小鼠腎缺血再灌注損傷模型的研究進(jìn)展*

閆聚瀚 趙朋濤 閆曉冬 劉鑫 綜述 李向東 審校

(1.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院,河北 張家口 075000;2. 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院,河北 張家口 075000)

腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury,IRI)是指腎組織經(jīng)缺血缺氧處理再恢復(fù)其血液供應(yīng)后造成腎臟出現(xiàn)損傷的一種病理生理過(guò)程,腎IRI發(fā)生后,隨著腎臟物質(zhì)代謝、結(jié)構(gòu)和功能損傷程度逐步加重,甚至可能會(huì)引起一系列不可逆的損傷[1]。而且腎臟是人體內(nèi)一個(gè)對(duì)缺血缺氧環(huán)境非常敏感的強(qiáng)血液灌注器官,腎IRI會(huì)誘發(fā)炎癥因子過(guò)表達(dá)、氧化應(yīng)激、Ca2+超載及細(xì)胞線粒體自噬而發(fā)生急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)[2-3],其中休克、敗血癥、腎移植是造成AKI的主要原因,嚴(yán)重的AKI甚至?xí)l(fā)展成慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD),最終導(dǎo)致器官衰竭而危及生命[4-5]。有研究[6-7]報(bào)道,近年來(lái)AKI的發(fā)病率和死亡率不斷上升,臨床AKI發(fā)病率估計(jì)在20%。故腎臟的缺血缺氧仍是AKI發(fā)病的重要因素之一,且目前針對(duì)AKI的治療措施仍不完善,這不僅增加了患者的負(fù)擔(dān),還加重了臨床工作的壓力,目前臨床工作者和研究人員仍在通過(guò)動(dòng)物模型建造的不斷完善以進(jìn)一步探索更有效的治療方法[8]。

近幾年以來(lái),隨著AKI與CKD臨床患者人數(shù)的增加以及科研工作的需要,對(duì)腎IRI的研究受到了越來(lái)越多科研人員的關(guān)注,他們分別使用了不同的實(shí)驗(yàn)建模方法對(duì)腎IRI進(jìn)行了研究[9-10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn),腎IRI模型主要包括用于研究組織細(xì)胞學(xué)的體外模型以及用于研究其機(jī)制、腎功能指標(biāo)監(jiān)測(cè)、炎癥因子和不同通路作用的體內(nèi)模型。但是,體外模型建立條件相對(duì)簡(jiǎn)易方便以及在模擬人整體性和復(fù)雜性方面存在著明顯的局限性,而體內(nèi)模型的建立雖較為復(fù)雜,但更多的應(yīng)用于科學(xué)研究。小鼠腎IRI體內(nèi)模型多采取背部切口和腹部切口的手術(shù)方式,主要通過(guò)雙側(cè)鉗夾腎蒂、單側(cè)鉗夾腎蒂兩種方式模擬腎IRI,從而對(duì)腎IRI進(jìn)行進(jìn)一步的研究。自上世紀(jì)90年代以來(lái),建立小鼠模型研究腎IRI的方法受到越來(lái)越多研究者們的青睞,而且,小鼠模型具有可獲得性和簡(jiǎn)易性的優(yōu)點(diǎn),可以大大提高模型建立的效率。但是,小鼠對(duì)于飼養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)環(huán)境的細(xì)微變化非常敏感,可能會(huì)導(dǎo)致模型的建立并不穩(wěn)定。另外,有研究證實(shí),建模成功與否與建模條件(溫度、濕度、飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等)有關(guān),目前在以小鼠模型模擬腎缺血再灌注損傷的科研實(shí)驗(yàn)中,建模條件各異,并沒(méi)有統(tǒng)一的建模條件,這就要求實(shí)驗(yàn)者不斷完善并形成自己需要的建模條件。本文對(duì)小鼠腎IRI建模研究的進(jìn)展進(jìn)行綜述,以此為建立穩(wěn)定、可靠的小鼠腎IRI模型提供一定參考價(jià)值。

1 小鼠品系的選擇

最近一項(xiàng)研究表明,129/S與瑞士小鼠和野生型C57小鼠相比,對(duì)缺血性AKI表現(xiàn)出較低的敏感性,這表明不同小鼠品系甚至同一小鼠品系的不同個(gè)體之間,對(duì)缺血性AKI的敏感性都存在明顯的差異。另外,許多轉(zhuǎn)基因小鼠雖然與野生型C57小鼠具有同樣的遺傳背景,但是這些轉(zhuǎn)基因小鼠至少經(jīng)過(guò)5代繁殖后,對(duì)缺血性AKI的敏感性明顯高于一般的野生型C57小鼠。所以,有關(guān)小鼠品系的選擇,Sun等[12]研究者認(rèn)為優(yōu)先選擇野生型C57(WT C57 )雄性小鼠,因?yàn)閃T C57是一種近交系小鼠,且價(jià)格低廉、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、易獲得和飼養(yǎng),屬于一種常用的實(shí)驗(yàn)小鼠[13-14]。另外,關(guān)于不同性別小鼠的選擇問(wèn)題,考慮到雌鼠有雌激素的保護(hù)作用[15],可能會(huì)導(dǎo)致血清肌酐的水平受到影響[16],而且雌鼠卵巢血管的走形與輸尿管相近,造成腎蒂及血管游離困難而增加了腎缺血再灌注手術(shù)的難度,所以,大多數(shù)研究者都選擇了雄性小鼠進(jìn)行腎IRI實(shí)驗(yàn)。另外,選擇合適周齡的雄鼠是影響實(shí)驗(yàn)效果的重要因素,目前,Zhang等[17]研究者認(rèn)為≥8周齡的小鼠更適合作為實(shí)驗(yàn)建模的手術(shù)對(duì)象,小鼠周齡過(guò)大或者過(guò)小都會(huì)影響建模效果,同時(shí)指出周齡過(guò)小(≤6周)影響建模的原因主要體現(xiàn)在以下幾方面:①≤6周齡的小鼠器官發(fā)育未成熟,而術(shù)中對(duì)于游離小鼠的組織器官等操作要求非常精確,可能會(huì)因組織器官體積過(guò)小造成肉眼游離不充分、不徹底而增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。②≤6周齡的小鼠對(duì)于局麻藥物的抵抗能力較弱,麻醉藥劑量控制稍有不慎,就可能會(huì)增加小鼠的死亡概率。③≤6周齡的小鼠術(shù)后采血時(shí)因血量較少,經(jīng)離心后血清容積可能不足150 ul而無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。因此,相比較而言,≥8周齡的小鼠術(shù)后采血,經(jīng)離心后所需血清容積一般可以穩(wěn)定在150 ul以上[18],能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,且≥8周齡的小鼠對(duì)于麻醉劑的耐受程度較好,抗寒能力和抗饑餓能力也均較強(qiáng),另外,≥8周齡的小鼠術(shù)后蘇醒較快,術(shù)后因腸粘連而發(fā)生腸梗阻的概率較小,基本能維持小鼠腎IRI后機(jī)體功能的正常運(yùn)行。此外,對(duì)于周齡過(guò)大的小鼠,有研究證實(shí),腎臟的老化會(huì)引起腎臟的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變以及腎臟代謝功能出現(xiàn)明顯的衰退,在腎IRI逐步誘導(dǎo)AKI發(fā)生后,其血清肌酐、血尿素氮的值達(dá)到預(yù)期水平所需的時(shí)間更長(zhǎng),因此,小鼠也更易出現(xiàn)死亡[19-20]。

2 小鼠術(shù)前處理

2.1 小鼠所處環(huán)境及實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng) 研究[21]表明,在恒定室溫22～26 ℃、相對(duì)濕度40%～60%且通風(fēng)良好的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下采用晝夜周期為12 h:12 h的模式對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)一周左右,使小鼠的各項(xiàng)生理機(jī)能保持在一個(gè)良好的狀態(tài),同時(shí)也能抵抗一部分手術(shù)給小鼠帶來(lái)的損傷,從而加快術(shù)后恢復(fù)的速度。若小鼠于實(shí)驗(yàn)前數(shù)天內(nèi)未進(jìn)行飼養(yǎng),使小鼠長(zhǎng)時(shí)間處于饑餓或應(yīng)激狀態(tài),這不僅會(huì)加重小鼠在術(shù)中的損傷程度,而且對(duì)術(shù)后組織器官功能的恢復(fù)也會(huì)帶來(lái)很大影響,而且,從人文關(guān)懷的角度出發(fā),生命均需得到尊重[22]。另外,有相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn),腎IRI模型建立的最佳時(shí)間段與小鼠腎臟脫水的程度密切相關(guān),有研究人員發(fā)現(xiàn),小鼠在黑暗環(huán)境下較興奮,飲水次數(shù)也相對(duì)較多,而且,在上述晝夜周期模式下飼養(yǎng)的小鼠在每日14～17點(diǎn)時(shí)間段內(nèi)脫水最嚴(yán)重,因此,認(rèn)為每日14～17點(diǎn)是建立腎IRI模型的最佳時(shí)間段[23]。

2.2 小鼠術(shù)前禁食 關(guān)于小鼠術(shù)前4～6 h內(nèi)是否禁食,與以往研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)小鼠在術(shù)前4～6 h內(nèi)采取禁食對(duì)手術(shù)有一定的幫助,對(duì)于那些只開腹行雙側(cè)腎蒂血管夾閉或行右側(cè)腎切除伴左側(cè)腎蒂夾閉的小鼠而言,采取術(shù)前禁食,小鼠并不會(huì)出現(xiàn)重要消化器官的損傷[24-25],唯一的影響是術(shù)中腸管方向可能比較混亂。因此,這也對(duì)術(shù)后對(duì)小鼠腸管大致位置的復(fù)位提出了嚴(yán)格的要求,在進(jìn)行腸管復(fù)位時(shí),可根據(jù)腸管中的內(nèi)容物判斷腸管的大致位置。有研究[26-27]還證實(shí)了術(shù)前禁食可以調(diào)控免疫球蛋白A(IgA)在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用,所以只要術(shù)中注意操作謹(jǐn)慎,未損傷腸管,術(shù)前4～6 h內(nèi)禁食對(duì)于術(shù)后小鼠的恢復(fù)和存活并無(wú)太大影響。

2.3 手術(shù)麻醉方案 麻醉方式分為全身麻醉和局部麻醉[28],關(guān)于小鼠腎IRI模型麻醉方式的選擇,國(guó)內(nèi)外研究者們最早普遍采用腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪的方式對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,但后來(lái)發(fā)現(xiàn)這種麻醉方式會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡率升高;之后的研究者采用了異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種麻醉方式不受控,而且,在發(fā)生腎IRI時(shí),此麻醉方式除了可以發(fā)揮麻醉效果,同時(shí)還會(huì)對(duì)腎功能存在一定的保護(hù)作用而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)明顯的偏差[29]。相比較而言,戊巴比妥鈉用于小鼠腎IRI建模的麻醉效果較好,因此,近幾年越來(lái)越多的研究者都選擇采用腹腔注射戊巴比妥鈉的麻醉方式,此操作相對(duì)簡(jiǎn)捷,注射30 min后小鼠便可達(dá)深度麻醉狀態(tài),其藥物劑量按照50 mg/kg換算,8周左右20 g重的小鼠,所需麻醉劑(5%戊巴比妥鈉)的劑量約為0.1 mL ,而周齡>8周的小鼠可按其體重少量添加戊巴比妥鈉的劑量[30]。但是,最近有研究者發(fā)現(xiàn),在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中,用1 mL注射器取合適劑量的麻醉劑腹腔注射后,注射器中一般還會(huì)殘留少量的麻醉劑,這就可能會(huì)造成部分小鼠在術(shù)中會(huì)因?yàn)槁樽韯┑膭┝坎蛔愠霈F(xiàn)疼痛躁動(dòng),進(jìn)而影響手術(shù)的正常操作[31],這時(shí)可以用0.9%濃度的生理鹽水對(duì)注射器中剩余的麻醉劑(約0.02～0.05 mL)稀釋后進(jìn)行腹腔噴灑,或者在注射戊巴比妥鈉后,按50 g/kg的劑量皮下注射丁丙諾啡3～5 min后,再用力按壓小鼠足部,若小鼠對(duì)用力擠壓產(chǎn)生的疼痛沒(méi)有任何反應(yīng),則可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。上述兩種處理方式不僅可以有效的減輕實(shí)驗(yàn)中小鼠因麻醉劑量不足而產(chǎn)生的疼痛,而且還可以提高術(shù)后小鼠的成功蘇醒以及降低實(shí)驗(yàn)中小鼠的死亡率[32-33]。

3 小鼠術(shù)中處理

3.1 術(shù)中小鼠體溫 近幾年,有大量研究發(fā)現(xiàn),飼養(yǎng)小鼠的室內(nèi)溫度和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠體溫的變化是腎IRI后腎功能指標(biāo)出現(xiàn)明顯變化的關(guān)鍵因素。所以,在充分考慮這個(gè)因素后,研究者們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用了恒溫系統(tǒng),此恒溫系統(tǒng)的頂端有一個(gè)探針,實(shí)驗(yàn)中需要將探針插入小鼠的直腸內(nèi),就可以精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)腎IRI實(shí)驗(yàn)小鼠體溫的變化,從而可以很大程度降低因溫度的變化導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。在最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,將小鼠充分麻醉后放置于恒溫系統(tǒng)(37.0 ℃恒溫手術(shù)臺(tái),且溫度控制在±0.1 ℃范圍內(nèi)波動(dòng))上進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作,然后對(duì)比小鼠在有無(wú)恒溫系統(tǒng)時(shí)血清肌酐、血尿素氮水平的差異:他們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中,未使用恒溫系統(tǒng),致使小鼠血清肌酐水平不穩(wěn)定,在后期實(shí)驗(yàn)中,他們?cè)?7.0 ℃恒溫系統(tǒng)的控制下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)小鼠血清肌酐、血尿素氮的水平隨溫度的升高而升高[34-35]。另外,Wong等[36-37]研究已證實(shí),AKI血清肌酐的標(biāo)準(zhǔn)值為1.5 mg/dL (133 μmol/L),若在48 h內(nèi)血清肌酐值迅速升高超過(guò) 3 mg/dL (265 μmol/L)或血清肌酐值在其標(biāo)準(zhǔn)值的基礎(chǔ)上增加50%則代表發(fā)生了AKI。不僅如此,通過(guò)對(duì)小鼠術(shù)后血肌酐水平以及其術(shù)后恢復(fù)程度方面進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)經(jīng)恒溫系統(tǒng)下處理的小鼠血肌酐水平顯著升高,腎損傷程度也更嚴(yán)重,小鼠術(shù)后恢復(fù)較慢、精神狀態(tài)和活動(dòng)度均較差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:術(shù)中溫度的恒定是腎IRI后小鼠血肌酐升高的關(guān)鍵步驟,小鼠實(shí)驗(yàn)中經(jīng)37.0 ℃恒溫系統(tǒng)處理后,術(shù)后腎功能和生化指標(biāo)會(huì)出現(xiàn)明顯的變化[38]。

3.2 術(shù)中手術(shù)操作 實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠進(jìn)行常規(guī)麻醉后,在剪開腹腔時(shí)小鼠都會(huì)出現(xiàn)不同程度的疼痛反應(yīng),仔細(xì)觀察小鼠的反應(yīng),判斷其疼痛程度,若不影響后續(xù)手術(shù)進(jìn)程以及各指標(biāo)的監(jiān)測(cè),就盡量不再增加麻醉藥物的劑量,否則將會(huì)延長(zhǎng)術(shù)后小鼠的蘇醒時(shí)間及增加小鼠的死亡丟失率[39]。另外,研究者們還指出,在術(shù)中使用棉簽、拉鉤、玻璃分針、動(dòng)脈夾等器械時(shí)動(dòng)作一定要輕柔,避免造成腹腔內(nèi)組織器官的損傷。其中,使用大小合適的拉鉤可以增加術(shù)野的暴露、方便后續(xù)手術(shù)操作以及減少手術(shù)的時(shí)長(zhǎng)。綜上,實(shí)驗(yàn)中每一步操作都應(yīng)緩慢謹(jǐn)慎,特別是在游離腎蒂時(shí),要密切注意附近的血管和組織,以免造成實(shí)驗(yàn)中腎臟或者鄰近器官出現(xiàn)不必要的損傷而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大的差異。

3.3 雙側(cè)腎蒂夾閉和右側(cè)腎切除伴左側(cè)腎蒂夾閉 根據(jù)以往小鼠實(shí)驗(yàn)的研究,大多數(shù)研究者們?cè)趯?shí)驗(yàn)中分別通過(guò)雙側(cè)夾閉小鼠腎蒂30 min、40 min、右側(cè)腎切除伴左側(cè)腎蒂夾閉30 min的方式分別誘導(dǎo)腎IRI的發(fā)生,觀察腎臟顏色的變化,當(dāng)顏色由鮮紅色變?yōu)樽虾谏珪r(shí),即可判斷為腎缺血模型建造成功,然后,夾閉雙側(cè)或單側(cè)腎蒂使腎臟缺血至相應(yīng)的時(shí)間后立即松開微型動(dòng)脈夾以恢復(fù)腎臟的血流灌注,當(dāng)血供恢復(fù)后,腎臟顏色也由紫黑變回鮮紅色,即可認(rèn)為腎缺血后再灌注成功。Behaghel等[40]在腎IRI后通過(guò)對(duì)腎功能和相應(yīng)血清生化指標(biāo)的監(jiān)測(cè),觀察到各建模方式術(shù)后血清肌酐值的變化為:雙側(cè)夾閉腎蒂30 min后血肌酐值在100 μmol/L～150 μmol/L范圍內(nèi)波動(dòng)、雙側(cè)夾閉腎蒂40 min后血肌酐值在120～240 μmol/L范圍內(nèi)波動(dòng)、右側(cè)腎切除伴左側(cè)腎蒂夾閉30 min后血肌酐值在150～200 μmol/L范圍內(nèi)波動(dòng),而造成血肌酐值不同的原因除了單、雙側(cè)夾閉腎蒂方式的不同,他們認(rèn)為還要考慮的是術(shù)中腎蒂及血管游離不徹底或者動(dòng)脈夾夾閉腎蒂時(shí)有鄰近組織嵌入的原因。另外,需要特別指出的是,上述建模方式中提到的單側(cè)鉗夾腎蒂伴對(duì)側(cè)腎切除建立腎IRI的方式也是目前研究AKI一個(gè)較好的選擇,此方式常用于從急性腎損傷到腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程的研究[41-42],因此,后續(xù)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)采取了以右側(cè)腎切除伴左側(cè)腎蒂夾閉的方式,顯微鏡下游離腎蒂和血管,待充分游離后,使用微型動(dòng)脈夾夾閉腎蒂及血管25 min,并且,單側(cè)鉗夾腎動(dòng)脈伴對(duì)側(cè)腎切除的方式還可以應(yīng)對(duì)高強(qiáng)度的腎缺血,血清肌酐和血尿素氮的值在腎IRI發(fā)生6 h后顯著升高,并在24 h內(nèi)達(dá)到峰值(術(shù)后24 h肌酐水平維持在100～150 μmol/L左右)。

腎IRI后判斷腎功能損傷的程度可以通過(guò)血清肌酐、血尿素氮以及尿蛋白水平的變化體現(xiàn),但用于定位腎臟具體損傷的部位和程度,則需要行HE染色、PAS染色以及TUNEL測(cè)定法進(jìn)行進(jìn)一步判斷。缺血性AKI最典型的組織病理變化是近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死凋亡(需要用TUNEL測(cè)定法進(jìn)行判斷),艾娜等[43]關(guān)于腎IRI對(duì)足細(xì)胞損傷的研究中表明腎IRI發(fā)生后會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死并沉積于腎小管的管腔,經(jīng)PAS染色后觀察發(fā)現(xiàn)腎小管發(fā)生嚴(yán)重的擴(kuò)張壞死并伴有刷狀緣的消失,同時(shí)足突紊亂融合,足細(xì)胞消失,基底膜增厚,這些變化的原因可能與ROS的變化密切相關(guān)。另外,有研究表明腎小管的近端小管分為S1-S3段,在缺血性AKI中,腎小管損傷最嚴(yán)重的是S3段。刁愛芹等[44-45]在TIR/BB環(huán)擬似物AS-1對(duì)小鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究中明確證實(shí):在腎IRI后,將小鼠處死,將腎臟進(jìn)行脫水包埋后切片,每只小鼠腎臟切片隨機(jī)選取20個(gè)視野在200倍光鏡下進(jìn)行觀察,根據(jù)腎小管壞死程度,常用HE染色法對(duì)腎小管的損傷進(jìn)行分級(jí)評(píng)分(0分:正常腎臟,無(wú)損傷;1分:≤10%,2分:11%～25%區(qū)間的腎小管損傷;3分:26%～45%區(qū)間的腎小管損傷;4分:46%～75%區(qū)間的腎小管損傷;5分:≥76%區(qū)間的腎小管損傷),其評(píng)分越高說(shuō)明腎小管壞死越嚴(yán)重(最高5分)。

3.4 術(shù)中無(wú)創(chuàng)傷微型動(dòng)脈夾的選擇 國(guó)內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究均未提及實(shí)驗(yàn)中夾閉腎蒂所用動(dòng)脈夾的具體要求和品牌,大部分腎IRI實(shí)驗(yàn)中所采用的是神經(jīng)外科用于臨時(shí)阻斷動(dòng)脈瘤的無(wú)創(chuàng)傷微型動(dòng)脈夾,夾力大小為73 n,但是,由于這種用于夾閉小鼠腎蒂的微型動(dòng)脈瘤夾非常容易損壞,所以,應(yīng)使用專門設(shè)計(jì)的鑷子輔助實(shí)驗(yàn)操作,以免造成任何不必要的損害。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取下動(dòng)脈夾后觀察發(fā)現(xiàn)血管并未出現(xiàn)明顯損傷,證實(shí)了夾閉小鼠腎蒂時(shí)使用這種無(wú)創(chuàng)性微型動(dòng)脈夾對(duì)小鼠血管有較好的保護(hù)作用,避免了血管破裂的發(fā)生[46]。有些實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)在之前實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒅惺褂昧四X動(dòng)脈瘤無(wú)創(chuàng)微型動(dòng)脈夾行腎蒂夾閉,但術(shù)后發(fā)現(xiàn)血清肌酐水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著的變化,主要考慮是實(shí)驗(yàn)中動(dòng)脈夾夾閉腎蒂不徹底導(dǎo)致小鼠部分血管仍殘留血液循環(huán)的原因。判斷動(dòng)脈夾是否徹底夾閉了腎蒂及血管,主要通過(guò)夾閉腎蒂后觀察腎臟外觀有無(wú)出現(xiàn)顏色深淺不均來(lái)判斷。此外,對(duì)于動(dòng)脈夾的選擇,有國(guó)外文獻(xiàn)[47]報(bào)道還可以使用微型塞拉芬夾(The micro serrafine clips)對(duì)腎蒂進(jìn)行夾閉,經(jīng)檢測(cè),使用此動(dòng)脈夾術(shù)后血清肌酐水平也可以達(dá)到缺血再灌注損傷的預(yù)期范圍。這些研究表明,雖然夾閉腎蒂的動(dòng)脈夾沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),但是,徹底夾閉腎蒂是建模成功以及血肌酐、尿素氮等指標(biāo)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵。

3.5 術(shù)中夾閉腎蒂結(jié)束后腸管的復(fù)原 有些實(shí)驗(yàn)中小鼠在術(shù)前4～6 h內(nèi)未做禁食處理,在術(shù)中發(fā)現(xiàn)部分腸管中有腸內(nèi)容物殘留,此時(shí),可以先用無(wú)菌棉簽輕推腸管,徹底游離出一側(cè)腎臟進(jìn)行腎蒂?gòu)氐子坞x后夾閉,同樣的方法處理對(duì)側(cè)腎臟。待雙側(cè)腎臟均處理完畢后,需按腸管的原位置進(jìn)行復(fù)位,并且復(fù)位時(shí)注意腸管有無(wú)損傷。

4 小鼠術(shù)后護(hù)理

4.1 術(shù)后腹腔噴灑0.9%生理鹽水用量 由于實(shí)驗(yàn)中小鼠長(zhǎng)時(shí)間暴露腹腔,致使腸管較大面積長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,小鼠腸管水分丟失較嚴(yán)重,所以術(shù)后小鼠應(yīng)行腹腔注射0.9%生理鹽水進(jìn)行補(bǔ)充。Iwaki等[48]的實(shí)驗(yàn)中有部分小鼠術(shù)后腹腔未注射生理鹽水,導(dǎo)致小鼠術(shù)后蘇醒時(shí)間較長(zhǎng)、活動(dòng)度較差。他們通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明術(shù)后關(guān)閉腹腔時(shí)應(yīng)使用1 mL左右0.9%生理鹽水腹腔注射。但后續(xù)研究者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腹腔注射1 mL生理鹽水對(duì)于小鼠而言,劑量偏大,縫合時(shí)有液體外溢現(xiàn)象,導(dǎo)致小鼠皮膚毛發(fā)潮濕,易造成術(shù)后小鼠體溫失衡,進(jìn)而增加術(shù)后小鼠死亡丟失的概率,而注射0.5 mL的生理鹽水對(duì)于小鼠腹腔體積較合適,縫合時(shí)無(wú)明顯液體外溢[49]。所以,建議在小鼠腹部切口閉合后,均立即腹腔注射0.5 mL溫?zé)釤o(wú)菌生理鹽水,然后將小鼠放在加熱墊上,直到其完全恢復(fù)意識(shí),然后再放回鼠籠中。以上數(shù)據(jù)表明,術(shù)后經(jīng)腹腔注射生理鹽水的小鼠術(shù)后蘇醒時(shí)間無(wú)明顯延長(zhǎng)以及小鼠活動(dòng)度均較好。

4.2 術(shù)后復(fù)溫 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠于26 ℃的環(huán)境保暖,且進(jìn)行復(fù)溫40 min處理,復(fù)溫有助于加速血液凝固、組織器官功能的恢復(fù)以及傷口更好的愈合,復(fù)溫的同時(shí)需為小鼠補(bǔ)充水與飼料[50]。實(shí)驗(yàn)中有部分小鼠,術(shù)后未行復(fù)溫處理,直接放置于常溫鼠盒中,導(dǎo)致這些未行復(fù)溫處理小鼠的蘇醒時(shí)間及傷口愈合時(shí)間均長(zhǎng)于術(shù)后行復(fù)溫處理的小鼠。

5 其他細(xì)節(jié)

目前,腎IRI模型的建立,研究者們均比較傾向于選擇腹部正中切口[51-52],也有文獻(xiàn)記載可以采用背部切口和雙側(cè)切口[53],但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)者考慮到手術(shù)時(shí)間等問(wèn)題還是選擇采用腹部正中切口。Lu等[54-55]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明,在夾閉腎蒂過(guò)程中,將夾閉右腎蒂和左腎蒂之間的時(shí)間間隔控制在1～1.5 min內(nèi)。盡管從哪一側(cè)開始夾閉并不重要,但他們建議首先夾閉右側(cè),因?yàn)橛易倒鄬?duì)較短且較難夾緊,先將右腎蒂夾緊后,很容易在1～1.5 min內(nèi)完成左椎弓根的夾閉。但是,在雙側(cè)腎蒂被完全夾閉后,要分別記錄每側(cè)腎臟的缺血時(shí)間,以確保兩個(gè)腎臟都接受相同的持續(xù)缺血時(shí)間。夾閉完成后,使用濕無(wú)菌紗布覆蓋手術(shù)切口,這對(duì)于暴露的腹腔較少的丟失水分有較大幫助。他們還指出,關(guān)閉腹腔時(shí)使用5-0組織縫合線進(jìn)行腹膜連續(xù)縫合和腹壁間斷縫合,因小鼠術(shù)后可能會(huì)主動(dòng)撕咬縫合線,所以腹壁有行間斷縫合的必要性。不建議使用夾子閉合傷口而不縫合肌肉層,因?yàn)榭赡軙?huì)導(dǎo)致傷口愈合不完全或發(fā)生感染。另外,小鼠復(fù)溫后給予喂食適量的生理鹽水,對(duì)于小鼠可以較快的恢復(fù)活動(dòng)能力提供一定的幫助。

6 小結(jié)與展望

本文綜述了腎IRI小鼠模型建造過(guò)程中術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后的操作及注意事項(xiàng),并結(jié)合以往國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中小鼠腎IRI建模的研究對(duì)目前建模條件進(jìn)行綜述,總結(jié)出目前雙側(cè)腎IRI模型的建立是國(guó)內(nèi)外研究腎IRI應(yīng)用最多的建模方式,查閱相關(guān)文獻(xiàn)并歸納后認(rèn)為,目前最優(yōu)的雙側(cè)腎IRI模型建立的條件是:選擇8周齡左右雄性WTC57小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后(溫度:22～26 ℃,濕度40%～60%,晝夜各12 h),于術(shù)前禁食4～6 h后,用5%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉,充分麻醉后將小鼠置于37 ℃恒溫臺(tái)上,行腹部正中切口逐層切開腹腔,小心并徹底游離雙側(cè)腎蒂周圍組織,用無(wú)損傷微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂30 min后恢復(fù)血流灌注并還原腸管至原本的解剖位置,為防止脫水腹腔內(nèi)注入1 mL溫?zé)嵘睇}水,并逐層縫合腹腔,術(shù)后將小鼠放置于26 ℃且食物充足環(huán)境內(nèi)等待蘇醒。另外有研究發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境異常敏感,即使同條件下不同批次實(shí)驗(yàn),術(shù)后結(jié)果有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)大范圍波動(dòng)。目前隨著臨床AKI病患率不斷升高,模擬并建立穩(wěn)定的腎IRI模型以期對(duì)腎IRI病理生理機(jī)制的進(jìn)一步研究至關(guān)重要。因此,之后研究者們對(duì)小鼠腎IRI模型建立的進(jìn)一步優(yōu)化將有助于更加精細(xì)的模擬AKI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,也為后續(xù)建立更加可靠、穩(wěn)定的小鼠腎IRI模型及研究提供可靠的理論依據(jù)。