酸性木聚糖酶在玉米豆粕型日糧中的研究

黃志毅，梁偉凡，李陽(yáng)源，郭玉光

廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海 519000

目前，木聚糖酶被廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)，其作用在于降低黏性，解除籠蔽效應(yīng)等；目前應(yīng)用的木聚糖酶最適pH 為7 左右，接近空腸中后段才能發(fā)揮最大的作用。酸性木聚糖酶在胃酸的條件下就能發(fā)揮作用，因此，在整個(gè)腸段相比中性木聚糖酶有更多的作用空間。利用定向突變等基因工程手段，篩選出了耐胃酸的木聚糖酶；本研究擬在玉米豆粕型日糧的基礎(chǔ)上，以817 肉雞為研究對(duì)象，添加酸性和中性木聚糖酶，以期得到酸性和中性木聚糖酶在使用上的區(qū)別，為飼料工業(yè)的應(yīng)用提供更為廣泛的選擇性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用的中性木聚糖酶和酸性木聚糖酶由廣東溢多利生物科技股份有限公司提供，活性均為10000 U/g。

木聚糖酶活力單位（U）定義：在37 ℃、pH 3.5 或者 5.5 條件下，每分鐘從質(zhì)量濃度為5 mg/mL 木聚糖溶液中，降解釋放1 μmoL 還原糖所需要的酶量為1 個(gè)酶活力單位。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧組成

試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取600 只1 日齡體重相近的健康817 肉公雞，隨機(jī)分為3 組，每組10 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 只雞。對(duì)照組飼喂玉米– 豆粕型基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加2000 U/kg 中性木聚糖酶或酸性木聚糖酶。試驗(yàn)期為42 d，分前期（1～21 d）和后期（22～42 d）兩個(gè)階段飼養(yǎng)?；A(chǔ)飼糧參考中國(guó)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 33–2004）配制，其基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1 所示。

表1 基礎(chǔ)飼糧配方以及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)地點(diǎn)為珠海溢農(nóng)生物科技有限公司，自由飲水，常規(guī)防疫和免疫，其余管理依照珠海溢農(nóng)生物科技有限公司日常管理方式進(jìn)行。

1.4 樣品收集

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)取一只雞，頸靜脈采血，2000×g，離心20 min，收集血清，–20 ℃保存，待進(jìn)一步分析。然后頸靜脈放血致死，取回腸組織，將部分回腸組織剪碎，用10 倍體積（V/W）的4 ℃生理鹽水稀釋?zhuān)诒l件下勻漿，然后4 ℃條件下，4000 r/min 離心20 min，取上清分裝保存于–80 ℃冰箱待測(cè)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能在試驗(yàn)的第21 天和42 天，對(duì)每個(gè)重復(fù)的雞空腹稱(chēng)重，記錄采食量，計(jì)算平均日采食量、平均日增重、料肉比和成活率。

1.5.2 養(yǎng)分表觀(guān)消化率試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)取一只雞，采用全收糞法測(cè)定各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率。干物質(zhì)的測(cè)定采用高溫干燥法（GB/T 9695.15–2008）；粗灰分的測(cè)定采用馬福爐高溫灼燒法（GB/T 9695.18–2008）；粗脂肪的測(cè)定采用索氏抽提法（GB/T 9695.1–2008）；粗蛋白質(zhì)的測(cè)定采用凱氏半微量定氮法（GB/T 9695.11–2008）；鈣的測(cè)定采用灰分法；磷的測(cè)定采用釩鉬酸銨顯色法；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率計(jì)算公式如下：

某養(yǎng)分的表觀(guān)消化率/%=[（某養(yǎng)分采食量–某養(yǎng)分排出量）/ 某養(yǎng)分采食量]×100。

1.5.3 血清生化指標(biāo)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肉雞血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、尿素氮、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量，試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.4 回腸抗氧化功能按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肉雞回腸的總抗氧化能力（T-AOC）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的活性和丙二醛（MDA）的含量，試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR取0.1 g 回腸組織于1.5 mL 無(wú)菌無(wú)RNase 離心管中，向其中加入1 mL Trizol（Sigma-Aldrich）后參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA 的提取；測(cè)定其濃度后取1 μg 總RNA參照PrimeScript reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 雞β-actin 和ZO-1 的 基 因 序 列，利 用PrimerBLAST 設(shè)計(jì)引物（表2），并交由上海生物工程有限公司進(jìn)行合成。以cDNA 為模板，參照TAKARA TB Green Premix Ex Taq II（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)，在7500 Real Time PCR System 儀器上反應(yīng)。以β-actin 作為本試驗(yàn)的內(nèi)參基因，采用2–ΔΔCt 法計(jì)算ZO-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列信息

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并采用LSD 法進(jìn)行多重比較。P＜0.01 視為差異極顯著，P＜0.05 視為差異顯著，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3 可知，在1～21 d，酸性木聚糖酶組ADG 分別比中性木聚糖酶組和對(duì)照組高2.87%（P＞0.05）和6.90%（P＜0.05）；中性木聚糖酶組ADFI 分別比酸性木聚糖酶組和對(duì)照組高0.55%（P＞0.05）和2.56%（P＜0.05）；F/G 方面，中性木聚糖酶組比對(duì)照組低0.03，酸性木聚糖酶組比對(duì)照組低0.07。在22～42 d，ADG、ADG和F/G 木聚糖酶組均比對(duì)照組好，但是差異不顯著（P＞0.05）。從1～42 d 看，ADG 木聚糖酶組均比對(duì)照組高，但是差異不顯著（P＞0.05）；酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組F/G 分別比對(duì)照組低0.04 和0.03（P＞0.05）。

表3 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

由表4 可知，酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組干物質(zhì)消化率分別比對(duì)照組高4.00%（P＜0.05）和4.47%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組總能消化率分別比對(duì)照組高6.50%（P＜0.05）和6.96%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組鈣消化率分別比對(duì)照組高12.22%（P＜0.05）和9.53%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶組磷消化率分別比中性木聚糖酶組和對(duì)照組高19.18%（P＜0.05）和33.88%（P＜0.05）。

表4 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響 %

2.3 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表5 可知，酸性木聚糖酶組GLB 含量分別比中性木聚糖酶組和對(duì)照組高1.31%和2.18%，但是差異不顯著（P＞0.05）；酸性木聚糖酶組IgA含量分別比中性木聚糖酶組和對(duì)照組高17.25%（P＜0.05）和20.93%（P＜0.05）；中性木聚糖酶組IgG 含量分別比酸性木聚糖酶組和對(duì)照組高8.57%（P＞0.05）和38.54%（P＜0.05）；其他各指標(biāo)無(wú)顯著差異。

表5 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

2.4 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞回腸抗氧化能力的影響

由表6 可知，酸性木聚糖酶可顯著提高回腸CAT 的水平（P＜0.05），很大程度提高了回腸和肝臟的GSH-Px 水平、降低回腸MDA 的水平。

表6 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞回腸抗氧化能力的影響

2.5 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞回腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

由圖1 可知，與對(duì)照組相比，酸性木聚糖酶可顯著提高回腸閉合小環(huán)蛋白–1（ZO-1）的mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）；中性木聚糖酶組在數(shù)值上有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞回腸ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

目前，關(guān)于木聚糖酶的應(yīng)用研究主要集中在小麥型基礎(chǔ)飼糧上，而對(duì)玉米型基礎(chǔ)飼糧研究較少（王鵬宇等，2010）。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在玉米–豆粕型飼糧上，與對(duì)照組相比，飼糧中添加酸性木聚糖酶可顯著提高1～21 日齡肉雞ADG，料肉比在數(shù)值上有所降低，但差異不顯著，這與Amerah 等（2017）在玉米–豆粕型飼糧基礎(chǔ)上添加木聚糖酶改善1～21 日齡羅斯308 肉雞生長(zhǎng)性能的結(jié)果基本一致。原因可能在于木聚糖酶可降解飼糧中的水不溶性木聚糖，提高飼糧養(yǎng)分利用率（Gemma等，2017），改善肉雞腸道健康（王劍等，2021；Zhang 等，2018），從而促進(jìn)肉雞ADG 的提高。在22～42 日齡，與對(duì)照組相比，木聚糖酶的添加對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，這與徐葉桐等（2017）在小麥型基礎(chǔ)飼糧的結(jié)果不一致，原因可能在于玉米型基礎(chǔ)飼糧相比小麥型基礎(chǔ)飼糧水溶性木聚糖含量較低，腸道食糜黏性不是主要的抗?fàn)I養(yǎng)因素（王劍等，2021），且成年肉雞相比于雛雞消化系統(tǒng)發(fā)育完善，對(duì)非淀粉多糖耐受性提高，導(dǎo)致木聚糖酶在生長(zhǎng)性能上無(wú)法體現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞養(yǎng)分表觀(guān)代謝率的影響

研究表明，木聚糖酶可提高飼糧的養(yǎng)分利用率（王雄等，2016；Vandeplas 等，2010），但對(duì)于不同類(lèi)型飼糧營(yíng)養(yǎng)消化率的改善其作用機(jī)制不同，小麥型飼糧營(yíng)養(yǎng)消化率的改善主要得益于木聚糖酶對(duì)黏度效應(yīng)的消除（Masey-O’Neill 等，2014），而對(duì)于玉米型飼糧中則更多是因?yàn)槟揪厶敲笇?duì)小腸內(nèi)源性消化酶活性的提高（王鵬宇等，2010），并增加消化酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物的接觸（王劍等，2021），從而改善飼糧養(yǎng)分表觀(guān)消化率。Amerah 等（2017）研究表明，玉米–豆粕型飼糧中添加木聚糖酶可提高回腸表觀(guān)消化能和淀粉、氮、總能的回腸表觀(guān)消化率。Stefanello 等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，添加木聚糖酶提高了玉米–豆粕型飼糧的粗蛋白質(zhì)質(zhì)和能量的表觀(guān)消化率。本研究與上述結(jié)果基本一致，與對(duì)照組相比，添加中性木聚糖酶和酸性木聚糖酶顯著提高了飼糧中干物質(zhì)、能量、鈣的表觀(guān)消化率，磷表觀(guān)消化率方面酸性木聚糖組顯著高于對(duì)照組中性木聚糖酶組，原因在于酸性木聚糖酶具有耐酸的特性，在胃腸道中相比中性木聚糖酶擁有更長(zhǎng)的作用時(shí)間和更大的作用空間，從而使得酸性木聚糖酶在提高飼糧表觀(guān)消化率的效果更好。

3.3 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

免疫球蛋白含量是評(píng)價(jià)家禽免疫功能的重要指標(biāo)（唐青松等，2021）。呂秋鳳等（2013）報(bào)道，在飼糧中添加1500 U/kg 未包被木聚糖酶可顯著提高肉雞血清IgG 的含量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，酸性木聚糖酶組肉雞血清中IgA 含量顯著提高，中性木聚糖酶組IgG 含量顯著提高，這說(shuō)明木聚糖酶的添加有利于增強(qiáng)肉雞免疫功能。分析其原因，可能是因?yàn)槟揪厶敲缚梢杂绊懶笄萃庵苎に厮剑{(diào)控激素含量而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能（韓世強(qiáng)等，2018）。另外，木聚糖酶可通過(guò)自身各種酶的協(xié)同作用將木聚糖水解為低聚木糖和木糖（李東紅等，2018），從而提高肉雞腸道中低聚木糖含量（Morgan 等，2020），而低聚木糖可提高家禽免疫功能（汪茫茫等，2019）。

3.4 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞回腸抗氧化能力的影響

氧化應(yīng)激會(huì)誘發(fā)氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生，進(jìn)而損傷生物大分子，最終導(dǎo)致肉雞生長(zhǎng)受阻。SOD、CAT 和GSH-Px 等抗氧化酶可通過(guò)清除氧自由基協(xié)助機(jī)體恢復(fù)氧化還原平衡，而MDA 含量的多少可作為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度的判斷依據(jù)（王彬，2013）。尹曉楠等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加木聚糖酶能夠顯著提高肉雞血漿的總抗氧化能力、總谷胱甘肽的含量和空腸黏膜的總抗氧化能力。本試驗(yàn)研究表明，酸性木聚糖酶組相比對(duì)照組和中性木聚糖酶組CAT 活性顯著提高，GSH-Px 活性在數(shù)值上有所升高，MDA含量有所降低。原因可能在于木聚糖酶可通過(guò)自身各種酶的協(xié)同作用將木聚糖水解為低聚木糖和木糖（李東紅等，2018），從而提高肉雞腸道中低聚木糖含量（Morgan 等，2020），而低聚木糖可提高家禽抗氧化功能（周建民等，2021）。

3.5 酸性和中性木聚糖酶對(duì)肉雞回腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

腸道緊密連接蛋白是構(gòu)成腸道屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Wang 等（2021）研究表明，在飼糧添加木聚糖酶和甘露聚糖酶可顯著增加肉雞空腸閉合蛋白– 1（Claudin-1）mRNA 相對(duì)表達(dá)量。郭雙雙（2016）研究表明，飼糧中添加木聚糖酶可顯著增加肉雞回腸的Claudin-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果相似，與對(duì)照組相比，飼糧中添加酸性木聚糖酶可顯著提高回腸中ZO-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，中性木聚糖酶組在數(shù)值上也有所提高，但差異不顯著。這說(shuō)明在飼糧中添加酸性木聚糖酶有助于腸道緊密連接蛋白表達(dá)量的提高，原因可能在于木聚糖酶可提高腸道中乳酸桿菌的含量（Engberg 等，2004），而乳酸桿菌可通過(guò)激活肌球蛋白輕鏈磷酸化調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的mRNA 表達(dá)（彭宇等，2020）。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加酸性木聚糖酶可一定程度提高肉雞生長(zhǎng)性能、免疫功能及回腸的抗氧化能力，顯著提高ZO-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，并且酸性木聚糖酶的效果優(yōu)于中性木聚糖酶。