D型流感病毒NP蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備

肖雨晴,程嬌嬌,孫銳瑤,陳妍希,譙薇美,尹 鑫,遠立國,李守軍,盧 剛*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室,廣東 廣州 510642;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江 哈爾濱 150069)

D型流感是由D型流感病毒(influenza D virus,IDV)引起的接觸性傳染病,主要引起宿主的呼吸道癥狀或呼吸道炎癥,也可引起病毒血癥。D型流感使宿主抵抗力下降,導(dǎo)致其他病原微生物的繼發(fā)感染,給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重損失[1-2]。

IDV是有包膜、單股、分節(jié)段的負鏈RNA病毒,屬于正黏屬病毒科(Orthomyxouiridae),丁(D)型流感病毒屬(Deltainfluenza virus)[3],但其抗體與甲(A)型流感病毒(influenza A virus,IAV)、乙(B)型流感病毒(influenza B virus,IBV)、丙(C)型流感病毒(influenza C virus,ICV)均無交叉反應(yīng)[4]。其感染宿主范圍較廣,研究表明牛是IDV的天然宿主[5],也可感染馬、野豬、水牛、駱駝甚至人[6-7]。IDV流行范圍廣闊,近幾年有進一步發(fā)展蔓延的趨勢,必須警惕其對畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生安全的威脅[8-9]。目前IDV的診斷方法主要采用病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷技術(shù)(主要包括血凝試驗和血凝抑制試驗)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)(主要包括RT-PCR和熒光定量RT-PCR)[1]。

IDV基因組約為12 800 bp,由7個RNA片段構(gòu)成,分別為PB2、PB1、P3、HEF、NP、P42(M)和NS,每個RNA片段都編碼具有相應(yīng)功能的蛋白[4]。NP基因長度為1 775 bp,編碼大小約為61 kDa的核衣殼蛋白。該蛋白與聚合酶復(fù)合物作用形成核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein complex,RNP),在病毒的復(fù)制以及翻譯過程中具有關(guān)鍵作用[10]。此外,NP通過一些其他機制在病毒復(fù)制適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用,包括免疫逃避、細胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)以及與其他一些宿主因子的相互作用[11-14]。本研究對IDV NP片段進行原核表達并制備多克隆抗體,為IDV蛋白水平研究和探索奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體pET-B2M載體和TreliefTM5α感受態(tài)細胞(TreliefTM5α chemically competent cell)購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;2株IDV毒株(D/bovine/Mississippi/c00046N/2014、D/swine/Oklahoma/1334/2011)NP蛋白的真核表達質(zhì)粒pCAGGs-BovineNP、pCAGGs-SwineNP由本教研室分別構(gòu)建并保存。

A.上清、沉淀蛋白SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白Marker;1.上清蛋白;2.沉淀蛋白);b.純化后沉淀蛋白SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白Marker;3.純化后沉淀蛋白)

A.純化后重組NP蛋白多克隆抗體SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白Marker;1.純化后重組NP蛋白多克隆抗體);b.純化后重組NP蛋白多克隆抗體Western blot驗證結(jié)果(M.蛋白Marker;2.免前抗體孵育;3.純化后抗體孵育)

1.2 細胞和病毒人胚腎細胞(HEK-293T)、牛腎細胞(MDBK)由本教研室保存。D/bovine/Mississippi/c00046N/2014毒株由本教研室保存。

1.3 主要試劑和儀器BsmBⅠ-v2等限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自美國NEB公司;DL5000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司;TS-GelRed核酸凝膠染料購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;親和層析柱購自武漢匯研生物公司。本研究使用的主要儀器蛋白轉(zhuǎn)印設(shè)備、SDS-PAGE設(shè)備均購自美國BIO-RAD公司。

1.4 NP原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建根據(jù)IDV NP編碼區(qū)序列及pET-B2M質(zhì)粒序列,設(shè)計引物進行PCR擴增。以公司合成的牛源(D/bovine/Mississippi/c00046N/2014)作為模板,通過PCR技術(shù)獲得牛源IDV NP片段的擴增產(chǎn)物。

高保真PCR反應(yīng)體系:模板DNA 2 μL,上、下游引物各2 μL,Phanta Max super-Fidelity 1 μL,dNTP Mix 1 μL,2×Phanta Max Buffer 25 μL,無酶水補至50 μL。高保真PCR反應(yīng)程序: 96℃ 3 min預(yù)變性;96℃ 15 s變性,55℃ 15 s退火,72℃ 15～30 s/kb延伸,35個循環(huán); 72℃延伸5 min,12℃保存。PCR產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳條帶大小鑒定并回收。

用BsmBⅠ-v2對PCR 產(chǎn)物進行酶切處理后,將其克隆至原核表達載體 pET-B2M,構(gòu)建pET-B2M-NP原核表達載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TreliefTM5α感受態(tài)細胞,于恒溫細菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h提取重組質(zhì)粒。

M.蛋白Marker;1.pCAGGs-BovineNP;2.pCAGGs-SwineNP;3.陰性對照

1.5 NP多克隆抗體的制備

1.5.1驗證NP蛋白的表達及可溶性 將重組陽性質(zhì)粒pET-B2M-NP轉(zhuǎn)化TreliefTM5α感受態(tài)細胞,取含pET-B2M-NP的100 μL菌液加入100 mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中,恒溫搖床過夜培養(yǎng)至D600 nm≈0.6。加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.5 mmol/L,30℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。8 000 r/min離心3 min沉淀菌體,用預(yù)冷的NTA-0緩沖液重懸菌體,冰浴30 min后超聲破碎,4℃ 16 000 r/min離心50 min,取少量上清、沉淀,分別進行SDS-PAGE檢測,其余保存至4℃。

1.5.2NP蛋白純化 參考1.5.1進行菌液的誘導(dǎo)表達,收集菌體沉淀。使用6 mol/L鹽酸胍4 mL重懸包涵體,加DTT至濃度為5 mmol/L,恒溫培養(yǎng)3 h促使包涵體完全溶解。4℃ 10 000 r/min離心10 min,取適量上清進行SDS-PAGE檢測。采用鎳柱親和層析的方法純化蛋白。

1.5.3動物免疫及效價檢測 抗原乳化后進行免疫兔試驗,2只實驗兔,免疫流程如表1所示,免疫后進行多克隆抗體效價測定。

表1 NP蛋白免疫流程

1.5.4抗體純化 使用親和層析法純化NP多克隆抗體,收集洗脫物至檢測無蛋白流出,調(diào)節(jié)洗脫物pH至中性,經(jīng)10 kDa超濾管,將洗脫物濃縮至3 mL左右。使用0.01 mol/L(pH=7.4)PBS 5 L過夜透析,次日換液1次,后透析6 h。隨后進行SDS-PAGE電泳,同時測定抗體濃度。

1.6 多克隆抗體Western blot、間接免疫熒光驗證試驗

1.6.1Western blot驗證試驗 將293T細胞均勻鋪至6孔細胞培養(yǎng)板,使用pCAGGs-BovineNP、pCAGGs-SwineNP質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。將表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,使用碧云天快速封閉液,常溫封閉15 min。加入適量提前稀釋好的NP(NP抗體∶抗體稀釋液=1∶5 000)抗體,4℃孵育16 h。PBST清洗3遍,加入二抗,避光條件常溫孵育1 h?；厥斩?使用PBST避光清洗3遍,再進行掃膜觀察。

1.6.2間接免疫熒光驗證試驗 將MDBK細胞均勻鋪至6孔細胞培養(yǎng)板,細胞密度達60%～70%時,棄去舊培養(yǎng)基,使用PBS緩慢清洗1遍,然后將IDV病毒液600 μL加入到6孔板內(nèi),在37℃培養(yǎng)箱孵育1 h,棄去廢液,無菌PBS清洗2遍,加入2 mL含有0.5 mg/L TPCK-trypsin、1% FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在病毒感染36 h后進行間接免疫熒光試驗。加入適量4%多聚甲醛進行細胞固定,固定后使用適量碧云天快速封閉液,4℃封閉15 min。加入適量稀釋的NP抗體(NP抗體∶抗體稀釋液=1∶500),4℃孵育12～16 h。PBST清洗3遍,加入二抗,避光條件常溫孵育1 h?；厥斩?使用PBST避光清洗3遍,再加入DAPI染色液,常溫下避光孵育5 min。最后使用TBST常溫、避光清洗3 min,重復(fù)3遍后避光進行免疫熒光的觀察。

2 結(jié)果

2.1 NP序列分析對IDV NP編碼區(qū)序列進行跨膜區(qū)分析、信號肽分析、疏水性分析、抗原性分析及結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果如圖1所示。

NP基因編碼552個氨基酸,無跨膜區(qū)、無信號肽序列,500～552氨基酸為連續(xù)無序性,可能會影響蛋白表達;局部親水性較好;以免疫原分析發(fā)現(xiàn)全長蛋白抗原的指數(shù)得分適中,理論上可產(chǎn)生較好免疫;從同源性及抗體制備需求分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白在IDV中保守性較好,與實驗動物蛋白同源性很低,具備較高的免疫原性;綜上所述,選擇1～500氨基酸作為抗原區(qū)段,進行重組NP蛋白的制備。

2.2 重組NP蛋白的表達、可溶性鑒定及純化陽性菌液經(jīng)過誘導(dǎo)后,取部分菌液破碎、離心,對上清、沉淀進行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖2a所示,上清和沉淀中均有目的蛋白(72 kDa)的表達,且沉淀中目的蛋白表達量高于上清。沉淀蛋白純化結(jié)果如圖2b所示。

2.3 多克隆抗體效價測定所獲得多克隆抗體按照表2、3所示梯度稀釋,進行間接ELISA檢測。2只實驗兔血清效價均超過1∶100 000,編號001實驗兔血清滴度為1 024 000,編號002實驗兔血清滴度為128 000,且D抗體血清/D免疫前血清都大于2.0。

表2 多克隆抗體效價檢測表

表3 多克隆抗體效價檢測表

2.4 多克隆抗體純化及Western blot、間接免疫熒光驗證重組NP蛋白多克隆抗體經(jīng)過純化后,其SDS-PAGE結(jié)果如圖3a,標(biāo)記的1號泳道為純化后重組NP蛋白多克隆抗體,抗體純化質(zhì)量濃度為10 g/L。純化后的抗體與重組抗原Western blot檢測(圖3b),2號泳道為免疫前抗體孵育,3號泳道為純化后抗體孵育。在約70 kDa處有特異性識別,與預(yù)期信號相符,且條帶相對單一。

使用pCAGGs-BovineNP、pCAGGs-SwineNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞24 h后進行Western blot試驗驗證所制備多抗的免疫反應(yīng)性,檢測結(jié)果如圖4所示,在61 kDa附近有單一條帶。使用病毒感染MDBK細胞后進行間接免疫熒光試驗,間接免疫熒光試驗結(jié)果如圖5所示,可以看到經(jīng)病毒感染后的細胞中有明顯的綠色熒光。表明本研究中制備的NP多克隆抗體能夠用來檢測IDV。

3 討論

2011年,首次于美國報道從表現(xiàn)呼吸道癥狀的豬群中分離出IDV[15],隨后的研究表明IDV廣泛流行于牛群中[3]。除在牛群血清中檢測到IDV抗體外,小型反芻動物、家禽、馬、野豬等血清樣品中也檢測出少數(shù)IDV抗體陽性,表明IDV可感染多種動物[16-18],試驗條件下,IDV還可以感染雪貂和豚鼠[4,19]。雖然目前沒有IDV感染人的報道,但研究表明IDV能夠在人氣道上皮細胞內(nèi)(human airway epithelial cells,hAECs)高效復(fù)制。IDV還能在用于研究人源流感病毒的動物模型體內(nèi)復(fù)制[4,19]。此外,有研究證明在有IDV疫情牛場的工作人員中,其血清中IDV抗體陽性率比普通人群高[20]。這些研究均表明IDV具有感染人的潛在風(fēng)險,必須警惕其對公共衛(wèi)生安全的威脅并重視其后續(xù)研究。

IDV可引起宿主呼吸道癥狀甚至病毒血癥,進而導(dǎo)致其他呼吸道疾病的嚴(yán)重繼發(fā)感染,臨床病理表現(xiàn)復(fù)雜,因此需要實驗室檢測來進行確診。血凝抑制試驗是流感病毒常用的血清學(xué)檢測方法,但其針對的靶蛋白是HA;而HA蛋白時常為了逃避免疫而發(fā)生抗原漂移,導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)抗體血清與流行株的交叉反應(yīng)能力下降[21],最終造成血凝抑制試驗的靈敏度下降。

與ICV一樣,IDV由7個RNA片段構(gòu)成,共編碼PB2、PB1、P3、HEF、NP、P42(M)和NS等多個蛋白,但其與ICV的氨基酸相似性僅約50%。與IAV和IBV病毒粒子表面均有血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)2個糖蛋白不同,IDV病毒粒子表面只含有1個糖蛋白,即HEF。根據(jù)IDV的HEF片段基因組差異可將其劃分為5個譜系,即:D/OK、D/660、D/Yama/2016、D/Yama/2019、D/California/2019[22]。由于流感病毒表面糖蛋白對其致病性和宿主感染方面具有重要作用,因此目前研究較多的是IDV的HEF蛋白。

NP蛋白是IDV復(fù)制中不可或缺的蛋白,其參與RNA的包裝、核轉(zhuǎn)運、vRNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制以及病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。且與易變異的NA和HA蛋白相比,流感病毒NP蛋白具有高序列保守性[23]。NP蛋白的單克隆抗體常被用于流感病毒的血清學(xué)與分子生物學(xué)檢測[24-25]。而多克隆抗體具有制備簡單、耗費時間短、花費較少等優(yōu)點,因此本研究旨在對IDV NP蛋白進行原核表達并制備多克隆抗體,為IDV快速診斷技術(shù)和后續(xù)蛋白水平研究奠定基礎(chǔ)。

本研究通過對IDV N基因進行序列分析,選定無跨膜區(qū)和信號肽序列的1～500氨基酸區(qū)段為制備重組NP蛋白的最佳抗原區(qū)段;構(gòu)建了pET-B2M-NP重組陽性質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達了相對分子質(zhì)量約為72 kDa的重組NP蛋白。免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體,間接ELISA結(jié)果顯示抗體效價超過1∶100 000;在Western blot與間接免疫熒光試驗中均能有效檢測出陽性結(jié)果,表明本研究制備了免疫原性和特異性良好的兔抗NP多克隆抗體。IDV NP蛋白多克隆抗體的制備為研究NP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了條件,對于后續(xù)開展IDV研究具有重大意義。