豬精液凍存技術(shù)研究進(jìn)展

陳昱光,李云香,王 嬋,李劍南,賀 鑫,雷安民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,2021年世界生豬存欄量為74928萬(wàn)頭,比2020年上升了15.16%;世界豬肉產(chǎn)量為10 610萬(wàn)t,與2020年相比上升10.81%;預(yù)計(jì)在未來(lái)的幾年里,生豬的需求量將繼續(xù)增長(zhǎng)。為了滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求,除了擴(kuò)大養(yǎng)殖規(guī)模外,對(duì)豬種進(jìn)行不斷地改良更應(yīng)是努力的方向,在相同的養(yǎng)殖規(guī)模下,優(yōu)良的豬種飼料轉(zhuǎn)化率高、出肉率高,這意味著減少了過(guò)量的飼料需求和糞便產(chǎn)生對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響[1]。作為可以幫助生豬養(yǎng)殖業(yè)改良生豬性狀、提高生產(chǎn)效益、維護(hù)生豬遺傳多樣性的關(guān)鍵輔助技術(shù),豬精液的冷凍保存一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

相較于液體保存的精液,冷凍保存的精液具有生物安全性、使用的靈活性以及國(guó)際貿(mào)易的優(yōu)勢(shì),因此在理想情況下,冷凍保存的精液是豬授精的第一選擇。此外,豬精子的冷凍保存技術(shù)也是長(zhǎng)期保留高價(jià)值遺傳資源的關(guān)鍵技術(shù)。但在豬冷凍保存精液的使用中發(fā)現(xiàn),復(fù)蘇后精子存活率較低、質(zhì)量較差,這導(dǎo)致了在實(shí)際生產(chǎn)中出現(xiàn)授精率低、每胎產(chǎn)仔數(shù)達(dá)不到正常標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題,同時(shí)由于冷凍復(fù)蘇后精子受損的影響,也難以保證能否完整保存優(yōu)良種畜的性狀,因此大大妨礙了冷凍保存技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[2]。

1 豬凍精技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 人工授精

人工授精是目前應(yīng)用最廣泛的豬育種技術(shù),在發(fā)達(dá)國(guó)家育種方案中的應(yīng)用率達(dá)90%以上[3]。最常用于人工授精的是液體儲(chǔ)存的精液(包括低溫保存的精液或鮮精),其繁殖性能較好,繁殖率高于90%,每頭授精成功的母豬活產(chǎn)仔數(shù)可達(dá)到12頭以上,與自然交配后獲得的效果相似。

人工授精也可以用冷凍保存的豬精子,盡管冷凍復(fù)蘇后精液的受精能力要比液體儲(chǔ)存的精液低得多。由于豬精子細(xì)胞膜成分的特殊性,導(dǎo)致其冷凍復(fù)蘇后豬精子復(fù)蘇率和質(zhì)量遠(yuǎn)低于牛、羊等其他大型牲畜,因此難以在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。制約豬精液凍存技術(shù)發(fā)展關(guān)鍵因素在于,目前冷凍復(fù)蘇機(jī)制豬精子損傷的機(jī)制并不完善,因此難以針對(duì)化的改良豬精液凍存配方[4]。

目前,養(yǎng)豬業(yè)的人工授精主要依賴(lài)于液體儲(chǔ)存的精液。雖然冷凍精子在某些情況下也被使用,但全球豬基因交換的主要方法仍是通過(guò)活體動(dòng)物的運(yùn)輸。運(yùn)輸活體動(dòng)物的成本相對(duì)較高,還需要花費(fèi)疾病預(yù)防測(cè)量等相關(guān)檢疫費(fèi)用,這限制了豬遺傳信息在全球范圍內(nèi)的交換。而通過(guò)運(yùn)輸冷凍保存的豬精液,可以將成本和風(fēng)險(xiǎn)降至最低。

1.2 凍精技術(shù)

目前已有公司建立了豬精子冷凍保存的商品化方案,針對(duì)主流豬種,可以使復(fù)蘇后精子活率達(dá)到76%～85%,但其妊娠率和每窩仔豬數(shù)量仍達(dá)不到鮮精的標(biāo)準(zhǔn),不足以在生產(chǎn)實(shí)際中進(jìn)行大范圍應(yīng)用,特別是中國(guó)地方豬種,其凍精復(fù)蘇后存活率往往不足40%,這對(duì)我國(guó)的育種保種進(jìn)程有一定的限制[5]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)公豬之間個(gè)體的差異性對(duì)復(fù)蘇后精子活力和質(zhì)量影響顯著。收集并冷凍長(zhǎng)白豬的精液時(shí),觀察到存在30%公豬的精液在復(fù)蘇后表現(xiàn)出非常低的活力。此外,即使是同一頭豬,在不同的時(shí)間、年齡、季節(jié)對(duì)其精液的冷凍保存,復(fù)蘇后也觀察到精液質(zhì)量存在顯著差異。

1.3 種質(zhì)資源的交換與保護(hù)

長(zhǎng)期以來(lái)的市場(chǎng)需求決定了生豬養(yǎng)殖業(yè)對(duì)于料重比高、生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高的豬種的追求,導(dǎo)致了養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)于品種豬的盲目引進(jìn)與雜交利用,極不利于豬種遺傳資源的保存與生態(tài)多樣性的維護(hù)。探索出優(yōu)良的豬精子冷凍技術(shù)與方案,能夠大大降低優(yōu)良品種豬的引進(jìn)成本,同時(shí)也可以有效保存現(xiàn)有的各類(lèi)豬種的種質(zhì)資源。因此,豬凍精技術(shù)的建立,是加強(qiáng)全國(guó)豬種遺傳資源保護(hù)、引進(jìn)優(yōu)良豬種及優(yōu)良種豬育種的必要手段,是保證全國(guó)養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)和必要條件。

2 豬精子損傷機(jī)制的研究

2.1 凍融致豬精子損傷

冷凍復(fù)蘇過(guò)程包括一系列可能改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)的步驟,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損、膽固醇流失、獲能樣變化以及DNA碎片化,還可能破壞二硫鍵導(dǎo)致核蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低[9]。除了冷凍介質(zhì)、溫度和滲透壓變化引起的負(fù)面影響外,冷凍復(fù)蘇過(guò)程還會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)ROS失衡,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化,使細(xì)胞發(fā)生凋亡樣變化和DNA氧化損傷[10]。此外,凍融過(guò)程會(huì)破壞線粒體等細(xì)胞器,降低這些細(xì)胞器的活性,從而影響精子活力[11]。線粒體損傷也增加了活性氧的產(chǎn)生,且造成活性氧水平的升高程度因物種而異。

豬精子經(jīng)歷凍融后還會(huì)導(dǎo)致精子內(nèi)肌動(dòng)蛋白、絲裂霉素和溶質(zhì)載體家族成員等關(guān)鍵蛋白的再分配和重新定位;損害膜離子通道相關(guān)蛋白的功能;并改變特定精子蛋白的酪氨酸磷酸化模式。

2.2 豬精子對(duì)ROS損傷敏感

與新鮮精液相比,低溫保存(17℃)的豬精子和冷凍豬精子的受精能力較低。這是由于處理過(guò)程中的化學(xué)和物理變化,會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)氧化平衡。豬精子內(nèi),高水平ROS產(chǎn)生的病理效應(yīng)的關(guān)鍵要點(diǎn)是造成不飽和脂肪酸(PUFAs)的過(guò)氧化[13]。研究表明,豬精子的質(zhì)膜上富含不飽和脂肪酸,當(dāng)大量的碳碳鍵被ROS氧化就造成了精子內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),這將直接導(dǎo)致豬精子凋亡樣變化的出現(xiàn)[13]。

精子耐低溫性與質(zhì)膜的組成直接相關(guān),特別是膽固醇/磷脂比率和磷脂部分飽和脂肪酸的豐度,因?yàn)檫@些成分決定了精子的膜流動(dòng)性。例如,牛精子比豬精子表現(xiàn)出更高的彈性,這歸因于牛精子中較高的膽固醇/磷脂比率(牛:0.45,野豬:0.26)和較低的蛋白質(zhì)/磷脂比率(牛:0.80,野豬:1.26)[13]。豬精子細(xì)胞膜上含有大量的不飽和脂肪酸,更易在冷凍應(yīng)激誘導(dǎo)的ROS代謝紊亂作用下發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷并發(fā)生鐵死亡,因此,豬精子質(zhì)膜容易不穩(wěn)定,易失去選擇通過(guò)性,允許Ca2+、碳酸氫鹽和培養(yǎng)基成分進(jìn)入胞內(nèi)[13],破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),促進(jìn)蛋白質(zhì)和mRNA的降解,降低精子的存活率[14]。

2.3 可能存在的調(diào)控機(jī)制

根據(jù)研究顯示,細(xì)胞死亡過(guò)程通常受到不同基因的調(diào)控;例如,參與凋亡調(diào)控的一些關(guān)鍵基因是Caspases、TP53、FAS、BCL-2和BAX。調(diào)控鐵死亡的基因包括GPx4、Nrf2、LSH、TFR1和SLC7A11。細(xì)胞壞死受到LEF1、RIP1和RIP3的調(diào)控,最后,自噬進(jìn)程受到ATG5、ATG7、DRAM3和TFEB基因的調(diào)控[14]。因此,針對(duì)性的用細(xì)胞死亡相應(yīng)調(diào)控基因的激活或抑制劑可以有效誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞死亡進(jìn)程。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),冷凍復(fù)蘇所導(dǎo)致的細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化失控與細(xì)胞鐵死亡過(guò)程聯(lián)系密切,是鐵死亡過(guò)程的重要一環(huán)。以往的研究通常會(huì)將凍存復(fù)蘇與豬精子凋亡聯(lián)系到一起,但最近的研究顯示,凍存復(fù)蘇并未引起豬精子內(nèi)DNA片段化和Caspase激活等凋亡現(xiàn)象[15],且凋亡抑制劑并不能緩解豬精子凍存損傷,但鐵死亡抑制劑可以有效抑制膜脂質(zhì)過(guò)氧化和精子死亡,或可以考慮冷凍復(fù)蘇過(guò)程誘導(dǎo)了豬精子細(xì)胞鐵死亡發(fā)生的可能性。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)與生物標(biāo)志物制

精子功能驗(yàn)證的黃金標(biāo)準(zhǔn)是使卵子成功受精并發(fā)育為可存活的胚胎。想要準(zhǔn)確判斷冷凍精子的生殖潛能,需要更好地了解精子的功能。精子功能調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)于優(yōu)化冷凍精子處理方式和維持其生育能力至關(guān)重要。大多數(shù)與受精相關(guān)的分子機(jī)制都依賴(lài)于蛋白質(zhì)的功能,這使得蛋白質(zhì)組學(xué)成為生殖生物學(xué)中最強(qiáng)大的研究工具。因此,對(duì)精液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是了解精子功能生物學(xué)和分析受精能力受損原因的必要條件。導(dǎo)致冷凍豬精子受精能力受損的潛在分子機(jī)制還不明確,精液蛋白質(zhì)組學(xué)在解決這一挑戰(zhàn)中可以發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。

精液蛋白,無(wú)論是來(lái)自精漿還是精子,都是衡量精子功能和生育能力潛在的生物標(biāo)志物,因?yàn)樗鼈冊(cè)谏婕暗骄庸δ苌飳W(xué)的相關(guān)分子途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。精液蛋白的任何定性和定量的改變都可能導(dǎo)致精子受精能力的喪失。研究發(fā)現(xiàn)頂體蛋白、纖維連接蛋白、熱休克蛋白和電壓依賴(lài)的陰離子通道蛋白水平與精子的低溫耐受性呈正相關(guān)[16],而和三磷酸異構(gòu)酶的蛋白水平呈負(fù)相關(guān)[29]。此外,評(píng)估冷凍保存對(duì)整個(gè)精子蛋白質(zhì)組的影響也是優(yōu)化冷凍過(guò)程的必要條件。最近發(fā)表的兩項(xiàng)比較新鮮和冷凍復(fù)蘇公豬精子蛋白質(zhì)組學(xué)的研究顯示,在新鮮精子和冷凍精子之間鑒定出41個(gè)定量不同的蛋白質(zhì),以及32個(gè)在超低溫保存過(guò)程經(jīng)歷相關(guān)豐度變化的蛋白質(zhì)[17]。這些結(jié)果清楚地表明,低溫保存重塑了公豬精子的相應(yīng)蛋白質(zhì),這也與其他物種哺乳動(dòng)物中進(jìn)行的研究結(jié)論相符合[18]。以上的結(jié)果都為冷凍精子受損機(jī)制的研究提供了潛在的標(biāo)志物。當(dāng)然,在這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于該領(lǐng)域之前,必須進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證,包括蛋白質(zhì)印記(Western blot,WB)、ELISA等,以確保所鑒定的蛋白質(zhì)可以作為可靠的生物標(biāo)志物。

3 豬精子冷凍技術(shù)改善手段

3.1 前期處理時(shí)間

有研究表明,精子在收集后不立即冷凍,冷凍保存的結(jié)果會(huì)更好。冷凍前在15～17℃孵育持續(xù)3 h以上能夠優(yōu)化凍存效果,而這種優(yōu)化處理的最佳時(shí)間段是10～24 h[19]。這一時(shí)期可以通過(guò)平衡或維持精子的脂質(zhì)結(jié)構(gòu),從而有助于質(zhì)膜的穩(wěn)定。但精子在該時(shí)期變得更耐低溫的詳細(xì)機(jī)制仍未闡明,研究人員推測(cè)與熱應(yīng)激相關(guān)的精子蛋白(如熱休克蛋白70)的磷酸化有關(guān)。

3.2 抗氧化劑

迄今為止,許多研究證實(shí)了在冷凍介質(zhì)中補(bǔ)充抗氧化劑可以抵消ROS對(duì)精子的負(fù)面影響。現(xiàn)階段絕大多數(shù)的研究集中于在豬精子冷凍介質(zhì)中添加合成或天然抗氧化劑,這的確對(duì)維持豬精子功能產(chǎn)生了積極的作用。在整個(gè)精子冷凍復(fù)蘇的步驟中,精子會(huì)在每個(gè)不同的溫度變化階段,包括從室溫至17℃(冷凍前孵育階段)、17℃至4℃(冷卻步驟結(jié)束,冷凍步驟開(kāi)始前)、從冷凍狀態(tài)至37℃(解凍后),重新達(dá)到熱平衡狀態(tài),在此過(guò)程中精子所處的液體環(huán)境和處理時(shí)間也有所不同,因此在開(kāi)發(fā)新的精子冷凍復(fù)蘇策略時(shí),可以考慮在孵育液、解凍液以及授精培養(yǎng)基也添加抗氧化劑來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化方案[20]。

3.3 冷凍保護(hù)劑

可滲透性冷凍保護(hù)劑有甘油、二甲基亞砜、乙二醇、甲醇、丙二醇和二甲基乙酰胺等[21]。其中甘油是豬精子的最佳滲透性冷凍保護(hù)劑,其最佳作用濃度在2%～3%之間[6]。蛋黃和乳糖則是最常見(jiàn)的不滲透性冷凍保護(hù)劑,用作豬精子的冷凍延長(zhǎng)劑。在蛋黃提取物中發(fā)現(xiàn)的磷脂可以防止精子發(fā)生冷休克和Ca2+內(nèi)流,而蛋黃的低密度脂蛋白部分表現(xiàn)出最好的低溫保護(hù)功能。此外,使用表面活性劑,如 Orvus ES Paste,可以促進(jìn)蛋黃蛋白與質(zhì)膜的相互作用,當(dāng)與蛋黃共用時(shí)可以改善精子冷凍效果[22]。但需要注意的是冷凍保護(hù)劑在常溫下會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活起到不利的影響,所以通常會(huì)在4℃平衡階段加入以減少毒害作用。

3.4 精漿

通常精漿會(huì)在冷凍保存前被移除,因?yàn)檠芯咳藛T認(rèn)為精漿的存在會(huì)降低精子復(fù)蘇后的存活率。然而,并不是所有來(lái)自精漿的蛋白質(zhì)都對(duì)精子有害。有研究指出僅去除低分子量蛋白質(zhì)(12～14 ku)可改善冷凍保存效果,而添加精漿中部分物質(zhì)至冷凍介質(zhì)中可增加冷凍精子的活力和膜完整性[23]。

復(fù)蘇后加入精漿是否對(duì)精子有利存在對(duì)立的結(jié)果。一些研究人員指出,精漿對(duì)復(fù)蘇后精子活力和膜完整性有積極影響,也有研究結(jié)果表明加入精漿后精子頂體和膜完整性下降[24]。這種矛盾的結(jié)果同樣也出現(xiàn)在對(duì)復(fù)蘇精子生殖性能的研究中,有研究表明復(fù)蘇后添加精漿可提高精子生殖性能[25],而另外一些研究則顯示這種處理無(wú)明顯差異甚至有不利影響。這些矛盾的結(jié)果可能歸因于添加精漿的比例,因?yàn)樘砑?0%的精漿(復(fù)蘇后4 h精子活力30%)效果明顯比添加10%精漿(復(fù)蘇后4 h精子活力20%)要更好[25]。

3.5 凍精的儲(chǔ)存

雖然檢測(cè)同批次冷凍效果好和效果差的豬精液后發(fā)現(xiàn)其脂質(zhì)過(guò)氧化水平和復(fù)蘇后ROS總量沒(méi)有顯著差異,但有報(bào)道稱(chēng)液氮存儲(chǔ)會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,這可能會(huì)對(duì)低溫保存樣品的壽命造成影響[26]。Li J等分別對(duì)冷凍儲(chǔ)存2年,4年和8年的同一批豬精液質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估,并與早期復(fù)蘇結(jié)果(冷凍后15 d)進(jìn)行比較。與冷凍后15 d復(fù)蘇的精子樣本相比,冷凍儲(chǔ)存4或8年的精子樣品中總精子活力有所下降。值得注意的是,研究結(jié)果表明多于2年的冷凍儲(chǔ)存時(shí)間會(huì)對(duì)豬精子運(yùn)動(dòng)能力造成不利影響,因此在做人工授精時(shí)需要額外增加精液數(shù)量[26]。

4 討論

目前用冷凍復(fù)蘇的公豬精子進(jìn)行人工授精多是作為品種改良的手段在養(yǎng)殖場(chǎng)中小范圍使用[27]。豬精子冷凍保存的主要優(yōu)點(diǎn)是可以?xún)?chǔ)存來(lái)自?xún)?yōu)良性狀公豬的遺傳物質(zhì);構(gòu)建種質(zhì)庫(kù)以防自然災(zāi)害(如豬瘟導(dǎo)致的大面積撲殺)所造成的遺傳信息丟失;并且相較于鮮精和活體運(yùn)輸,冷凍保存的豬精子極大地促進(jìn)了優(yōu)良豬種遺傳信息在國(guó)際之間交流的同時(shí),也具備更高的生物安全性[28]。相信在不久的將來(lái),冷凍保存的精子在實(shí)踐生產(chǎn)中可以得到更廣泛的應(yīng)用。

最新的研究進(jìn)展顯示,冷凍復(fù)蘇的豬精子進(jìn)行人工授精后的生育結(jié)果已經(jīng)得到了改善,但迄今為止,最先進(jìn)的凍精技術(shù)依然避免不了低溫保存對(duì)精子本身的負(fù)面影響,人工授精后效果達(dá)不到鮮精的標(biāo)準(zhǔn)。這主要是凍存致豬精子損傷的分子機(jī)制仍不明確所導(dǎo)致[29],未來(lái)豬精子凍存技術(shù)的改進(jìn),除了于冷凍精子所處液體環(huán)境中添加抗氧化劑外,或可將目光對(duì)準(zhǔn)于凍存致精子細(xì)胞死亡的相關(guān)機(jī)理研究以及利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)闡明凍精受損的潛在分子機(jī)制上來(lái)。