牦牛ATG5多克隆抗體的制備及應(yīng)用

高 翔,潘陽陽,2,王 萌,2,焦正興,王靖雷,馬文斌,王軍乾,余四九,2,崔 燕,2,王立斌,2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州 730070)

自噬(autophagy)是真核細(xì)胞中普遍存在的生命現(xiàn)象,是將細(xì)胞內(nèi)變形、衰老或損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中消化降解的一種代謝過程,在維持細(xì)胞正常功能中起著重要作用[1-2]。哺乳動物卵泡發(fā)育過程中,自噬有助于維持健康的原始卵泡數(shù)量、生殖細(xì)胞存活和去除黃體殘余物并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4],對卵巢閉鎖和生殖細(xì)胞發(fā)育進(jìn)行調(diào)控[5-6]。自噬相關(guān)蛋白通過介導(dǎo)多種信號誘導(dǎo)自噬以維持雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育過程[7]。當(dāng)自噬相關(guān)基因在雄性生殖細(xì)胞中被破壞后,將導(dǎo)致精子頂體發(fā)育異常、線粒體重排以及多余細(xì)胞質(zhì)殘留以及受精卵個體發(fā)育失敗[8]。研究表明,子宮內(nèi)膜在卵巢激素的調(diào)控下發(fā)生自噬,導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤,對子宮內(nèi)膜脫落、組織修復(fù)和預(yù)防感染起著不可或缺的作用[9]。在胚胎附植過程中,子宮內(nèi)膜自噬水平也發(fā)生顯著變化,附植前期子宮內(nèi)膜細(xì)胞中自噬水平較高,隨著附植完成,自噬水平出現(xiàn)顯著下調(diào)[10],說明自噬在維持妊娠中發(fā)揮重要作用。

在已知的自噬相關(guān) (autophagy-related,ATG)蛋白中,ATG5蛋白是自噬囊泡形成不可或缺的[11]。ATG5蛋白作為自噬與細(xì)胞凋亡之間的分子開關(guān),它的缺失可導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平下調(diào)或完全被抑制[12]。在自噬體囊泡伸長和成熟過程中,ATG7蛋白和ATG10蛋白促進(jìn)ATG12蛋白和ATG5蛋白結(jié)合形成二聚體復(fù)合物 (ATG12-ATG5-ATG16L1),這是微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)之間形成共價鍵所必需的[13]。而LC3前體在ATG4蛋白的作用下轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅰ,由ATG7蛋白激活并轉(zhuǎn)移到ATG3蛋白。ATG12-ATG5-ATG16L1 復(fù)合物促進(jìn)LC3-Ⅰ從ATG3蛋白轉(zhuǎn)移到PE以產(chǎn)生LC3Ⅱ,它是自噬通量的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記,定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜[14-17]。

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高海拔地區(qū)的特有畜種,常年放牧飼養(yǎng),生活環(huán)境氣候條件非常惡劣,高寒低氧。牦牛主要分布在我國青藏高原,占世界牦?？倲?shù)的95%,是當(dāng)?shù)鼐用裰匾纳钗镔Y來源,有很高的經(jīng)濟(jì)價值。受到自然環(huán)境的影響,牦牛的生產(chǎn)性能和繁殖性能比較低下,且人們對其生殖生理活動的研究相對較少。本研究通過合成牦牛ATG5基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),并用表達(dá)的蛋白免疫日本大耳白兔,制備牦牛ATG5多克隆抗體,并檢測ATG5蛋白在牦牛組織中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步利用輔助生殖技術(shù)提高牦牛的繁殖率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

1.1.1實驗動物 日本大耳白兔購自蘭州獸醫(yī)研究所,10月齡,雌、雄各1/2,室內(nèi)飼養(yǎng),飲水充足,健康狀況良好。

1.1.2牦牛組織樣品采集 本研究所用的牦牛組織樣品采集自青海省西寧市某屠宰場。健康成年牦牛經(jīng)頸動脈放血屠宰后,采集組織樣品,分別置于4%多聚甲醛溶液和液氮中用于后期試驗。牦牛輸卵管上皮細(xì)胞由甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1主要儀器 超聲波細(xì)胞破碎儀,寧波新芝生物公司;酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;顯微拍照儀,日本Olympus公司。

1.2.2主要試劑 原核表達(dá)載體pET-32a由甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心保存; 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside,X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),北京Solarbio公司;親和層析柱料和佐劑,默克(中國)有限公司;感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),大連TaKaRa公司;磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS),Gibco (美國)公司;HistostainTM-Plus Kits免疫組化染色試劑盒,博奧森(北京)公司。

1.3 牦牛pET-32a-ATG5重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1人工合成目的基因 根據(jù)GenBank公布的牦牛ATG5基因序列(登錄號:MK531791),由武漢戴安生物技術(shù)有限公司人工合成牦牛ATG5基因片段,長度為840 bp,包含限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ位點。

1.3.2構(gòu)建重組質(zhì)粒 將獲得的ATG5基因片段與pET-32a(含有His與Trx標(biāo)簽,蛋白相對分子質(zhì)量大小為20 kDa)質(zhì)粒連接,構(gòu)建pET-32a-ATG5重組質(zhì)粒。使用內(nèi)切酶XhoⅠ和ApaBⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證。

1.4 牦牛ATG5重組蛋白原核表達(dá)將pET-32a-ATG5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌,恒溫箱培養(yǎng)過夜。挑選6個單克隆, 37℃ 220 r/min培養(yǎng)至菌液D600 nm=0.5～0.6時,加入終濃度0.5×10-3mol/L IPTG。20℃恒溫誘導(dǎo)3.5 h,通過SDS-PAGE篩選表達(dá)好的菌株。將表達(dá)良好的菌種接種至200 mL抗性培養(yǎng)基中,37℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜。加入新鮮抗性培養(yǎng)液至800 mL,培養(yǎng)2 h,至菌液D600 nm=0.5～0.6,加入終濃度1 mol/L IPTG,37℃誘導(dǎo)3.5 h。

1.5 牦牛ATG5重組蛋白的純化將1.4所得菌液4℃條件下,4 000 r/min離心15 min收集菌體,棄上清。PBST重懸菌體,加入終濃度1×10-3mol/L PMSF,超聲破碎6 min。220 r/min,4℃孵育1 h;8 000 r/min 離心15 min,收取上層清液。加入含有400 μL 純化樹脂的層析柱中,4℃結(jié)合過夜。2 000 r/min 離心5 min,收集純化樹脂后用0.02 mol/L 咪唑洗滌液清洗2次;加入300 μL濃度為0.3 mol/L的咪唑洗脫液,4℃孵育1 h,離心收集上清。再次加入300 μL的洗脫液,靜置1 h,離心收集上清,將2次洗脫液合為1管。SDS-PAGE鑒定蛋白相對分子質(zhì)量。

1.6 牦牛ATG5多克隆抗體的制備

1.6.1動物免疫及抗血清的獲得 利用純化后的ATG5重組蛋白免疫2只日本大耳白兔,首次免疫時使用弗氏完全佐劑,加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑。4次加強(qiáng)免疫后,采集血清。置于4℃冰箱靜置過夜,使血清充分析出。4℃ 4 000 r/min離心5 min得到分離的抗血清,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2Western blot檢測抗血清特異性 取ATG5重組蛋白,100℃水浴10 min 進(jìn)行蛋白SDS變性。配置10%的分離膠溶液和5%的濃縮膠溶液,向樣品槽中分別加入15 μL樣品,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,一抗為所制備的日本大耳白兔血清,稀釋比例為1∶1 000,4℃孵育過夜;洗滌后,孵育山羊抗兔二抗,稀釋比例為1∶8 000,室溫水平搖床孵育1 h,洗滌后曝光。

1.6.3牦牛ATG5多克隆抗體的純化 室溫下,將1 mg純化蛋白質(zhì)與溴化氫活化的 Sepharose 4B柱顛倒混勻1 h,制備親和純化柱;10 mL抗血清與親和純化柱孵育過夜;pH=5.0的HCl預(yù)洗,除去雜抗體,pH=2.5,0.15 mol/L的甘氨酸電泳緩沖液洗脫,10×PBS緩沖液中和,制備親和純化抗體;對PBS緩沖液透析換液,-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 牦牛ATG5多克隆抗體的效價及特異性檢測

1.7.1間接ELISA法檢測牦牛ATG5多克隆抗體的效價 使用碳酸鹽緩沖液稀釋純化的牦牛ATG5重組蛋白,按照每孔100 ng 加入聚苯乙烯96孔板中,4℃ 孵育過夜;牦牛ATG5多克隆抗體,按1∶10 000,1∶20 000,1∶40 000,1∶80 000,1∶160 000,1∶320 000,1∶640 000,1∶1 280 000,1∶2 560 000,1∶5 120 000,1∶10 240 000進(jìn)行倍比稀釋(空白血清做陰性對照),每孔100 μL,溫室孵育1 h,棄去孔內(nèi)液體,洗滌3次。每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG,37℃孵育40 min,棄去孔內(nèi)液體,洗滌3次。每孔加100 μL顯色液,溫箱暗處放置30 min,加入50 μL終止液終止顯色。以D450 nm陽性血清/D450 nm陰性血清>2.1的最大稀釋倍數(shù)為抗體效價。

1.7.2免疫熒光檢測牦牛ATG5多克隆抗體的特異性 選取原代牦牛輸卵管上皮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL,鋪于賴氨酸包備的蓋玻片上,培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h,使細(xì)胞貼壁;PBS清洗3次,1 min/次;2%多聚甲醛固定1 h;PBS清洗3次,5 min/次;0.5% Triton X-100透化20 min;PBS清洗3次,5 min/次;1% BSA封閉2 h;PBS清洗3次,5 min/次;牦牛ATG5多克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜;PBS 清洗3次,5 min/次;加入FITC標(biāo)記的二抗(1∶1 000)避光孵育2 h;PBS清洗3次,5 min/次;DAPI避光染色3 min;PBS 清洗3次,10 min/次;甘油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 牦牛ATG5多克隆抗體的應(yīng)用

1.8.1牦牛ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的表達(dá) 取2,4,6,8歲牦牛睪丸組織樣品提取總蛋白,與6×蛋白上樣緩沖液3∶1混合,100℃水浴10 min 進(jìn)行蛋白SDS變性。配置10%的分離膠溶液和5%的濃縮膠溶液,進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白。220 mA冰浴電轉(zhuǎn)1 h,將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,使用PBST配制的5%脫脂奶粉溶液封閉2 h;以制備的牦牛ATG5多克隆抗體為一抗(1∶1 000),4℃孵育10 h;TBST 溶液清洗3次,每次10 min;生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗(1∶7 000),37℃ 孵育1 h;TBST溶液清洗5次,每次5 min,發(fā)光顯色后進(jìn)行拍照。通過灰度值分析,以β-actin蛋白作為參照,采用相對定量方法比較不同組ATG5蛋白表達(dá)水平。

1.8.2免疫組織化學(xué)法檢測ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的分布 制作常規(guī)組織切片,使用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),室溫自然冷卻后,PBS洗滌3 min×3次;滴加3% H2O2,37℃ 孵育15 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,滴加封閉液(A液)室溫孵育15 min。滴加制備的牦牛ATG5多克隆抗體(1∶500),4℃ 濕盒孵育過夜,對照組滴加0.02 mol/L PBS替代一抗。滴加二抗(B液),37℃濕盒孵育15 min。滴加C液,37℃濕盒孵育15 min,加DAB試劑顯色,蘇木精復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明,樹脂封片,顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-32a-ATG5的構(gòu)建及驗證構(gòu)建的pET-32a-ATG5重組質(zhì)粒,經(jīng)限制酶XhoⅠ和ApaBⅠ雙酶切形成2條帶,分別為1 862 bp(包含ATG5基因片段)和4 853 bp(圖1),試驗結(jié)果符合預(yù)期。成功構(gòu)建的pET-32a-ATG5重組質(zhì)粒可用于ATG5重組蛋白表達(dá)。

M.DL5000 DNA Marker;1.雙酶切后的產(chǎn)物片段;2.pET-32a-ATG5重組質(zhì)粒

2.2 牦牛ATG5重組蛋白原核表達(dá)挑選轉(zhuǎn)化平板的6株BL21(DE3)-pET-32a-ATG5單克隆菌,經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后SDS-PAGE檢測,6株單克隆菌均可表達(dá)蛋白相對分子質(zhì)量約為53 kDa的重組蛋白(圖2A);經(jīng)灰度值分析,菌株5的ATG5重組蛋白表達(dá)量最高(圖2B),可用于牦牛ATG5重組蛋白的純化。

A.SDS-PAGE檢測原核表達(dá)的重組蛋白(M.蛋白Marker;1～6.菌株);B.ATG5重組蛋白相對表達(dá)水平(1～6.菌株)

2.3 牦牛ATG5重組蛋白的純化IPTG誘導(dǎo)牦牛ATG5重組蛋白大量表達(dá),并對其進(jìn)行純化,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,牦牛ATG5重組蛋白相對分子質(zhì)量約為53 kDa,(圖3A)。透析后,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,目的條帶單一無雜帶(圖3B)。ATG5重組蛋白純化效果良好,可用于動物免疫。

A.SDS-PAGE檢測純化蛋白(M.蛋白Marker;1.目的蛋白洗脫1;2.目的蛋白洗脫2;3.目的蛋白富集樣);B.SDS-PAGE檢測純化透析的蛋白(M.蛋白Marker;1.BSA;2.目的蛋白透析至PBS樣品)

2.4 牦牛ATG5多克隆抗體制備

2.4.1Western blot檢測抗血清特異性 免疫2只日本大耳白兔后,采集血清。通過Western blot檢測,抗血清與牦牛ATG5-His-Trx重組蛋白能發(fā)生特異性反應(yīng),蛋白相對分子質(zhì)量為53 kDa(圖4),與預(yù)期結(jié)果一致。對抗血清純化后得到牦牛ATG5多克隆抗體。

1.重組蛋白1;2.重組蛋白2

2.5 牦牛ATG5多克隆抗體的效價及特異性檢測

2.5.1牦牛ATG5多克隆抗體效價檢測 通過間接ELISA驗證制備的牦牛ATG5多克隆抗體效價,根據(jù)D450 nm陽性血清/D450 nm陰性血清>2.1的最大稀釋倍數(shù)為多克隆抗體的效價,結(jié)果顯示,所制備的牦牛ATG5多克隆抗體效價大于1∶1 280 000。如表 1、圖5所示。

表1 不同稀釋度的D450 nm

圖5 牦牛ATG5多克隆抗體不同稀釋度的D450 nm

A.DAPI細(xì)胞核染色(藍(lán)色);B.ATG5多克隆抗體特異性染色(紅色);C.α-Tubulin內(nèi)參多克隆抗體特異性染色(綠色);D.合并圖像后顯色(橙黃色)

A.ATG5蛋白表達(dá)檢測;B.ATG5蛋白相對表達(dá)水平(不同字母表示組間差異顯著,P<0.05)

2.5.2免疫熒光檢測牦牛ATG5多克隆抗體特異性 通過免疫熒光檢測牦牛ATG5多克隆抗體的特異性,結(jié)果如圖6所示,制備的牦牛ATG5多克隆抗體能與牦牛輸卵管上皮細(xì)胞中的ATG5蛋白發(fā)生特異性結(jié)合,ATG5蛋白主要分布在牦牛輸卵管上皮細(xì)胞細(xì)胞核周邊及胞質(zhì)中。

2.6 牦牛ATG5多克隆抗體的應(yīng)用

2.6.1牦牛ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的表達(dá) 通過Western blot檢測不同年齡組牦牛睪丸組織中ATG5蛋白的表達(dá)。ATG5蛋白在各年齡組牦牛睪丸組織中均有表達(dá)(圖7A),且各組差異顯著(P<0.05)。2歲組ATG5蛋白表達(dá)水平最低,隨著年齡增長ATG5蛋白表達(dá)水平隨之升高,6歲組ATG5蛋白表達(dá)最高。隨著牦牛年齡繼續(xù)增長,8歲組ATG5蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降(圖7B)。

2.6.2ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的定位 通過免疫組化檢測ATG5蛋白在2,4,6,8歲牦牛睪丸組織中的表達(dá),結(jié)果如圖8所示,2,4,6歲牦牛睪丸組織中,ATG5蛋白表達(dá)于支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。8歲牦牛睪丸組織中,ATG5蛋白表達(dá)于支持細(xì)胞和精子細(xì)胞。

3 討論

本研究通過原核表達(dá)的方法獲得牦牛ATG5重組蛋白,經(jīng)過蛋白純化,免疫日本大耳白兔成功獲得兔抗牦牛ATG5多克隆抗體。制得的牦牛ATG5多克隆抗體效價大于1∶1 280 000,張加姿等[18]制備的小麥ATG5多克隆抗體效價為1∶25 600,表明本研究所制備的兔抗牦牛ATG5多克隆抗體具有較高的靈敏度。

在原核表達(dá)、重組蛋白純化和抗血清特異性檢測過程中,SDS-PAGE測得重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為53 kDa,Western blot測得抗血清與重組蛋白結(jié)合的相對分子質(zhì)量同為53 kDa。在應(yīng)用多克隆抗體對不同年齡牦牛睪丸組織中ATG5蛋白表達(dá)檢測過程中,Western blot檢測結(jié)果顯示牦牛ATG5蛋白的相對分子質(zhì)量約為33 kDa,這與張現(xiàn)偉等[19]對抗人ATG5單克隆抗體的相關(guān)研究結(jié)果一致。這是由于pET-32a載體自帶Trx標(biāo)簽,位于pET-32a載體中目的基因的N-端。ATG5重組蛋白中,Trx蛋白標(biāo)簽的相對分子質(zhì)量大約為20 kDa。將重組蛋白用于免疫白兔,動物會對ATG5核心蛋白及Trx蛋白標(biāo)簽分別產(chǎn)生相應(yīng)抗體,但Trx蛋白標(biāo)簽產(chǎn)生的抗體并不與天然蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合,并且試驗過程中Trx標(biāo)簽也沒有對ATG5基因片段的表達(dá)造成干擾,不影響ATG5多克隆抗體的特異性。

在驗證牦牛ATG5多克隆抗體特異性的免疫熒光檢測試驗中,結(jié)果顯示,制備的牦牛ATG5多克隆抗體能夠與牦牛輸卵管上皮細(xì)胞表達(dá)的ATG5蛋白發(fā)生特異性結(jié)合,這與王靖雷等[20]對輸卵管組織ATG5蛋白表達(dá)的相關(guān)研究結(jié)果一致。同時,試驗還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ATG5蛋白在牦牛輸卵管上皮細(xì)胞的表達(dá)主要集中在細(xì)胞核周邊及細(xì)胞質(zhì)中。研究表明,ATG5蛋白能在自噬早期階段標(biāo)記正在擴(kuò)展和生長的吞噬泡[21]。由ATG5蛋白標(biāo)記的吞噬泡位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)的外表面,在快速招募ATG8蛋白之后,最初的吞噬泡開始延伸,其邊緣存在著ATG5復(fù)合體。吞噬泡的膜一旦閉合,ATG5蛋白則離開該結(jié)構(gòu),同時,新產(chǎn)生的自噬小泡離開ER[22]。這與本研究在牦牛輸卵管上皮細(xì)胞免疫熒光檢測中得到的結(jié)果一致。

本研究通過Western blot和免疫組織化學(xué)法以不同年齡牦牛睪丸組織作為研究對象檢測ATG5蛋白的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,ATG5蛋白在2,4,6,8歲牦牛睪丸組織中均有表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示,ATG5蛋白在各年齡段牦牛睪丸支持細(xì)胞中表達(dá)較為穩(wěn)定。支持細(xì)胞是生精小管中唯一的體細(xì)胞,支持細(xì)胞不僅通過控制自身數(shù)量和功能來調(diào)節(jié)精子發(fā)生,還通過旁分泌作用來滋養(yǎng)支持細(xì)胞周圍的生殖細(xì)胞[23]。同時支持細(xì)胞還能通過吞噬作用迅速清除凋亡細(xì)胞,維持生精小管環(huán)境[24]。這可能表明ATG5蛋白參與精子生成的調(diào)節(jié)過程。根據(jù)灰度值分析不同年齡組ATG5蛋白相對表達(dá)水平,2歲組ATG5蛋白表達(dá)水平最低,隨著年齡增長ATG5蛋白表達(dá)水平隨之升高,6歲組ATG5蛋白水平顯著高于其他年齡組。隨著牦牛年齡繼續(xù)增長,8歲組ATG5蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降。結(jié)合免疫組化結(jié)果2,4,6歲牦牛睪丸組織中ATG5蛋白分布于支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。8歲牦牛睪丸組織中,僅觀測到ATG5蛋白位于支持細(xì)胞和精子細(xì)胞,精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞未見ATG5蛋白分布。公牦牛的初情期一般為2歲,種公牦牛配種能力最旺盛的時期為3～7歲,7歲以后生殖能力下降。這與本研究結(jié)果一致,推測牦牛睪丸組織中ATG5蛋白的表達(dá)與公牦牛生殖能力正相關(guān),并且ATG5蛋白在牦牛睪丸組織中的表達(dá)極有可能受到下丘腦-垂體-性腺軸及相關(guān)激素的調(diào)控。