高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定蒺藜中蒺藜皂苷D的含量

廖明麗,李爭(zhēng)△,高晗,李亞楠,田方,李軍山,2（.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,河北 石家莊 05430;2.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司,云南 楚雄 675099）

蒺藜藥材來源于蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實(shí)，味辛、苦，性微溫，有小毒，歸肝經(jīng)，能平肝解郁，活血祛風(fēng)，明目，止癢[1]。蒺藜含有甾體皂苷、黃酮、多糖、生物堿、氨基酸等成分，以甾體皂苷為主，也是主要的藥效成分[2-4]。有研究證實(shí)蒺藜皂苷治療心血管疾病具有明確療效[5]，此外，還具有降血糖[6]、抗菌、抗腫瘤、性強(qiáng)壯等作用[7]，研究多以蒺藜皂苷元為指標(biāo)進(jìn)行考察[8-9]。蒺藜皂苷D屬于蒺藜皂苷，有報(bào)道稱蒺藜皂苷D能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡[10]，還可改善銀屑病皮損處的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[11]，關(guān)于蒺藜中蒺藜皂苷D的含量測(cè)定方法報(bào)道較少，有文獻(xiàn)報(bào)道過該成分的含量測(cè)定方法，但供試品制備方法極為復(fù)雜，需先回流提取、再經(jīng)過大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫[12-13]。本次研究圍繞簡(jiǎn)化藥材中蒺藜皂苷D含量測(cè)定中供試品的制備方法，建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）測(cè)定蒺藜中蒺藜皂苷D含量的方法，旨在為更好、更方便地控制蒺藜質(zhì)量提供可靠的依據(jù)。具體報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司），Alltech ELSD-6000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰科技公司），Sartorius CPA225D型分析天平（德國(guó)賽多利斯公司），KH7200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 蒺藜皂苷D對(duì)照品（批號(hào)：112022-201601），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以95.3%計(jì)。

蒺藜藥材：采購(gòu)于內(nèi)蒙、遼寧、吉林等不同的產(chǎn)地，藥材經(jīng)原河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院孫寶惠老師鑒定為蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用的色譜柱為InertSustain C18（250×4.6mm，5μm），以乙腈-水（45∶55）為流動(dòng)相，柱溫為30℃，流速1.0mL/min，使用ELSD-6000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20μL。理論板數(shù)按蒺藜皂苷D峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取蒺藜皂苷D對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1mL含51.5μg的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過三號(hào)篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取60%甲醇10mL加入，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

按照以上色譜條件，蒺藜皂苷D與相鄰峰分離度符合要求，見圖1。

圖1 HPLC圖譜。注：A.蒺藜皂苷D對(duì)照品；B.供試品

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取配制好的濃度為51.5μg/mL的蒺藜皂苷D對(duì)照品溶液，分別取4μL、6μL、10μL、15μL、20μL注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（A）的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)y，進(jìn)樣質(zhì)量（m）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)x，作線性回歸分析，得回歸方程為L(zhǎng)n（A）=0.5395Ln（M）-6.212，r=0.9996，見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，蒺藜皂苷D進(jìn)樣質(zhì)量在0.206-1.030μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，見表2。

表2 精密度試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一藥材樣品粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行供試品溶液制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，見表3，結(jié)果證明，本方法的重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的藥材樣品粉末（0.0209%）約0.5g，分別精密稱定6份，置10mL容量瓶中，精密量取濃度為0.103mg/mL蒺藜皂苷D對(duì)照品溶液各1mL加入，加60%甲醇適量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，用60%甲醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得。計(jì)算加樣回收率，見表4，結(jié)果證明本方法回收率良好。

表4 回收率試驗(yàn)

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品的溶液20μL，每五個(gè)小時(shí)進(jìn)樣一次，共五次，記錄峰面積，見表5，由結(jié)果可知，供試品溶液中蒺藜皂苷D在20小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.9 藥材含量測(cè)定 精密稱取6批藥材樣品，各平行2份，按“2.3供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法進(jìn)行供試品溶液制備，進(jìn)樣量為20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量測(cè)定結(jié)果，見表6。

表6 各產(chǎn)地藥材含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

文獻(xiàn)已報(bào)道的蒺藜藥材中的蒺藜皂苷D含量測(cè)定供試品的制備方法，操作較繁瑣，難重現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)藥材供試品的制備方法為使用60%甲醇溶液，進(jìn)行超聲處理30分鐘，提取效果最佳，處理過程簡(jiǎn)單，使準(zhǔn)確度增加，大大節(jié)省了供試品的制備時(shí)間，節(jié)約了成本，降低了能耗。

從6份不同樣品的蒺藜藥材中蒺藜皂苷的含量測(cè)定結(jié)果看，各產(chǎn)地差異較大，遼寧產(chǎn)地優(yōu)于其他兩個(gè)產(chǎn)地，推測(cè)與產(chǎn)地相關(guān)，還有可能與藥材性狀、采收、產(chǎn)地加工等相關(guān)[14]，藥材樣品中有顏色深淺的區(qū)別，遼寧產(chǎn)地藥材性狀明顯優(yōu)于其他產(chǎn)地。

有報(bào)道測(cè)定蒺藜皂苷的含量多采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[15]，蒺藜皂苷D無紫外吸收，故本研究采用了蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，對(duì)蒺藜皂苷D有通用響應(yīng)，建立了蒺藜皂苷D的含量測(cè)定方法。HPLCELSD法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏，精密度、重復(fù)性、回收率及線性關(guān)系良好，可適用于蒺藜藥材中蒺藜皂苷D的含量測(cè)定。