號(hào):339188)購(gòu)自ThermoFisher公司;2xReal-time PCR Super Mix(貨號(hào):MF013-01)購(gòu)自北京聚合酶生物科技有限公司;白頭翁(生產(chǎn)批號(hào):20201223)、黃連(生產(chǎn)批號(hào):2105202)、黃柏(生產(chǎn)批號(hào):210505001)、生地(生產(chǎn)批號(hào):B7291411)、水牛角(生產(chǎn)批號(hào):B8051441)、甘草(生產(chǎn)批號(hào):200516)購(gòu)自北京同仁堂。

1.3 清熱涼血方水提液制備制備4付清熱涼血方水提液。4付清熱涼血方組成如圖1所示,白頭翁湯:白頭翁6 g、黃連9 g、黃柏9 g、秦皮9 g;牛角地黃湯:水牛角30 g、生地24 g、芍藥9 g、丹皮6 g;清營(yíng)湯:水牛角9 g、生地15 g、玄參9 g、麥冬9 g、連翹6 g、金銀花9 g、黃連5 g、竹葉3 g、丹參6 g;清瘟敗毒飲:石膏30 g、知母12 g、甘草12 g、水牛角6 g、生地6 g、芍藥12 g、牡丹皮12 g、黃連3 g、黃芩12 g、連翹12 g、梔子12 g、玄參12 g、竹葉12 g、桔梗12 g。按劑量配比好后,加入足量蒸餾水,浸泡30 min。用武火煮沸后改為文火繼續(xù)煎煮20 min,使用4層紗布趁熱過(guò)濾后收集藥液。繼續(xù)向剩余的藥渣加入足量蒸餾水,重復(fù)上述步驟1次,最后將2次所得的濾液合并,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液進(jìn)行濃縮,使最后生藥的質(zhì)量濃度為1 g/mL。

1.4 菌液的制備將活化后的大腸桿菌菌液進(jìn)行離心,棄掉上清液,用0.9%生理鹽水重懸,使用比濁管進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。使用時(shí)用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋備用。

1.5 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定采用試管法進(jìn)行MIC測(cè)定。取40支試管,10支為1組進(jìn)行編號(hào)。將藥液以2倍稀釋加入到1～8號(hào)試管,即質(zhì)量濃度為1 000.000 0,500.000 0,250.000 0,125.000 0,62.500 0,31.250 0,15.625 0,7.812 5 g/L。再按1∶1加入濃度為2×105CFU/mL的菌液。第9號(hào)試管只加藥,不加菌,用作藥物對(duì)照。第10號(hào)試管只加菌,不加藥,用作細(xì)菌對(duì)照。37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

1.6 IPEC-J2培養(yǎng)及分組使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/孔,待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%開(kāi)始試驗(yàn)。試驗(yàn)分為6組?？瞻讓?duì)照組、大腸桿菌組、白頭翁湯組、牛角地黃湯組、清營(yíng)湯組和清瘟敗毒飲組。預(yù)防處理時(shí),空白對(duì)照組加入維持培養(yǎng)基(含2%血清的DMEM)作用16 h;大腸桿菌組加入維持培養(yǎng)基作用12 h,12 h后加以入大腸桿菌1×108CFUs/孔作用4 h;其余各組先加清熱涼血方作用12 h,12 h后處理同大腸桿菌組。治療處理時(shí),空白對(duì)照組加入維持培養(yǎng)基作用16 h,大腸桿菌組和剩余其他組加入1×108CFUs/孔的大腸桿菌作用4 h,4 h后大腸桿菌組換成維持培養(yǎng)基作用12 h。其他各組加入對(duì)應(yīng)清熱涼血方作用12 h。

1.7 RT-qPCR反應(yīng)將反應(yīng)完成后的細(xì)胞用PBS清洗3次,使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。按照Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按2×Real-time PCR Super Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行RT-qPCR。引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[13],具體見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR 引物

1.8 免疫熒光染色檢測(cè)將反應(yīng)完成后的細(xì)胞用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,再用PBS清洗3遍,3% BSA室溫孵育1 h進(jìn)行封閉;封閉結(jié)束后直接孵育ZO-1熒光一抗3 h,再用PBS清洗3遍,孵育Actin 30 min,再用PBS清洗3遍,孵育DAPI 5 min,最后用PBS清洗3遍,封片,熒光顯微鏡拍攝。

1.9 活性成分含量測(cè)定精密稱取蘆丁、沒(méi)食子酸、葡萄糖等標(biāo)準(zhǔn)品配置成質(zhì)量濃度為0.2 g/L標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。再將標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行不同質(zhì)量濃度的稀釋,于D510 nm、D760 nm以及D490 nm處測(cè)定吸光度值。分別以蘆丁、沒(méi)食子酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將清熱涼血方稀釋成20 g/L,按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行測(cè)定,并由標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮、總酚酸、總多糖含量[13-15]。

2 結(jié)果

2.1 清熱涼血方對(duì)大腸桿菌MIC測(cè)定結(jié)果清熱涼血方本身的顏色是影響MIC判斷的主要原因,因此本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中加入微量酚紅(0.02%),通過(guò)細(xì)菌和清熱涼血方共孵育后的顏色變化來(lái)確定MIC值。4付清熱涼血方對(duì)大腸桿菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,結(jié)果表明白頭翁湯、牛角地黃湯和清瘟敗毒飲對(duì)大腸桿菌的MIC最低,說(shuō)明抑菌作用最強(qiáng),其次是清營(yíng)湯。

表2 4付中藥復(fù)方水提取液對(duì)大腸桿菌的 MIC值 g/L

2.2 清熱涼血方對(duì)ZO-1 mRNA表達(dá)的影響為了驗(yàn)證4付清熱涼血方對(duì)ZO-1 mRNA表達(dá)的影響,使用RT-qPCR對(duì)ZO-1進(jìn)行定量分析,結(jié)果如圖2所示。在進(jìn)行預(yù)防處理和治療處理時(shí),與空白對(duì)照組相比,大腸桿菌組中ZO-1 mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05),表明大腸桿菌能夠?qū)?xì)胞造成損傷,說(shuō)明造模成功;使用清熱涼血方預(yù)防處理有助于細(xì)胞抵抗大腸桿菌的侵襲。其中牛角地黃湯效果最好(P<0.01),白頭翁湯和清瘟敗毒飲效果次之(P<0.05)(圖2A)。說(shuō)明牛角地黃湯對(duì)大腸桿菌的侵襲有很好的預(yù)防作用。攻菌后,再使用中藥復(fù)方水提液有助于恢復(fù)ZO-1 mRNA的表達(dá),牛角地黃湯和清瘟敗毒飲效果最好(P<0.01),白頭翁湯效果次之(P<0.05)(圖2B)說(shuō)明牛角地黃湯和清瘟敗毒飲對(duì)大腸桿菌侵襲有很好的治療作用。

2.3 清熱涼血方預(yù)防處理對(duì)ZO-1蛋白表達(dá)的影響蛋白是mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯后的產(chǎn)物,執(zhí)行不同的細(xì)胞功能。于是將細(xì)胞制作成細(xì)胞爬片,待作用結(jié)束后進(jìn)行固定和抗體孵育,使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)ZO-1蛋白的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,大腸桿菌組中ZO-1 蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),說(shuō)明造模成功;與大腸桿菌組比較,白頭翁湯組、清營(yíng)湯組和清瘟敗毒飲組中ZO-1 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖3A為熒光結(jié)果,圖3B為結(jié)果量化);說(shuō)明白頭翁湯、清營(yíng)湯和清瘟敗毒飲可以通過(guò)保護(hù)細(xì)胞抗大腸桿菌對(duì)ZO-1的破壞。

2.4 清熱涼血方治療處理對(duì)ZO-1蛋白表達(dá)的影響探究大腸桿菌預(yù)處理4 h后4付清熱涼血方對(duì)ZO-1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,大腸桿菌組與空白對(duì)照組相比,大腸桿菌組中ZO-1 蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.001),表明模型構(gòu)建成功;其他用藥組與大腸桿菌組比較,清瘟敗毒飲組和牛角地黃湯組可以極顯著恢復(fù)ZO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01,P<0.001),而白頭翁湯組和清營(yíng)湯組與大腸桿菌組相比差異不顯著(P>0.05);說(shuō)明清瘟敗毒飲和牛角地黃湯可以治療大腸桿菌對(duì)ZO-1蛋白造成的損傷,并且清瘟敗毒飲效果最好。

2.5 清熱涼血方中有效活性成分含量的檢測(cè)根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果,為了進(jìn)一步探究清熱涼血方具有預(yù)防和治療大腸桿菌損傷的原因。檢測(cè)清熱涼血方中是否含有具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用的有效活性成分。通過(guò)硝酸鋁顯色法、硫氰化鉀-三氯化鐵法以及濃硫酸-苯酚法檢測(cè)總黃酮、總酚酸、總多糖的含量。結(jié)果顯示,白頭翁湯、牛角地黃湯、清營(yíng)湯和清瘟敗毒飲中均含有一定量的總黃酮、總酚酸以及總多糖成分。其中,總黃酮和總酚酸含量最高的是白頭翁湯,分別為120.75,58.11 mg/g;總多糖含量最高的是牛角地黃湯為370.02 mg/g(圖5)。說(shuō)明清熱涼血方含有多種有效成分,不單單只通過(guò)一種成分來(lái)發(fā)揮預(yù)防和治療作用。

3 討論

隨著抗生素的廣泛使用,造成多重耐藥(MDR)細(xì)菌的出現(xiàn),因此,需要尋找新的抗菌策略[16]。天然植物中含有大量有效活性成分,具有多種生物活性[17]。研究發(fā)現(xiàn),迷迭香提取物能夠降低大腸桿菌攻毒肉雞的腹瀉率,從線葉金雀花中提取的總黃酮以及黃連、蘇木、五味子的水提液對(duì)大腸桿菌都有很好的抑菌效果[18-22]。但在臨床的應(yīng)用中,中藥復(fù)方的使用頻率更高。中藥復(fù)方具有一定結(jié)構(gòu)、多層次、多作用靶點(diǎn)等特點(diǎn)。因此,本研究選取4付經(jīng)典的清熱涼血方進(jìn)行探究,以期為臨床治療大腸桿菌用藥提供參考。

清熱涼血方由于具有顏色不利于對(duì)MIC的直接判斷。本研究中使用加入微量酚紅改良的馬丁培養(yǎng)基,預(yù)先將清熱涼血方調(diào)整至中性,細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖中消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖,使溶液呈酸性,酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色來(lái)進(jìn)行判定。試驗(yàn)結(jié)果表明,白頭翁湯、牛角地黃湯、清營(yíng)湯和清瘟敗毒飲均有一定直接抗菌作用,其中抗菌效果最好的是清瘟敗毒飲、白頭翁湯和牛角地黃湯。

進(jìn)一步地有研究表明,大腸桿菌在臨床上主要引起犢牛、仔豬以及兒童腹瀉,損傷腸道屏障[23-25]。緊密連接是腸道屏障最重要的一個(gè)組成部分。竇彩霞等[26]在研究中發(fā)現(xiàn),腸產(chǎn)毒素大腸桿菌處理細(xì)胞可以極顯著降低ZO-1的表達(dá),引起細(xì)胞損傷,破壞緊密連接。因此,本研究聚焦于探究清熱涼血方對(duì)大腸桿菌損傷細(xì)胞ZO-1的防治作用,同時(shí),也證實(shí)了大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株同樣也能造成ZO-1表達(dá)的降低。

使用清熱涼血方對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防和治療處理,再檢測(cè)ZO-1 mRNA的表達(dá)和免疫熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明,清熱涼血方有很好的預(yù)防和治療作用,其中預(yù)防作用最好的是白頭翁湯、清營(yíng)湯和清瘟敗毒飲,治療效果最好的是清瘟敗毒飲。這與mRNA的表達(dá)并不完全相同。這可能是由于mRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程中發(fā)生了改變,研究表明蛋白是執(zhí)行各種任務(wù)以維持生命的主力分子,所以蛋白最后的表達(dá)情況更具有參考價(jià)值[27]。并且在預(yù)防作用中,清熱涼血方直接靶向細(xì)胞本身,通過(guò)增加細(xì)胞ZO-1的表達(dá)來(lái)抵抗大腸桿菌的侵襲,這與傳統(tǒng)靶向細(xì)胞本身的抗菌方式有所區(qū)別,這也體現(xiàn)出清熱涼血方具有“扶正和祛邪”優(yōu)勢(shì)[12]。

有效活性成分是清熱涼血方能夠發(fā)揮生物活性的最主要原因。分別檢測(cè)4付清熱涼血方中的總黃酮、總酚酸以及總多糖含量。結(jié)果表明,4付清熱涼血方中均含有這3類有效活性成分,這也說(shuō)明清熱涼血方中含有大量不同種類的有效活性成分,這些有效活性成分相輔相成,最終起到抗大腸桿菌引起的ZO-1蛋白降低的作用。

根據(jù)以上結(jié)論可以得出,4付清熱涼血方有直接抑菌作用,并且通過(guò)提高ZO-1蛋白的表達(dá)進(jìn)而具有預(yù)防和治療大腸桿菌損傷細(xì)胞作用。除此之外,清熱涼血方中含有多種有效活性成分,所以發(fā)揮作用的機(jī)制可能是多方面的,具體還需更進(jìn)一步研究。