納米二氧化硅對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性作用

方忞芊,孫翊傑,張倩茹,許顯玉,2,陳風(fēng)雷,2*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

納米二氧化硅(silica nanoparticles,SNPs)是一種人工合成的納米材料,已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化妝品、食品添加劑和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1]。由于SNPs的廣泛應(yīng)用,尤其在消費(fèi)品和生物醫(yī)藥方面,增加了人和動(dòng)物對(duì)其接觸的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。根據(jù)其物理、化學(xué)性質(zhì)及暴露時(shí)間和途徑的不同,SNPs可在多種器官中造成毒性,如肝臟、腎臟、腦、肺臟、卵巢和睪丸[4-6]。SNPs可以穿過(guò)血睪屏障,分布在睪丸組織中,導(dǎo)致睪丸毒性[7-9]。

睪丸的主要功能是產(chǎn)生精子和分泌睪酮。研究發(fā)現(xiàn),納米材料的睪丸毒性是由納米顆粒通過(guò)不同途徑(包括血液循環(huán)或直接接觸)積累造成的,睪丸對(duì)納米顆粒積累十分脆弱和敏感[10],如氧化鋅納米顆粒、氧化鈰納米顆粒和SNPs[9,11-12]。SNPs可引起精曲小管損傷,導(dǎo)致精子活力下降[6]。然而,SNPs誘導(dǎo)的睪丸毒性機(jī)制還不十分清楚。雖然已有研究報(bào)道SNPs在精子發(fā)生中的毒性,但SNPs對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性研究相對(duì)較少[13]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)睪酮的合成和分泌對(duì)精子發(fā)生起著重要作用。SNPs通過(guò)影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞從而引起睪丸毒性有待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn),探討SNPs對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性作用及調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步完善SNPs的生殖毒性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠(雄性,28日齡)購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均得到揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和同意(獲批編號(hào):202103322)。 小鼠在23～25℃和12 h明/12 h暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑膠原酶Ⅰ購(gòu)置于美國(guó)賽默飛世爾科技公司;Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)置于GE Healthcare Life Sciences公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、吖啶橙(acridine orange,AO)和Lyso-Tracker Red染色液購(gòu)置于碧云天生物技術(shù)有限公司;抑肽素(pepstatin,Pep A)購(gòu)置于MedChemExpress公司;CDST兔多克隆抗體購(gòu)置于美國(guó)Abcam公司。

1.3 主要儀器設(shè)備流式細(xì)胞儀購(gòu)置于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;透射電鏡購(gòu)置于日本日立公司;激光共聚焦顯微鏡購(gòu)置于德國(guó)萊卡公司;Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀購(gòu)置于英國(guó)馬爾文(Malvern)儀器公司。

1.4 SNPs制備和理化性質(zhì)檢測(cè)利用St?ber方法進(jìn)行SNPs的合成。步驟如下:將1 700 mmol/L無(wú)水乙醇、155 mmol/L雙蒸水和26 mmol/L氫氧化銨混合,加入16 mmol/L四乙氧基硅烷室溫?cái)嚢?超速離心后,用蒸餾水和95%乙醇洗滌,保存于無(wú)水乙醇中。試驗(yàn)用SNPs超速離心后,重懸于超純水中。透射電鏡檢測(cè)SNPs形態(tài)結(jié)構(gòu)并使用Image J軟件分析粒徑大小,Zetasizer Nano ZS檢測(cè)SNPs在溶液中的粒徑和電位。

1.5 SNPs處理小鼠將32只雄性ICR小鼠隨機(jī)均分為4組,分別為生理鹽水組(對(duì)照組)、12.5,25.0和50.0 mg/kg的SNPs組,經(jīng)尾靜脈注射處理小鼠。每日測(cè)體質(zhì)量,15 d后處死小鼠。將睪丸從腹腔取出,浸泡在改良的戴維森液體組織固定液中(95%乙醇、甲醛、冰醋酸和超純水按3∶2∶1∶2混合),進(jìn)行蘇木精-伊紅(H&E)染色。

1.6 H&E染色固定后的睪丸樣品分別用梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作5 μm厚連續(xù)切片,按常規(guī)方法染色,用中性樹(shù)脂封片后,顯微鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7 睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)從雄性小鼠中取出睪丸,去除白膜后,放入含有1 g/L膠原酶Ⅰ的DMEM/F12中,37℃水浴孵育10 min,加入等量的含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液終止消化;睪丸間質(zhì)細(xì)胞重懸并使用Percoll梯度離心后,收集睪丸間質(zhì)細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力;將純化的睪丸間質(zhì)細(xì)胞離心、重懸并培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基中,用3β-羥類固醇脫氫酶檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞純度[14]。

1.8 SNPs在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中定位SNPs處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞后,PBS洗滌除去多余SNPs,4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的PBS溶液中固定24 h。經(jīng)PBS洗滌3次后,2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行包埋,4%四氧化鋨中固定,0.5%乙酸鈾染色;經(jīng)梯度乙醇脫水后,包埋入環(huán)氧樹(shù)脂;切片后用3%醋酸鈾酰-檸檬酸鉛染色,使用透射電鏡進(jìn)行觀察拍照。

1.9 LDH染色將3×104個(gè)細(xì)胞/200 μL培養(yǎng)液/孔接種到96孔板中培養(yǎng)24 h;然后用不同質(zhì)量濃度的SNPs處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h;去除培養(yǎng)液并使用PBS洗滌3次,加入150 μL LDH溶液并混勻;繼續(xù)培養(yǎng)1 h,分別取各孔上清120 μL,加入新96孔板中進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.10 細(xì)胞凋亡測(cè)定通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SNPs處理后睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況。將2 × 106個(gè)細(xì)胞/2 mL培養(yǎng)液/孔接種到6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h;然后用不同質(zhì)量濃度的SNPs(300,600和900 mg/L)處理24 h;PBS洗滌和胰蛋白酶消化后,收集細(xì)胞,加入含Annexin Ⅴ-FITC和PI的緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.11 AO染色將睪丸間質(zhì)細(xì)胞接種到含有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,然后用SNPs處理24 h;PBS洗滌除去多余SNPs后,加入AO染色液,孵育20 min;去除AO染色液后,加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液;用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.12 Lyso-Tracker Red染色將睪丸間質(zhì)細(xì)胞接種到含有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,然后用SNPs處理24 h;PBS洗滌除去多余SNPs后,加入濃度為50 nmol/L的Lyso-Tracker Red染色液,孵育20 min;去除Lyso-Tracker Red染色液后,加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液,用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.13 免疫熒光染色將睪丸間質(zhì)細(xì)胞接種到含有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,然后用SNPs處理24 h;PBS洗滌除去多余SNPs后,4%多聚甲醛固定20 min;用含0.5% Triton X-100的PBS通透10 min;5%牛血清白蛋白封閉 1 h;用兔抗CDST一抗4℃孵育過(guò)夜;PBS洗滌后,加入熒光二抗避光孵育1 h,用DAPI孵育10 min;用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

1.14 Western blot檢測(cè)使用全細(xì)胞蛋白提取試劑盒進(jìn)行全蛋白提取;使用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度;等量蛋白用10% SDS-PAGE凝膠分離,電印跡法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;轉(zhuǎn)膜后,10%的脫脂奶粉封閉1 h;一抗4℃孵育過(guò)夜;PBST洗滌后,加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h;PBST洗滌后,使用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光,使用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 SNPs理化性質(zhì)為測(cè)定合成SNPs理化性質(zhì),透射電鏡結(jié)果顯示該SNPs是單分散圓球形顆粒(圖1A);隨機(jī)挑選透射電鏡圖利用Image J軟件進(jìn)行粒徑大小分析,結(jié)果顯示SNPs粒徑大小為(106.90±13.43) nm(圖1B);利用Zetasizer Nano ZS對(duì)SNPs在10 mmol/L NaCl溶液中的流體動(dòng)力學(xué)尺寸和電位進(jìn)行分析,結(jié)果顯示SNPs粒徑大小為 (110.80 ± 26.50) nm并帶有負(fù)電荷,zeta電位絕對(duì)值為(49.7±6.6) mV[15]。

A.SNPs透射電鏡結(jié)果;B.SNPs粒徑大小分析結(jié)果

2.2 SNPs改變睪丸的組織結(jié)構(gòu)為了檢測(cè)在體SNPs對(duì)睪丸的毒性作用,尾靜脈注射SNPs后,采用H&E染色觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)變化。H&E染色結(jié)果顯示,對(duì)照組睪丸組織結(jié)構(gòu)正常,精曲小管內(nèi)上皮細(xì)胞排列規(guī)則(圖2Aa),睪丸間質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞排列緊密,所有生精細(xì)胞和支持細(xì)胞均正常(圖2Ab);12.5 mg/kg SNPs組睪丸精曲小管內(nèi)上皮細(xì)胞排列規(guī)則(圖2Ba),但睪丸間質(zhì)出現(xiàn)部分缺失及間質(zhì)細(xì)胞減少現(xiàn)象(圖2Bb);25.0和50.0 mg/kg SNPs組睪丸出現(xiàn)明顯的精曲小管萎縮和變形(圖2Ca、Da),睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少和生精上皮細(xì)胞排列紊亂現(xiàn)象(圖2Cb、Db)。

2.3 SNPs定位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞溶酶體中為了檢測(cè)SNPs是否能夠進(jìn)入睪丸間質(zhì)細(xì)胞,利用透射電鏡技術(shù)對(duì)SNPs在細(xì)胞中的定位進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,對(duì)照組中沒(méi)有納米顆粒(圖3A、B),而SNPs組的睪丸間質(zhì)細(xì)胞溶酶體中存在納米顆粒的積累(圖3C、D)。

2.4 SNPs降低睪丸間質(zhì)細(xì)胞活性和增加凋亡為了確定SNPs對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性,對(duì)SNPs處理后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖、活性和凋亡測(cè)定。LDH結(jié)果顯示,SNPs處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞毒性逐漸升高并呈現(xiàn)劑量依賴性特點(diǎn)(圖4A);CCK-8結(jié)果顯示,SNPs處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞活性逐漸降低并呈現(xiàn)劑量依賴性特點(diǎn)(圖4B);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,SNPs處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞后,與對(duì)照組凋亡率(5.62±0.60)%相比,300,600和900 mg/L SNPs處理組的凋亡率分別是(12.38±1.32)%,(16.11±1.86)%和(22.76±2.42)%,細(xì)胞凋亡顯著增加(圖4C、D)。

2.5 SNPs誘導(dǎo)溶酶體損傷為了進(jìn)一步驗(yàn)證SNPs對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響機(jī)制,對(duì)溶酶體膜通透性和酸堿性進(jìn)行了檢測(cè)。使用溶酶體膜通透性染料AO和pH敏感的溶酶體染料Lyso-Tracker Red對(duì)溶酶體的通透性和酸度進(jìn)行評(píng)估。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,暴露于SNPs后AO染色綠色熒光和紅色熒光強(qiáng)度均顯著變強(qiáng)(圖5Aa、Ab),Lyso-Tracker Red陽(yáng)性結(jié)構(gòu)面積顯著增大(圖5Ba、Bb),均與CQ組一致(圖5Ac、Bc)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與激光共聚焦顯微鏡結(jié)果相一致(圖5C～E)。為了檢驗(yàn)SNPs對(duì)溶酶體完整性的影響,檢測(cè)了天冬氨酸蛋白酶組織蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)的亞細(xì)胞定位。熒光顯微鏡結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞表現(xiàn)為大的團(tuán)塊綠色熒光,而SNPs暴露的細(xì)胞為小的團(tuán)塊或散在綠色熒光,CQ組的細(xì)胞為彌漫性綠色熒光(圖5F)。Western blot結(jié)果顯示,SNPs組CTSD成熟亞型表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降,這與CQ組一致(圖5G、H)。

A.AO測(cè)定睪丸間質(zhì)細(xì)胞中溶酶體通透性(Aa.對(duì)照組;Ab.300 mg/L SNPs組;Ac.100 mmol/L CQ組);B.Lyso-Tracker Red測(cè)定睪丸間質(zhì)細(xì)胞中酸度(Ba.對(duì)照組;Bb.300 mg/L SNPs組;Bc.100 mmol/L CQ組);C.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AO染色綠色熒光強(qiáng)度;D.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AO染色紅色熒光強(qiáng)度;E.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lyso-Tracker Red染色紅色熒光強(qiáng)度;F.免疫熒光檢測(cè)CTSD在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位;G.Western blot分析溶酶體中CTSD的水平;H.成熟CTSD水平的密度分析

2.6 Pepstatin A抑制SNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為進(jìn)一步確認(rèn)溶酶體損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,我們使用CTSD抑制劑Pep A和SNPs共處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對(duì)照組(6.35±0.80)%相比,單獨(dú)使用Pep A(5.64±0.76)%凋亡率無(wú)顯著性差異;但是與SNPs組(20.08±2.20)%相比,聯(lián)合使用Pep A和SNPs (14.30±1.80)%凋亡率顯著降低(圖6A、B)。

A.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率;B.細(xì)胞凋亡率結(jié)果分析柱狀圖

3 討論

SNPs的大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用引起了公眾對(duì)其環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注[16]。在亞洲,每年有數(shù)百噸的SNPs被釋放到水、土壤和垃圾填埋場(chǎng)中[17]。盡管SNPs被廣泛認(rèn)為具有良好的生物相容性,但在前期研究中也報(bào)道了SNPs對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒副作用[18]。研究表明,SNPs能夠透過(guò)血睪屏障,引起雄性生殖系統(tǒng)毒性。SNPs可在睪丸中積累,破壞生精小管,從而抑制精子發(fā)生,導(dǎo)致精子的質(zhì)量和數(shù)量下降[6]。SNPs的睪丸毒性不僅能夠影響精子發(fā)生,而且可調(diào)節(jié)機(jī)體睪酮水平[15]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸的重要組成部分,主要參與睪酮的合成和分泌,睪丸間質(zhì)細(xì)胞通過(guò)合成和分泌睪酮在精子發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。然而,睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不完全清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)溶酶體損傷參與SNPs誘導(dǎo)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的空氣質(zhì)量指南[19],小鼠通過(guò)體內(nèi)尾靜脈注射12.5 mg/kg(低劑量)、25.0 mg/kg(中劑量)和50.0 mg/kg(高劑量)的SNPs(110 nm,球形)。研究發(fā)現(xiàn)12.5 mg/kg的SNPs無(wú)明顯毒性作用,而25.0和50.0 mg/kg的SNPs能夠引起精曲小管結(jié)構(gòu)異常和睪丸間質(zhì)細(xì)胞減少。通過(guò)體外培養(yǎng)原代小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞我們發(fā)現(xiàn),SNPs能夠引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性并呈現(xiàn)劑量依賴性。SNPs通過(guò)胞吞作用進(jìn)入睪丸間質(zhì)細(xì)胞后主要集中在單層膜狀結(jié)構(gòu)溶酶體中,并且通過(guò)改變?nèi)苊阁w的酸堿性和膜的通透性參與SNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

溶酶體是真核細(xì)胞中單層膜酸性細(xì)胞器,是細(xì)胞內(nèi)重要的降解和代謝中心,溶酶體結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于細(xì)胞的生存和功能至關(guān)重要。溶酶體損傷通常會(huì)導(dǎo)致溶酶體膜通透化,溶酶體腔內(nèi)的組織蛋白酶和蛋白水解酶釋放到細(xì)胞質(zhì)中,激活胞質(zhì)內(nèi)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),降低細(xì)胞清除能力,從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑。組織蛋白酶是溶酶體水解酶的一個(gè)家族,是溶酶體膜通透化的主要活性蛋白,其中CTSD是溶酶體內(nèi)重要的組織蛋白酶,與溶酶體相關(guān)的細(xì)胞凋亡關(guān)系較為密切。研究發(fā)現(xiàn),SNPs處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞后CTSD呈現(xiàn)小的團(tuán)塊或散在分布,表明CTSD從溶酶體中釋放到細(xì)胞質(zhì),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中的CTSD水平顯著升高,而溶酶體中的顯著下降。前期研究報(bào)道顯示,組蛋白酶可以調(diào)節(jié)BCL-2家族成員BID的活性,從而促進(jìn)BCL-2相關(guān)蛋白寡聚化,使得寡聚化復(fù)合體轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上,導(dǎo)致線粒體通透化并釋放細(xì)胞色素C,激活線粒體介導(dǎo)的Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑[20]。為了進(jìn)一步確定組蛋白水解酶介導(dǎo)的溶酶體損傷參與SNPs誘導(dǎo)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡,我們利用CTSD的抑制劑Pep A和SNPs共處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡被抑制,進(jìn)一步表明溶酶體損傷參與SNPs誘導(dǎo)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性的產(chǎn)生。