廣西煙草炭疽病病原鑒定及生物學特性研究

石潔 桑維鈞 盧燕回 張得平 孔菲 首安發(fā) 楊茂發(fā)

摘 ?要：為明確廣西壯族自治區(qū)賀州市鐘山縣發(fā)生的真菌性葉斑病害的病原菌種類和生物學特性，分別采用組織分離法和活體傷口接種法對病原菌進行分離和致病性測定，利用PCR擴增病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（）、肌動蛋白（）和幾丁質(zhì)合成酶（）進行分子鑒定，結合形態(tài)學特征對病原菌種類進行鑒定，采用菌絲生長速率法測定病原菌生物學特性。聚類分析結果表明，病原菌與平頭炭疽（）聚為一支，且支持率為100%，結合形態(tài)學特征，將病原菌鑒定為平頭炭疽（），這是平頭炭疽寄生煙草引起煙草炭疽病的首次報道。病原菌生物學特性測定結果表明，病原菌對環(huán)境有較強的適應性，最適培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂（NA），最適溫度30 ℃，最適光照條件為全黑暗，最適碳源為淀粉，最適氮源為蛋白胨，pH為7時病原菌生長最快，病原菌致死溫度為53 ℃、10 min。研究結果為病害的及時準確防治和深入研究提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：煙草；炭疽??；病原菌鑒定；多基因分子鑒定；生物學特性

中圖分類號：S435.72???????????????????????文獻標識碼：A ?????????????????????文章編號：1007-5119（2023）05-0070-09

Identification of Tobacco Anthracnose Pathogen and its Biological Characteristics in Guangxi

SHI Jie， SANG Weijun， LU Yanhui， ZHANG Deping， KONG Fei， SHOU Anfa， YANG Maofa

（1. School of Tobacco， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. Science and Technology Department， Guangxi Zhuang Autonomous Region Company， China National Tobacco Corporation， Nanning 530022， China; 3. Hezhou Branch， Guangxi Zhuang Autonomous Region Tobacco Company， Hezhou， Guangxi 542800， China）

?Aiming to clarify the species and biological characteristics of pathogenic fungal leaf spot diseases in Zhongshan County， Hezhou City， Guangxi Zhuang Autonomous Region， the pathogenic fungi were isolated by tissue isolation and its pathogenicity was determined by inoculation of living wounds. The molecular identification of pathogenic fungi was performed by PCR amplification of their internal transcribed spacer region of the ribosomes （）， actin （）， and chitin synthase （）. The pathogen species were identified by combining morphological characteristics， and mycelial growth rate method was employed to determine the biological characteristics of pathogens. Results of cluster analysis showed that the pathogen and ?were clustered into one team， and the support rate reached 100%. Combined with morphological characteristics， the pathogen was identified as ， which is the first report of tobacco anthracnose caused by ?parasitising tobacco. The determination of pathogen’s biological characteristics showed that the pathogen exhibited strong adaptability to environment. The optimal medium， temperature， light condition， carbon source， nitrogen source was nutrient agar （NA）， 30 ℃， total darkness， starch， peptone， respectively. The most rapid growth of pathogen was observed at pH 7， and the lethal temperature of pathogen was 53 ℃?for 10 min. The results of the study present the diversity of pathogens causing tobacco anthracnose， and provide a theoretical basis for the timely accurate control and further research of the disease.

?tobacco; anthracnose; pathogen identification; multigene molecular identification; biological characteristics

基金項目：中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司項目（202145000024006）

作者簡介：石 ?潔（1999-），女，在讀碩士，主要從事煙草病原真菌學研究。E-mail：18285601559@139.com

*通信作者。E-mail：桑維鈞，984139246@qq.com；盧燕回，29994267@qq.com

收稿日期：2023-04-03??????????????????修回日期：2023-10-10

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，對增加國家財政稅收具有重要意義。病害的發(fā)生限制著其產(chǎn)質(zhì)量，截至目前，我國共有70多種煙草病害，因煙草病害造成的損失常年達10%左右，此外，煙草種植年限的增加、連作以及氣候變化等因素為新病害的發(fā)生提供了有利的條件，越來越多的新病害被報

道，四年內(nèi)，我國發(fā)現(xiàn)鑒定新病害20多種，并且還有不斷上升的趨勢。2022年，廣西壯族自治區(qū)賀州市鐘山縣大田煙株發(fā)生一種葉部病害，癥狀不同于其他已報道的病害，其病斑較大，形狀不規(guī)則或近圓形，有輪紋，中間白色至淡黃褐色，且著生有較密集的黑點，邊緣深褐色，發(fā)病率達16%左右，對當?shù)責煵莓a(chǎn)質(zhì)量有較大的影響。為明確該病害的種類，對其病原菌進行分離鑒定，同時測定該病原菌的生物學特性，旨在明確病害發(fā)生規(guī)律進而為精準防治提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

1.1.1 ?供試樣品??2022年7月，從廣西壯族自治區(qū)賀州市鐘山縣種植的煙草品種“K326”上采集到一片有典型病斑的煙葉。

1.1.2 ?供試培養(yǎng)基??供試培養(yǎng)基包括采購自青島海博生物技術有限公司的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、玉米粉瓊脂（CMA）、麥芽汁瓊脂（MEA）和察氏瓊脂（CDA），采購自上海博微生物科技有限公司的高氏合成1號瓊脂（GSA）、營養(yǎng)瓊脂（NA）和溶菌肉湯（LB），采購自北京索萊寶科技有限公司的燕麥瓊脂（OA）以及自配的水瓊脂（WA：瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、煙葉煎汁瓊脂（TA：新鮮煙葉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、松針瓊脂（PNA：新鮮松針葉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、胡蘿卜瓊脂（CA：胡蘿卜200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、V8果汁瓊脂（V8：V8果汁100 mL、碳酸鈣0.02 g、蒸餾水1000 mL）共13種。

1.2 ?病原菌的分離、純化

采用組織分離法分離病原菌，將病健交接處剪切成5 mm×5 mm的組織塊，用75%酒精消毒30 s，5%的次氯酸鈉溶液消毒3 min，無菌水沖洗4次，用無菌濾紙吸干水分后接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d，單孢純化4次，挑取單一菌落于PDA上培養(yǎng)，5 d后轉(zhuǎn)于40%甘油中，于–20 ℃冰箱保存。

1.3 ?病原菌致病性的測定

選取健康的“云煙87”煙株，采用活體傷口接種法，用75%酒精和無菌水消毒洗凈煙葉，用無菌注射器在葉片上隨機穿刺6個小孔作為接種處，用無菌打孔器（=5 mm）在生長5～7 d的菌落邊緣打孔獲取菌塊，菌塊覆蓋于接種處，有菌絲的一面朝下，菌塊上覆蓋濕潤的棉球保濕；無菌PDA培養(yǎng)基塊（=5 mm）作為對照。接種葉片用自封袋保濕、隔絕污染，置于28 ℃培養(yǎng)箱，保持培養(yǎng)箱濕度80%以上，2 d后取走菌餅，定期觀察煙葉發(fā)病情況，接種煙葉發(fā)病后根據(jù)1.2方法再次分離病原菌株。

1.4 ?病原菌鑒定

1.4.1 ?形態(tài)學鑒定??觀察分生孢子盤及分生孢子的形態(tài)特征并測量分生孢子的大小。病原菌接種至PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落培養(yǎng)性狀（包括菌落形狀、顏色和質(zhì)地）。挑取菌絲體制作玻片，在光學顯微鏡下觀察病原菌菌絲形態(tài)特征。

1.4.2 ?分子生物學鑒定??將病原菌接種于覆有半透膜的PDA平板上，5 d后用無菌手術刀刮取約50 mg菌絲，按照真菌DNA提取試劑盒的步驟提取DNA，使用引物（表1）對病原菌對應位點序列進行擴增，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，反應體系和擴增條件參考石妞妞等的方法，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定?；蛐蛄薪?jīng)BLAST比對分析后，提交至NCBI獲得登錄號。從GenBank中收集已知的其他相關病原菌的序列信息（表2），通過MAFFT V.7（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）建樹，建樹方法采用鄰接法（neighbor-joining），Boot-strap值設為1000來檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

1.5 ?病原菌的生物學特性測定

1.5.1 ?不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響??用無菌打孔器（=5 mm）在生長5 d的菌落邊緣打孔獲取菌餅，將菌餅有菌絲的一面接種于13種不同培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理3個重復，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5.2 ?不同溫度對病原菌菌絲生長的影響??獲取菌餅的方法同1.5.1，將菌餅接種于PDA平板上，放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3 ?不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響??獲取菌餅的方法同1.5.1，將菌餅接種于PDA平板上，分別置于全光照、全黑暗、12 h光暗交替3種光照條件的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.5.4 ?不同碳源對病原菌菌絲生長的影響??以察氏瓊脂為基礎培養(yǎng)基，蔗糖作為碳源，并用等碳量的木糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、山梨糖醇和可溶性淀粉代替蔗糖，制備含有不同碳源的培養(yǎng)基，后將菌餅接種于含不同碳源的培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.5 ?不同氮源對病原菌菌絲生長的影響??以察氏瓊脂為基礎培養(yǎng)基，以硝酸鈉為氮源，用等氮量的蛋白胨、牛肉浸粉、氯化銨、尿素、甘氨酸、硫酸銨、賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和酵母浸粉代替硝酸鈉，制備含有不同氮源的培養(yǎng)基，參考1.5.1獲取菌餅后，將菌餅接種于含有不同氮源的培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.6 ?不同pH對病原菌菌絲生長的影響??以PDA為基礎培養(yǎng)基，在無菌操作臺內(nèi)用1% HCL和1% NaOH調(diào)節(jié)滅菌PDA的pH，使之分別為4、5、6、7、8、9、10和11，參考1.5.1獲取菌餅后，將菌餅接種于不同pH的培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.7 ?病原菌致死溫度的測定??用無菌打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，放置于裝有1 mL無菌水的離心管中（容量1.5 mL），封口膜封口后分別置于35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min，取出后放置于–20 ℃冰箱迅速降溫，處理后的菌餅接種于PDA平板上，放置于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后確定致死溫度的大致范圍，然后以1 ℃為梯度遞增，最終確定病原菌的致死溫度。

1.6 ?統(tǒng)計分析

運用Excel 2010求取試驗數(shù)據(jù)的平均值、標準偏差，構建柱形圖，采用SPSS Statistics 26的Duncan’s新復極差法進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 ?結 ?果

2.1 ?病害田間癥狀及菌株致病性的測定

如圖1A所示，病斑不規(guī)則或近圓形，有輪紋，中間白色至淡黃褐色，且著生較密集黑點，靠近邊緣處呈深褐色。采用組織分離法分離菌株，后經(jīng)純化獲得一株單孢菌株，命名為GAXF2。利用活體傷口接種法接種菌株，2?d后取走菌餅，接種后第9天，煙葉接種點有明顯病斑，呈褐色，周圍有黃色暈圈（圖1B），發(fā)病煙葉的組織明顯變薄，韌性變差?；亟拥玫降牟∪~再次制片鏡檢，觀察到大量的分生孢子，并分離獲得與病株初分離物菌落形態(tài)相同的真菌菌株，根據(jù)科赫氏法則，證實該菌為此次導致煙草發(fā)生葉斑病的病原菌。

2.2 ?病原菌培養(yǎng)性狀及顯微形態(tài)特征

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，菌落平均直徑為33 mm，菌落呈圓形。生長初期，菌落氣生菌絲淡黃色，生長后期，部分菌落的氣生菌絲逐漸由淡黃色變?yōu)殚偕灵蠙炀G、黑褐色，另外一部分菌落的氣生菌絲始終為淡黃色，前者易產(chǎn)孢而后者不產(chǎn)孢。菌落質(zhì)地稍平伏狀，有短絨毛，邊緣鋸齒狀、圓齒狀或波浪狀（圖2A-C），菌落氣生菌絲顏色以及邊緣形狀均與MAYONJO等描述的平頭炭疽（）培養(yǎng)性狀一致。顯微鏡下觀察，分生孢子單孢，無隔膜，透明，光滑，無油球，平均大小（7.8～12.9）×（2.2～3.5）μm，鐮刀形，為彎孢型（圖2D），區(qū)別于其他5種已報道的煙草炭疽病直孢型病原菌；菌絲粗細不一，部分有隔膜（圖2E）；有典型的炭疽菌顯微形態(tài)特征，即橙黃色的載孢體-分生孢子盤，其上著生剛毛，褐色或深褐色，釘子狀，有4～6個橫隔（圖2F-G）。

2.3 ?病原菌分子鑒定結果

利用、和基因片段擴增、測序，將測序結果提交至NCBI進行Blast對比分析，結果顯示與平頭炭疽（）相似度高達99%～100%，測序結果上傳至GenBank，獲取登錄號（：OP484886；：OP620430；：OP620436）。從GenBank中下載同屬不同種、同屬同種以及不同種不同屬的菌株、、和序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示（圖3-5），GAXF2菌株與聚為一支，且支持率100%，證實廣西煙草炭疽病的病原菌為。

2.4 ?病原菌生物學特性

2.4.1 ?不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響??如圖6所示，最適合GAXF2菌株生長的培養(yǎng)基為NA，菌落平均直徑達52.83 mm，且與其他處理差異顯著（<0.05），CA也有利于該病原菌生長，平均直徑為48.33 mm。MEA、V8和OA也為病原菌提供了適宜生長的環(huán)境，三者間的菌落直徑差異不顯著；而WA、CDA、PDA和PNA不利于病原菌生長。

2.4.2 ?溫度對病原菌菌絲生長的影響??如圖7所示，GAXF2菌株在10～35 ℃均能生長。從10 ℃到30℃，病原菌生長速度隨溫度升高而升高，在30 ℃溫度條件下生長最快，平均直徑達29.00 mm，其次分別是28 ℃和25 ℃，平均直徑為28.33 mm和26.50 mm，這3種溫度條件下的菌落直徑與其他溫度處理差異顯著。35 ℃溫度條件下，病原菌生長速度減緩，且從2～3 d開始，菌落中心產(chǎn)生大量分生孢子盤。

2.4.3 ?光照條件對病原菌菌絲生長的影響??如圖8所示，在3種光照條件下GAXF2菌株均能生長，全黑暗條件最適合病原菌生長，平均菌落直徑達33 mm，菌絲顏色呈淡黃色，全光照和12 h光暗交替條件下菌絲均呈現(xiàn)橘色。

2.4.4 ?不同碳源對病原菌菌絲生長的影響??如圖9所示，GAXF2菌株能利用多種碳源。淀粉作為碳源時最有利于菌落生長，菌落的平均直徑達51.67 mm，顯著高于其他碳源處理；麥芽糖和山梨糖作為碳源時，病原菌生長速度也較快，菌落直徑分別達45.33 和45.00 mm，兩種碳源處理差異不顯著；最不適于病原菌生長的碳源為木糖，菌落平均直徑僅22.33 mm，顯著低于其他碳源處理。

2.4.5 ?不同氮源對病原菌菌絲生長的影響??如圖10所示，GAXF2菌株可以利用多種氮源，蛋白胨、酵母粉和牛肉浸粉作為氮源時，菌落直徑顯著高于其他氮源處理，分別為51.83、51.67及51.00 mm，3種氮源處理間差異不顯著；以尿素和精氨酸作為氮源時，菌落生長情況最差，菌落平均直徑僅為25.83 mm和25.17 mm，顯著低于其他氮源處理。

2.4.6 ?pH對病原菌菌絲生長的影響??如圖11所示，GAXF2菌株在弱酸和弱堿環(huán)境中均能生長，pH為7時菌落平均直徑最大，為38.83 mm，其次為pH 8時（38.17 mm），兩個pH處理間差異不顯著。pH為4時，菌落平均直徑最小，為27.83 mm，顯著低于其他處理。

2.4.7 ?病原菌致死溫度的測定??35～50 ℃水浴加熱10 min，GAXF2菌株皆存活，55 ℃水浴加熱10 min，病原菌死亡，說明病原菌的致死溫度在51～55 ℃之間。之后分別設51、52、53、54和55 ℃共5個溫度梯度，結果顯示菌株致死溫度為53 ℃、10 min。

3 ?討 ?論

炭疽菌屬種類達600種，可侵染3200多種植物。研究發(fā)現(xiàn)，毀滅炭疽菌（）、煙草炭疽菌（）、黑線炭疽菌（）、膠胞炭疽菌（）和果生炭疽菌（）都能侵染煙草導致煙草炭疽病的發(fā)生。本研究采用形態(tài)學特征、分子生物學鑒定及科赫氏法則，明確了引起廣西壯族自治區(qū)賀州市鐘山縣煙草炭疽病的病原菌為平頭炭疽（），這是寄生煙草導致煙草炭疽病的首次報道。本研究結果豐富了煙草炭疽病病原菌的多樣性，為煙草炭疽病的精準識別和防控提供了理論依據(jù)，有關平頭炭疽菌對煙草炭疽病的致病機理還需進一步研究。

本研究結果顯示，GAXF2菌株在13種不同的培養(yǎng)基上均能生長，在NA培養(yǎng)基生長直徑最大，為最適培養(yǎng)基。該病原菌10～35 ℃均能生長，致死溫度為53 ℃、10 min，有較強的溫度適應能力。其中30 ℃時病原菌生長最快，這與孫志峰等研究結果一致。不同光照條件下菌落直徑略有不同，全

黑暗條件最適病原菌菌絲生長，全光照和光暗交替有利于產(chǎn)孢。病原菌有廣泛的碳氮源適應性，在供試的不同碳、氮源培養(yǎng)基中均能生長，淀粉和蛋白胨分別為最適的碳、氮源，以尿素作為氮源時，菌落生長情況不理想，以尿素作為氮肥時可能對引起的煙草炭疽病有一定的抑制作用。病原菌在弱酸至弱堿環(huán)境中均能生長，更適應于中性偏堿性的環(huán)境。

研究結果與分離自其他植物的同種病原的生物學特性差異較大，如分離自降香黃檀的平頭炭疽菌株在全光照條件下菌絲生長更快，分離自四季秋海棠的平頭炭疽最適碳源為葡萄糖，最適氮源為硝酸鈉和甘氨酸，推測是因為其進化、變異或者地域環(huán)境、寄主差異導致。同時，病原菌在不同培養(yǎng)基、溫度、光照、碳源、氮源和pH條件下均能生長，證明其有較強的環(huán)境適應性，有利于病原菌的傳播，生產(chǎn)中應注意及時防治。

本研究僅采集廣西壯族自治區(qū)一個區(qū)域的煙草炭疽病病樣，有一定局限性，不能完全代表其他區(qū)域煙草炭疽病病原菌的種類，下一步工作擬增加采樣地點，明確的傳播繁育范圍，以及由該病原菌導致炭疽病的發(fā)病率和病情指數(shù)，為煙葉生產(chǎn)中病害的精準防治提供理論依據(jù)。

4 ?結 ?論

本研究采用形態(tài)學特征結合分子鑒定，確定廣西壯族自治區(qū)賀州市鐘山縣發(fā)生的真菌性葉斑病害病原菌為平頭炭疽（，這是寄生煙草的首次報道。生物學特性測定結果表明，該病原菌有較強的適應性，適應于各種培養(yǎng)基、溫度、光照條件、碳氮源以及pH，且在中性偏弱堿性，光照較弱且營養(yǎng)充足的環(huán)境下，生長速度更快。生產(chǎn)中，可以通過創(chuàng)造偏酸性的環(huán)境以及適當增加株行距以增大光照等方式，對引起的煙草炭疽病進行綜合防控，降低該病害的發(fā)病率。

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