高靈敏 HBV DNA 試劑定量下限與檢測(cè)下限誤用可能影響慢性HBV感染的正確診療

肖麗 彭海林 王蔚 薛榮榮 官正喜 咸建春

慢性HBV感染仍是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。及時(shí)啟動(dòng)抗病毒治療是降低慢性HBV感染危害的主要方式。近年來(lái)抗病毒適應(yīng)證不斷擴(kuò)大,低病毒血癥(LLV)甚至極低病毒血癥(VLLV)的臨床意義越來(lái)越受到關(guān)注,且血清HBV DNA陽(yáng)性作為自然史分期與啟動(dòng)抗病毒治療的主要依據(jù)[1-3],準(zhǔn)確定量血漿或血清中HBV DNA水平對(duì)于診斷HBV感染、指導(dǎo)治療決策、評(píng)估預(yù)后、監(jiān)測(cè)抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答和耐藥性的發(fā)生至關(guān)重要[4]。國(guó)內(nèi)外指南或共識(shí)均推薦高靈敏技術(shù)用于HBV DNA檢測(cè)[1,2,4,5]。但通常所說(shuō)的高靈敏HBV DNA檢測(cè)術(shù)語(yǔ)在相關(guān)指南、共識(shí)及許多文獻(xiàn)中的應(yīng)用與解釋并不規(guī)范或可能存在錯(cuò)誤,影響這一方法在臨床與研究中的準(zhǔn)確應(yīng)用。本文根據(jù)該技術(shù)的性能并結(jié)合臨床實(shí)踐與相關(guān)文獻(xiàn)闡述其相關(guān)術(shù)語(yǔ)可能存在的誤用現(xiàn)象及正確應(yīng)用的重要性。

一、高靈敏HBV DNA檢測(cè)方法有多種,檢測(cè)下限多在2.1～9.0 IU/mL

在我國(guó),高靈敏HBV DNA檢測(cè)主要針對(duì)長(zhǎng)期廣泛使用的HBV DNA定量檢測(cè)試劑靈敏度相對(duì)較低(也稱為“普敏”)而言。從術(shù)語(yǔ)命名考慮,除常用的“高靈敏”外,尚有“高精度”等[6];從定量單位考慮,既往常用“拷貝/mL”,目前多應(yīng)用“IU/mL”,大約5拷貝/mL相當(dāng)于1 IU/mL[7]。一般認(rèn)為,相對(duì)于普通的HBV DNA檢測(cè),高靈敏HBV DNA檢測(cè)具有更低的檢測(cè)下限和較廣的線性范圍[8]。其中的“更低”和“較廣”也是相對(duì)的概念,并無(wú)嚴(yán)格的界定。檢測(cè)下限(LLOD或LOD)有時(shí)也用來(lái)表示“靈敏度(sensitivity)”,是指樣品中的被分析物能被以適當(dāng)方法與概率(95%以上[9])檢測(cè)到但又難以精確量化的最低值或最低檢出限。因?yàn)槠涠x更精確、使用頻率更高,所以被認(rèn)為是評(píng)價(jià)檢測(cè)能力的首選術(shù)語(yǔ)[9,10]。定量下限(LLOQ)也被稱為“測(cè)量范圍的下限(lower end of the measuring range)”,是指樣品中的被分析物能夠在特定的實(shí)驗(yàn)條件下被定量測(cè)定的最低量,其檢測(cè)結(jié)果具有可接受的準(zhǔn)確度和真實(shí)性[10],是結(jié)果符合試劑準(zhǔn)確度要求的最低病毒水平[9]?？梢詫?duì)分析物的濃度直接檢測(cè)測(cè)量(定量)分析的范圍的值為線性范圍,通常其低限為L(zhǎng)LOQ,高限為定量上限(ULOQ)。國(guó)內(nèi)常用的普通HBV DNA檢測(cè)的LLOQ多為100～500 IU/mL,高靈敏HBV DNA檢測(cè)的LLOQ可低至10～26 IU/mL,ULOQ為108～109IU/mL,而其LLOD可低至2.1～9.0 IU/mL,甚至更低[11]。如Abbott實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)LLOD可達(dá)1.48 IU/mL[12]。上述性能參數(shù)給定的數(shù)值或范圍一般由制造商根據(jù)有關(guān)指南設(shè)定,相互之間的關(guān)系見圖1。

與高靈敏HBV DNA檢測(cè)相關(guān)的分子技術(shù)包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等,以PCR技術(shù)為主[13]。雖然不同檢測(cè)方法在標(biāo)本用量、LLOD、LLOQ、線性范圍、循環(huán)所需時(shí)間、引物和探針?biāo)邢虻牟《緟^(qū)域稍有不同,但經(jīng)對(duì)比研究,總體一致性良好,均具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍廣、基因包容性好以及快速、可重復(fù)、準(zhǔn)確的特點(diǎn),其相關(guān)術(shù)語(yǔ)、檢測(cè)結(jié)果及其報(bào)告方式相互之間也較統(tǒng)一[11,14-17]。但具體應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意檢測(cè)方法及適用的平臺(tái)/系統(tǒng)可能導(dǎo)致結(jié)果的適度差異。臨床應(yīng)用較廣泛的HBV DNA檢測(cè)方法的性能見表1(主要根據(jù)相關(guān)檢測(cè)方法說(shuō)明書)。

表1 部分高靈敏HBV DNA檢測(cè)試劑性能參數(shù)對(duì)比

二、檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告類型有四種,檢測(cè)到病毒但“低于定量下限者”易被誤解為HBV DNA陰性

表2 不同檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告方式及解讀

三、“定量下限”常被用作“檢測(cè)下限”或“參考下限”

HBV DNA檢測(cè)的LLOD與LLOQ是不同的,但LLOQ常常被誤標(biāo)為L(zhǎng)LOD,這種現(xiàn)象不僅出現(xiàn)于一般文獻(xiàn)中[2,3,16,20-28],甚至也出現(xiàn)于指南/共識(shí)中[2,28,29]。其中對(duì)靈敏度(sensitivity)理解也可能存在錯(cuò)誤,因?yàn)闄z測(cè)的靈敏度對(duì)應(yīng)于LLOD,而不是LLOQ。對(duì)于檢驗(yàn)來(lái)說(shuō)靈敏度尚可分為分析靈敏度、功能靈敏度,其中分析靈敏度對(duì)應(yīng)于LLOD,功能靈敏度對(duì)應(yīng)于LLOQ[10]。由于將LLOD誤標(biāo)為L(zhǎng)LOQ,以致在同一文獻(xiàn)中出現(xiàn)方法與結(jié)果的矛盾,如有研究文中標(biāo)注其靈敏度為20 IU/mL,但從研究樣本中檢測(cè)出10～20、< 10 IU/mL的陽(yáng)性結(jié)果[27]。以上誤標(biāo)在我國(guó)指南(2022年版)[1]已加以注意并作相應(yīng)修改,Ortonne 等[11]及Yan等[16]在其相關(guān)文獻(xiàn)中也對(duì)此有所區(qū)別。近期發(fā)布的《乙型肝炎病毒標(biāo)志物臨床應(yīng)用專家共識(shí)》[30]雖然將靈敏度對(duì)應(yīng)于LLOD,但其標(biāo)定的滴度值仍可能是LLOQ,值得臨床學(xué)習(xí)或應(yīng)用時(shí)加以注意。因?yàn)樵诔Ｓ眠M(jìn)口與國(guó)產(chǎn)檢測(cè)方法中,LLOD多數(shù)已經(jīng)≤ 10 IU/mL,見表1。

“定量下限”誤用為“檢測(cè)下限”不僅可能與醫(yī)技、臨床科室重視不夠有關(guān),也可能與有些檢測(cè)公司長(zhǎng)期以來(lái)所發(fā)報(bào)告的錯(cuò)誤標(biāo)注與解釋不嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)。如在某公司的報(bào)告中,將本是LLOQ的“10 IU/mL”標(biāo)注為L(zhǎng)LOD,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果“< 10 IU/mL”作出“檢測(cè)到HBV DNA,但低于檢測(cè)下限”的自相矛盾解釋。此外,臨床檢驗(yàn)報(bào)告也有些模糊的標(biāo)識(shí),如只標(biāo)“檢測(cè)下限”、“參考區(qū)間”、“參考范圍”、“參考值”等。

四、LLOQ作為L(zhǎng)LOD對(duì)臨床診療的可能影響

第一,因血清HBV DNA陽(yáng)性已作為HBV感染自然史分期、臨床診斷與啟動(dòng)抗病毒的重要依據(jù)[1,2],故若僅以≥LLOQ作為HBV DNA陽(yáng)性的依據(jù),則必然遺漏一部分檢測(cè)到病毒但無(wú)法進(jìn)行定量的HBV DNA陽(yáng)性甚至需要治療的感染者。第二,LLV的臨床意義越來(lái)越受到關(guān)注,其定義的基本依據(jù)即是“檢測(cè)到,但<2 000 IU/mL”[20],從嚴(yán)謹(jǐn)角度出發(fā),檢測(cè)到即應(yīng)屬“HBV DNA陽(yáng)性”;若臨床將LLOQ誤標(biāo)為L(zhǎng)LOD,也將導(dǎo)致LLV的漏診。第三,對(duì)隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)診斷的影響:OBI的血清學(xué)診斷定義為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陰性者的血液中檢測(cè)到有復(fù)制能力的HBV DNA[28]。OBI血液中HBV DNA載量通常很低,當(dāng)檢測(cè)到時(shí),濃度通常< 200 IU/mL(約1000拷貝/mL),其中至少90%以上OBI患者的血清中HBV DNA水平< 20 IU/mL[19],且血液學(xué)檢測(cè)方法是其診斷的常用方法[28],故檢測(cè)方法的靈敏度(LLOD)對(duì)OBI的診斷至關(guān)重要。同樣的人群,檢測(cè)方法的LLOD越低檢出率越高,有些檢出率不同則要?dú)w結(jié)于對(duì)LLOQ與LLOD的誤用。若將LLOQ誤解為L(zhǎng)LOD,并將低于LLOQ判讀為HBV DNA陰性,則必然導(dǎo)致OBI的漏診[31]。第四,對(duì)“HBV DNA陽(yáng)性”定義的影響。理論上只要血漿/血清中HBV DNA載量高于LLOD即可算檢測(cè)到HBV DNA(>95%)[9,11],就應(yīng)該是“HBV DNA陽(yáng)性”,但由于目前對(duì)LLOD與LLOQ認(rèn)識(shí)的模糊,“HBV DNA陽(yáng)性”定義為“>LLOD”還是“>LLOQ”還沒(méi)有明確統(tǒng)一的規(guī)定,因而,不同程度影響臨床決策與文獻(xiàn)資料的合并。

綜上所述,隨著2016年WHO提出“2030年消除病毒性肝炎作為公共衛(wèi)生危害”的目標(biāo),國(guó)內(nèi)外指南或共識(shí)對(duì)于慢性乙型肝炎抗病毒治療的適應(yīng)證均已逐步放寬或簡(jiǎn)化,并有“只要HBV DNA陽(yáng)性即開始抗病毒治療”的趨勢(shì)[1,4,32-34]。故高靈敏HBV DNA檢測(cè)在準(zhǔn)確定量血漿或血清中HBV DNA水平以達(dá)到有效管理HBV感染中起到關(guān)鍵作用。但若在臨床科研與實(shí)踐、相關(guān)文獻(xiàn)中,將LLOQ誤用為L(zhǎng)LOD,則不僅可能降低HBV感染的診斷率與治療率,影響研究結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性,也給文獻(xiàn)閱讀者獲取知識(shí)帶來(lái)障礙。故應(yīng)重視并正確認(rèn)識(shí)、理解高靈敏HBV DNA 檢測(cè)的相關(guān)術(shù)語(yǔ),同時(shí),也建議對(duì)HBV DNA“陽(yáng)性”、“檢測(cè)到”等進(jìn)行定義與統(tǒng)一,促進(jìn)指南或共識(shí)建議及時(shí)準(zhǔn)確的臨床轉(zhuǎn)化。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：肖麗:查找、分析文獻(xiàn),撰寫初稿;彭海林:收集文獻(xiàn)、文章撰寫;王蔚、薛榮榮、官正喜:負(fù)責(zé)查找文獻(xiàn),審閱文稿; 咸建春:提出思路,負(fù)責(zé)審閱、修改文稿及最后定稿。