大鼠腸囊外翻法分析核桃肽吸收特性及抗氧化肽篩選鑒定

李浩銘，李維佳，李 佳，方 麗，宋佳淇，吳 丹，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

生物活性肽是由2～20 個(gè)不同氨基酸組成、具有組織親和力高、安全性好且在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮較強(qiáng)生理活性的一類物質(zhì)[1]。按照來源劃分，生物活性肽可分為內(nèi)源肽和外源肽。內(nèi)源肽常以酶、激素等形式在機(jī)體中發(fā)揮生理作用[2]，但食物中攝取的外源肽不同于內(nèi)源肽，其需要借助人體消化系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)才能發(fā)揮活性功能[3]。外源肽的利用必須克服胃腸消化酶的分解和穿透小腸上皮細(xì)胞形成的腸道屏障[4]，許多長肽在胃的酸性條件下已被分解成短肽，無法完整進(jìn)入小腸，而一些短肽已有研究證實(shí)其能耐受胃酸的條件，但小腸吸收率低，生物利用度低[5]。有研究證實(shí)小腸壁表面含有許多刷狀緣肽酶，多肽必須成功抵抗刷狀緣肽酶水解才能被完整吸收，二肽基肽酶（DPPIV）是在腸道中密集分布且活性最高的刷狀緣肽酶[6-7]，其是一種可裂解多肽N末端二肽的絲氨酸蛋白酶，當(dāng)多肽殘基末端倒數(shù)第二氨基酸是脯氨酸、羥基脯氨酸、脫氫脯氨酸或丙氨酸時(shí)，DPP-IV 與之結(jié)合能力較強(qiáng)[8]。Suzuki 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，涉及甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的肽鍵不易被大多數(shù)胃和胰腺蛋白酶水解。因此，含有脯氨酸、羥基脯氨酸、脫氫脯氨酸或丙氨酸的多肽可通過與DPP-IV 結(jié)合而抵抗腸消化酶水解作用，從而以完整形式吸收。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到不同應(yīng)激原刺激或病原菌感染時(shí)，產(chǎn)生大量自由基，特別是活性氧（reactive oxygen species，ROS）通過氧化還原機(jī)制對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的氧化損傷[10]。氧化應(yīng)激已被證明是許多常見疾病的發(fā)病誘因之一，如高血壓[11]、慢性阻塞性肺病[12]等。因此，抗氧化劑的挖掘利用對(duì)人類健康至關(guān)重要。又因天然成分安全性更高，而使天然抗氧化劑的篩選成為抗氧化成分挖掘的新方向。核桃蛋白通過酶解純化并篩選鑒定后得到特定核桃肽序列[13]，已有研究證實(shí)了某些特定核桃肽具有抗氧化[14]、改善記憶力[15]等生理功能。王薇等[16]通過酶水解法制備核桃蛋白水解物，并通過ORAC 法和H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞篩選出3 條抗氧化肽QGRPWG、PSRADIY 和AYNIPVNIAR。然而，活性肽完整高效吸收是其發(fā)揮活性功能的前提，近幾年活性肽的生理功能被不斷拓展，但關(guān)于活性肽吸收與生理活性的關(guān)系及活性肽氨基酸組成與吸收的關(guān)系相關(guān)研究鮮有報(bào)道，探索活性肽的吸收特性及肽吸收與功能活性的關(guān)系成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，因體內(nèi)動(dòng)物消化吸收模型具有周期長、消耗大等特點(diǎn)，構(gòu)建體外模擬消化吸收模型已成為研究者關(guān)于研究生物活性分子吸收問題的新方法[17-18]，已有許多學(xué)者通過建立體外大鼠外翻腸囊模型進(jìn)行了營養(yǎng)組分評(píng)價(jià)[19]，如礦物質(zhì)[20]、脂肪酸[21]、糖醇[22-23]和黃酮物質(zhì)[24]的吸收特性及生物利用度已有明確報(bào)道。丁龍[25]利用Caco-2 細(xì)胞單層膜和外翻大鼠腸囊模型研究了蛋清蛋白模擬消化水解物混合肽的吸收情況。

因此，本研究通過大鼠腸囊外翻法和抗氧化活性測定研究了核桃肽消化產(chǎn)物的抗氧化活性和其吸收特性明確活性肽在腸道吸收的最優(yōu)條件，繼而利用Nano-HPLC-MS/MS 和分子對(duì)接技術(shù)篩選鑒定出與DPP-IV 穩(wěn)定結(jié)合且能完整高效吸收的抗氧化活性肽，為核桃源高效吸收抗氧化肽開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃蛋白肽混合物 由脫脂核桃粕酶解超濾制得，分子量＜3 kDa（純度≥85%，氨基酸≥15%），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室自制[26]；健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠 33 只 體質(zhì)量200～220 g，遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：NO.SCXK（遼）2020-0001）；5% w/v 水合氯醛 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯(lián) 氮-二（3-乙 基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、谷胱甘肽（GSH）美國Sigma 有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Fluoroskan Ascent FL 熒光酶標(biāo)儀、串聯(lián)EASYnanoLC1200 的Orbitrap Fusion 質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；UNIC-7200 紫外分光光度計(jì)成都泰盟科技有限公司；Allegra X-22 型臺(tái)式高速離心機(jī) 北京東訊天地醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同分子量核桃肽抗氧化性的測定

1.2.1.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參照Yang等[27]的方法，向試管中加入2 mL 核桃肽溶液和2 mL 60 μmol/L 的DPPH 溶液（乙醇溶解），混合均勻后避光放置30 min，在517 nm 波長下測吸光值。取同濃度的GSH 作為陽性對(duì)照。清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為用蒸餾水代替核桃肽溶液的空白吸光值；A1為核桃肽溶液吸光值；A2為不加DPPH 溶液的對(duì)照吸光值。

1.2.1.2 ABTS＋自由基清除能力的測定 參照Song等[28]的方法，制備ABTS+自由基儲(chǔ)備液：7 mmol/L的ABTS 水溶液和2.49 mmol/L 的過硫酸鉀水溶液等體積混合，避光放置12～16 h，4 ℃保存。配制ABTS+自由基工作液：加入5 mmol/L 的PBS 稀釋，使溶液在734 nm 波長下吸光度為0.700±0.002。測定時(shí)，向96 孔板每孔加入10 μL 核桃肽溶液和190 μL ABTS+自由基工作液，6 min 后于734 nm 波長下測定吸光值。取同濃度的GSH 作為陽性對(duì)照。清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為用蒸餾水代替核桃肽溶液的空白吸光值；A1為核桃肽溶液吸光值；A2為不加ABTS 溶液的對(duì)照吸光值。

1.2.1.3 Fe2+螯合能力的測定 參照Zhang 等[29]的方法，在試管中依次加入0.5 mL 核桃肽溶液，1 mL 20 μmol/L 的FeCl2溶液和1 mL 0.5 mmol/L 菲洛嗪，混勻后25 ℃，水浴20 min 后，于562 nm 波長下測吸光值。取同濃度的EDTA 作為陽性對(duì)照。Fe2+螯合率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為用蒸餾水代替核桃肽溶液的空白吸光值；A1為核桃肽溶液吸光值；A2為不加菲洛嗪的對(duì)照吸光值。

1.2.2 構(gòu)建大鼠離體腸囊外翻模型 本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（吉）2018-0023）的建議進(jìn)行（倫理審查受理號(hào)：20210311002）。參考Wei 等[30]的方法并進(jìn)行部分修改。將購買的33 只大鼠隨機(jī)分成1 個(gè)空白組，5 個(gè)濃度組（2、4、6、8、10 mg/mL），保持2 h 的孵育時(shí)間；5 個(gè)時(shí)間組（1、1.5、2、2.5、3 h），保持6 mg/mL的黏膜側(cè)肽濃度，每組3 只平行實(shí)驗(yàn)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，禁食15 h 后開始實(shí)驗(yàn)。抓取大鼠待其狀態(tài)平穩(wěn)后腹腔注射4%水合氯醛（劑量：10 μL/g，以大鼠體重計(jì)算）麻醉，隨后通過腹部切口快速取出大鼠小腸（十二指腸、空腸、回腸）并采用斷頭法處死大鼠，將小腸用預(yù)冷生理鹽水清洗去除腸內(nèi)容物后在4 ℃，通入95% O2的緩沖液中將腸囊外翻，漿膜側(cè)加入1 mL KRB-IPA 緩沖液（pH7.4），腸囊兩端扎緊，黏膜側(cè)放入不同濃度分子量＜3 kDa 核桃肽腸消化產(chǎn)物中，37 ℃恒溫水浴處理相應(yīng)時(shí)間后取出腸囊，收集腸囊漿膜側(cè)溶液?？瞻捉M采用等量KRBIPA 緩沖液（pH7.4）替代分子量＜3 kDa 核桃肽腸消化產(chǎn)物溶液。

1.2.3 肽吸收率測定 利用紫外可見光光度計(jì)在270 nm 處測定大鼠離體腸囊外翻法收集的黏膜側(cè)和漿膜側(cè)樣品肽濃度，并計(jì)算肽吸收率，計(jì)算公式如下：

式中：A1為漿膜側(cè)肽含量；A2為黏膜側(cè)肽含量。

1.2.4 核桃肽體外消化產(chǎn)物抗氧化能力測定 分別選取小腸的不同部位（十二指腸、空腸、回腸）、肽濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）和轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h）作為3 個(gè)變量，測定核桃肽漿膜側(cè)肽溶液抗氧化活性（考察核桃肽濃度對(duì)漿膜側(cè)肽溶液抗氧化活性的影響時(shí)，以肽濃度為變量，控制轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間為2 h；考察轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間對(duì)漿膜側(cè)肽溶液抗氧化活性的影響時(shí)，以轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間為變量，控制核桃肽濃度為6 mg/mL）。

1.2.5 Nano-HPLC-MS/MS 分析 收集大鼠腸囊漿膜側(cè)溶液，對(duì)其冷凍干燥制成粉末，并采用C18除鹽柱進(jìn)行除鹽后，采用Acclaim PepMap C18（75 μm×25 cm）分析柱；進(jìn)樣量8 μL；流量300 nL/min，流動(dòng)相A 相：0.1%甲酸水溶液；B 相：含0.1%甲酸的乙腈溶液，柱溫40 ℃，電噴霧電壓2 kV。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：MS 掃描范圍100～1500 m/z，分辨率=70000，AGC target=3e6，最大注入時(shí)間 50 ms；HCD-MS/MS（top 20）：分辨率=17500，隔離窗口=2 m/z，AGC target=1e5，最大注入時(shí)間45 ms，碰撞能量為28 ev，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間=30 s。

根據(jù)Nano-HPLC-MS/MS 鑒定得到的de novo表對(duì)肽濃度6 mg/mL 吸收2 h 十二指腸部分大鼠腸囊漿膜側(cè)活性肽序列信息進(jìn)行整理總結(jié)，分析可被吸收的肽結(jié)構(gòu)特征。

1.2.6 分子對(duì)接 通過Discovery Studio 2017 R2（Biovia，San Diego，CA，USA）模擬大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)Nano-HPLC-MS/MS 鑒定后且具有抗氧化特征氨基酸的肽序列與DPP-IV 的相互作用，并使用CHARMm 力場使其能量最小化。DPP-IV 的晶體結(jié)構(gòu)來源于PDB 數(shù)據(jù)庫（5T4B），可在https://www.rcsb.org 獲得。根據(jù)結(jié)合能得分，評(píng)估活性肽與DPPIV 結(jié)合的穩(wěn)定性。

1.2.7 合成肽制備及抗氧化活性測定 委托合肥賽曼諾生物科技有限公司完成，采用固相合成技術(shù)對(duì)肽NLRFPL（Asn-Leu-Arg-Phe-Pro-Leu，純 度98.65%）、KGHLFPN（Lys-Gly-His-Leu-Phe-Pro-Asn，純度98.07%）和NPDDEFRPQ（Asn-Pro-Asp-Asp-Glu-Phe-Arg-Pro-Gln，純度98.04%）進(jìn)行分別合成。

具體方法同1.2.1，分別配制0.2 mg/mL 合成肽溶液，以DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、Fe2+螯合能力為指標(biāo)，比較NLRFPL、KGHLFPN、NPDDEFRPQ 的抗氧化能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少平行重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析和Duncancs多重檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)差異性，P＜0.05 表示有差異性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0 軟件分析，圖形采用Origin 9.0 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量核桃肽抗氧化能力測定

采用DPPH、ABTS、FRAP 法測定了經(jīng)脫脂核桃粕酶解超濾得到的不同分子量核桃肽（1 mg/mL）的抗氧化活性。如圖1A 所示，經(jīng)過酶解超濾后分子量＜3 kDa 核桃肽的DPPH 自由基清除率（93.58%±0.85%）顯著高于3～10 kDa 核桃肽（87.01%±0.92%）和＞10 kDa 核桃肽（84.04%±1.03%）（P＜0.05），并與1 mg/mL 谷胱甘肽GSH（95.21%±0.75%）無顯著差異（P＞0.05）。ABTS 在氧化劑作用下會(huì)氧化成綠色的ABTS+自由基，有自由基清除劑存在時(shí)，ABTS+產(chǎn)生被抑制，通過測定吸光度即可得出樣品清除ABTS+自由基的能力；如圖1B 所示，ABTS+自由基清除率結(jié)果與DPPH 相似，＜3 kDa 核桃肽（82.35%±0.74%）顯著高于3～10 kDa 核桃肽（74.21%±0.72%）和＞10 kDa核桃肽（70.31%±1.03%）（P＜0.05）。FRAP 測定結(jié)果如圖1C 所示，F(xiàn)e2+的存在會(huì)加速脂質(zhì)氧化的過程，通過測定物質(zhì)對(duì)Fe2+螯合能力可以評(píng)估樣品的抗氧化能力。經(jīng)過酶解超濾后分子量＜3 kDa 核桃肽的Fe2+螯合能力（93.46%±1.07%）顯著高于3～10 kDa 核桃肽（82.46%±1.15%）和＞10 kDa 的核桃肽（85.05%±0.63%），并與1 mg/mL EDTA（94.30%±0.87%）無顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明經(jīng)過酶解后，分子量較小的肽組分被釋放，分子量低的肽穿過腸道屏障能力更強(qiáng)，更利于發(fā)揮其活性，且小分子肽容易與脂質(zhì)自由基反應(yīng)，減少了自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用，從而具有更好的抗氧化活性。關(guān)海寧等[31]通過測定大豆分離蛋白水解肽DPPH 自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力發(fā)現(xiàn)分子量與其抗氧化能力呈顯著負(fù)相關(guān)。Liu 等[32]已證明低分子量肽組分比高分子量肽組分具有更高的抗氧化能力。因此，本文選擇分子量＜3 kDa 核桃肽進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同分子量核桃蛋白肽的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of walnut protein peptides with different molecular weights

2.2 核桃肽體外消化產(chǎn)物抗氧化能力測定

2.2.1 核桃肽濃度對(duì)漿膜側(cè)肽溶液抗氧化活性的影響 分別采用DPPH、ABTS、FRAP 法測定了經(jīng)大鼠腸囊外翻實(shí)驗(yàn)后黏膜側(cè)不同初始濃度的肽溶液對(duì)吸收后腸囊漿膜側(cè)肽抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2A 可知，經(jīng)過相同的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，漿膜側(cè)肽DPPH 自由基清除率隨黏膜側(cè)肽濃度的增加而增加而后趨于穩(wěn)定，在黏膜側(cè)肽濃度為6 mg/mL 時(shí)，DPPH 清除率在十二指腸（78.99%±1.76%）達(dá)到最高；圖2B 可得到相似結(jié)果，當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間相同時(shí)，漿膜側(cè)肽ABTS+自由基清除率也隨黏膜側(cè)肽濃度的增加而提高，同樣在濃度為6 mg/mL 時(shí)，十二指腸漿膜側(cè)肽ABTS+自由基清除率為最高（60.04%±1.22%），而后ABTS+自由基清除率無顯著變化（P＞0.05）。圖2C的FRAP 測定結(jié)果也驗(yàn)證了圖2A、圖2B 的結(jié)果，在黏膜側(cè)肽濃度增加到6 mg/mL 時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率達(dá)到峰值，分別為十二指腸（84.67%±1.65%）、空腸（82.67%±1.37%）、回腸（79.36%±1.67%）。綜上，核桃肽模擬腸消化產(chǎn)物初始濃度為6 mg/mL 時(shí)，經(jīng)腸囊外翻實(shí)驗(yàn)后漿膜側(cè)肽的抗氧化能力最強(qiáng)。6 mg/mL是核桃肽模擬腸消化產(chǎn)物小腸吸收發(fā)揮抗氧化活性的最佳濃度，而過量的肽可能受到腸道屏障的限制無法完成轉(zhuǎn)運(yùn)過程或被外排作用排出。然而，促進(jìn)肽在腸道的吸收是提高其生物利用度的關(guān)鍵，抗氧化能力測定結(jié)果顯示了十二指腸漿膜側(cè)肽抗氧化能力均略高于空腸和回腸，但無顯著差異。

圖2 大鼠外翻腸囊黏膜側(cè)肽濃度對(duì)漿膜側(cè)肽溶液抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of the concentration of the peptide of the everted rat sacs mucosal side on the antioxidant activity of the serosal side peptide solution

2.2.2 不同轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間對(duì)漿膜側(cè)肽溶液抗氧化活性的影響 如圖3A 所示，保持相同的黏膜側(cè)肽濃度，大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)肽溶液的DPPH 自由基清除率隨轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的增加而提高后趨于穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)運(yùn)2 h 時(shí)達(dá)到最大值，分別為十二指腸（78.21%±1.25%）、空腸（73.26%±0.68%）、回腸（70.57%±1.16%）。由圖3B也可知，ABTS+自由基清除率隨轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的延長而增加，同樣在2 h 時(shí)達(dá)到最大值，分別為十二指腸（63.65%±1.49%）、空腸（55.76%±1.10%）、回腸（50.64%±1.16%）。圖3C 也可得到相似結(jié)果，在轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間2 h 時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率為最高值，而后無顯著差異（P＞0.05）。因此，2 h 為核桃肽模擬腸消化產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化活性的最優(yōu)時(shí)間。

圖3 不同轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間對(duì)大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)肽溶液抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of different transport time on the antioxidant activity of serosal side peptide solution of everted rat sacs

綜合圖2 和圖3 結(jié)果表明，6 mg/mL 是核桃肽體外模擬腸消化產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化活性的最佳濃度，2 h 是其小腸吸收后發(fā)揮活性的最優(yōu)時(shí)間。

2.3 核桃肽在大鼠外翻腸囊中的吸收情況

如圖4 所示，以大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)肽濃度為檢測指標(biāo)，保持相同的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，腸囊黏膜側(cè)肽濃度為6 mg/mL 時(shí)十二指腸部分肽吸收率（49.63%±3.08%）顯著高于空腸（17.30%±2.57%）和回腸（12.61%±2.06%）部分（P＜0.05），同時(shí)腸囊黏膜側(cè)6 mg/mL 肽濃度小腸的吸收率達(dá)到最高值而后趨于穩(wěn)定，表明6 mg/mL 是核桃肽小腸吸收的初始飽和濃度。如圖5 所示，以核桃肽模擬腸消化產(chǎn)物不同轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間為單因素變量，對(duì)大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)肽濃度進(jìn)行測定，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間2 h 時(shí)，十二指腸肽吸收率（51.50%±2.93%）顯著高于空腸肽吸收率（21.72%±3.48%）和回腸肽吸收率（13.29%±2.15%）（P＜0.05），且轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間2 h 時(shí)小腸肽吸收率達(dá)到最大值而后趨于穩(wěn)定，表明2 h 是核桃肽小腸吸收的最優(yōu)時(shí)間。

圖4 大鼠外翻腸囊不同黏膜側(cè)肽濃度的肽吸收率Fig.4 Peptide absorption rate of different mucosal side peptide concentrations in everted rat sacs

綜上，6 mg/mL 是核桃肽小腸吸收的初始飽和濃度，2 h 是核桃肽小腸吸收的最大時(shí)間。小腸轉(zhuǎn)運(yùn)是動(dòng)態(tài)平衡的過程，物質(zhì)在小腸吸收時(shí)也伴隨少量的外排作用，大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)和黏膜側(cè)隨肽濃度的增加，時(shí)間的延長，腸囊逐漸趨于飽和狀態(tài)，達(dá)到小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的最大量。

2.4 大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)肽組分 Nano-HPLC-MS/MS 鑒定

2.4.1 大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)肽組分分子量分布 對(duì)肽濃度6 mg/mL 吸收2 h 十二指腸部分大鼠腸囊漿膜側(cè)活性肽Nano-HPLC-MS/MS 鑒定結(jié)果的de novo表活性肽分子量進(jìn)行整理總結(jié)，由圖6 可知，大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)分子量＞2 kDa 的肽序列102 條，分子量1～2 kDa 的肽序列6607 條，分子量0.5～1 kDa 的肽序列16543 條，＜0.5 kDa 的肽序列2590 條，大鼠腸囊漿膜側(cè)核桃肽序列平均分子量792 Da，分子量584 Da 的肽序列居多，表明核桃肽在穿過大鼠小腸時(shí)發(fā)生分解，大分子長肽與消化酶結(jié)合位點(diǎn)多于小分子肽，因此大分子肽更易被分解為小分子短肽，更有利于小腸吸收而發(fā)揮其活性。

圖6 大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)不同分子量肽序列數(shù)量分布Fig.6 Number distribution of peptide sequences with different molecular weights on serosal side of everted rat sacs

對(duì)肽濃度6 mg/mL 吸收2 h 十二指腸部分大鼠腸囊漿膜側(cè)活性肽Nano-HPLC-MS/MS 鑒定結(jié)果的de novo 表活性肽末端氨基酸組成進(jìn)行整理總結(jié)，由表1 可知，暴露于C 端/N 端的Pro、Thr、Leu 數(shù)量明顯高于其他氨基酸，表明肽經(jīng)過消化吸收過程，與疏水性氨基酸相連的肽鍵更容易斷裂，疏水性氨基酸含量增加可能是其抗氧化能力提高的原因，姜穎俊等[33]研究了綠豆抗氧化肽的制備，也證明了綠豆肽的抗氧化活性與其氨基酸組成及疏水性結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。Chen 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，His、Cys、Pro、Tyr、Lys和Arg 等是抗氧化肽中常見的氨基酸組成。因此，活性肽抗氧化能力與疏水性氨基酸組成密切相關(guān)。

表1 大鼠外翻腸囊漿膜側(cè)肽序列末端氨基酸組成Table 1 Amino acid composition at the end of serosal side peptide sequence of everted rat sacs

對(duì)肽濃度6 mg/mL 吸收2 h 十二指腸部分大鼠腸囊漿膜側(cè)活性肽Nano-HPLC-MS/MS 鑒定結(jié)果的de novo 表活性肽氨基酸組成進(jìn)行整理總結(jié)。表2表明與腸囊黏膜側(cè)肽序列對(duì)比后，在腸囊漿膜側(cè)鑒定出的33 條可被小腸完整吸收的核桃源新型肽的Nano-HPLC-MS/MS 鑒定結(jié)果，肽鏈長度方面，共對(duì)比篩選出五肽20 條，四肽7 條，六肽3 條，七肽、九肽、十肽各1 條；氨基酸組成方面，疏水性氨基酸顯著多于親水性氨基酸，表明含有疏水性氨基酸短肽可能更有利于肽在小腸完整形式吸收。

綜上，活性肽的分子量隨著消化吸收的進(jìn)行而降低，疏水性氨基酸等不斷暴露。Beau 等[35]證明了低分子量（＜1 kDa）肽具有高抗氧化活性，這可能是因?yàn)榈头肿恿侩母欣谌梭w腸道吸收。同時(shí)氨基酸組成也是影響肽抗氧化活性的關(guān)鍵因素。Chi 等[36]報(bào)道了疏水性氨基酸含量高的肽可以通過與細(xì)胞膜的疏水性相互作用順利進(jìn)入靶器官，其豐富的電子可以用于淬滅自由基。因此，低分子量且疏水性氨基酸含量高的短肽可能具有較高的抗氧化活性。

2.5 分子對(duì)接探究核桃肽與DPP-IV 相互作用及抗氧化肽篩選鑒定

2.5.1 核桃肽與DPP-IV 相互作用 有研究證實(shí)肽鏈中疏水性氨基酸對(duì)其抗氧化活性貢獻(xiàn)最大，且P、L、N、H 是抗氧化肽的特征性氨基酸，C 端第三個(gè)氨基酸為W、Y、F、M、L、I 的肽鏈結(jié)構(gòu)也有助于增強(qiáng)多肽抗氧化活性[37]。因此，對(duì)肽濃度6 mg/mL 吸收2 h 十二指腸部分大鼠腸囊漿膜側(cè)活性肽進(jìn)行Nano-HPLC-MS/MS 鑒定得到表2 中33 條小腸可完整形式吸收的核桃源新型肽，從中選取29 條具有特征性氨基酸的肽序列，與DPP-IV 進(jìn)行分子對(duì)接得到表3結(jié)果。如表3 所示，3 條含有脯氨酸的肽NLRFPL、KGHLFPN 和NPDDEFRPQ 與DPP-IV 的結(jié)合能最低分別為-8.8、-8.6 和-8.6 kcal/mol，因此，NLRFPL、KGHLFPN 和NPDDEFRPQ 是能夠與DPP-IV 位點(diǎn)結(jié)合的最穩(wěn)定肽序列。陳靜等[38]研究發(fā)現(xiàn)，乳源肽中含有脯氨酸的肽LPLP 和QEPV 是通過與DPP-IV活性部位結(jié)合發(fā)揮其活性作用，并推斷含脯氨酸多肽的構(gòu)型與DPP-IV 活性位點(diǎn)結(jié)合相關(guān)。因此，NLRFPL、KGHLFPN 和NPDDEFRPQ 具有脯氨酸（P）、特征疏水性氨基酸（L、N、H），推測其抗氧化活性可能高于其他肽序列。

2.5.2 活性肽抗氧化能力測定 選取0.2 mg/mL 的肽濃度，分別對(duì)3 種DPP-IV 結(jié)合穩(wěn)定的肽進(jìn)行了抗氧化能力測定。由圖7A 可知，以GSH 為陽性對(duì)照，3 種肽的DPPH 自由基清除率分別為KGHLFPN（66.32%±1.03%）、NLRFPL（60.21%±1.96%）、NPDDEFRPQ（43.25%±2.43%），KGHLFPN 的DPPH 自由基清除能力顯著高于NPDDEFRPQ 和NLRFPL（P＜0.05）。由圖6B 可知，3 種肽的ABTS+自由基清除率分別為KGHLFPN（52.32%±2.03%）、NLRFPL（50.21%±1.99%）、NPDDEFRPQ（32.25%±2.43%），KGHLFPN 的ABTS+自由基清除能力顯著高于NPDDEFRPQ（P＜0.05），略高于NLRFPL 但無顯著差異（P＞0.05）。由圖6C 可知，以EDTA 為陽性對(duì)照，3 種肽的Fe2+螯合率分別為KGHLFPN（70.32%±1.53%）、NLRFPL（65.21%±2.98%）、NPDDEFRPQ（50.25%±3.03%），KGHLFPN 的Fe2+螯合能力顯著高于NPDDEFRPQ（P＜0.05），略高于NLRFPL 但無顯著差異（P＞0.05）。因此，KGHLFPN 是抗氧化活性最佳的肽序列。

圖7 DPP-IV 結(jié)合肽抗氧化能力測定Fig.7 Determination of antioxidant capacity of DPP-IV binding peptide

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過大鼠外翻腸囊法和抗氧化能力測定（DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率、Fe2+螯合率），利用Nano-HPLC-MS/MS 和模擬分子對(duì)接技術(shù)，篩選出核桃肽的小腸吸收最優(yōu)條件為核桃肽消化產(chǎn)物濃度6 mg/mL，吸收時(shí)間為2 h，并篩選出與DPP-IV 結(jié)合穩(wěn)定且抗氧化能力最佳的核桃源肽KGHLFPN，為促進(jìn)功能因子在小腸吸收進(jìn)入血液循環(huán)作用于其靶點(diǎn)器官發(fā)揮生理活性奠定理論基礎(chǔ)，為開發(fā)小腸高效吸收的核桃源抗氧化肽提供理論參考。然而，本研究并未繼續(xù)探索核桃肽KGHLFPN的吸收機(jī)制，因此核桃肽KGHLFPN 吸收途徑及吸收通路還有待進(jìn)一步研究，同時(shí)對(duì)核桃肽KGHLFPN的體內(nèi)生理活性功能有待進(jìn)一步探索。