二代交叉引物恒溫擴增技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌檢測的應(yīng)用價值

王燕 歐維正 楊秀章 楊毅

(貴陽市公共衛(wèi)生救治中心檢驗科,貴州 貴陽 550003)

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病。多色巢式熒光定量PCR(Xpert MTB/RIF)作為快速分子診斷技術(shù)于2010年12月由WHO推薦[1],因其具有較高的靈敏性和特異性,操作簡便且快速,已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。交叉引物恒溫擴增技術(shù)(CPA)是一種新穎的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)方法[2],也是我國首個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴增技術(shù),相對Xpert MTB/RIF而言,CPA檢測MTB的臨床應(yīng)用更具有價格優(yōu)勢。一代CPA(恒溫擴增-試紙條法)被證明是一種簡便、快速、特異的MTB檢測方法[3],并已獲得WHO所認(rèn)可[4],但因其手動處理步驟較多,限制了它在工作量大的臨床實驗室中的使用,主要推薦在基層實驗室開展[5]。后續(xù)發(fā)展的二代CPA(恒溫擴增-實時熒光法)則可實現(xiàn)了多通道“一管式”全自動核酸分析,即在一個密閉檢測管內(nèi)完成核酸裂解結(jié)合、清洗、洗脫和擴增反應(yīng)。因此,本研究旨在評估二代CPA作為TB的快速分子診斷技術(shù)的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年7月至2022年7月本院收治患者送檢的各類標(biāo)本235例,其中,痰液98例、肺泡灌洗液76例、胸(腹)水37例、其它標(biāo)本(穿刺液及分泌物等)24例。所有標(biāo)本均經(jīng)研究對象知情同意后獲得,排除標(biāo)本不合格者、二代CPA和Xpert MTB/RIF檢測失敗者。

1.2試劑和儀器

1.2.1試劑 二代CPA檢測試劑為杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司的“結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒(恒溫擴增-實時熒光法 )”[注冊號為國械注準(zhǔn)20193401027 ];Xpert MTB/RIF檢測試劑為美國Cepheid公司的“Gene Xpert?MTB/RIF試劑盒”[注冊號為國食藥監(jiān)械(進)字2014第3401153號]。

1.2.2儀器 UC0108核酸擴增檢測分析儀(杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司)、Gene Xpert?檢測系統(tǒng)(美國Cepheid公司)等。

1.3檢測方法

1.3.1Xpert MTB/RIF檢測 取不少于2 mL標(biāo)本置于有螺旋蓋的前處理管中,然后加入相當(dāng)于1～2倍標(biāo)本體積的處理液,旋緊前處理管,在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s,室溫靜置15 min,使標(biāo)本充分液化。打開反應(yīng)盒,取2 mL處理后標(biāo)本從加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒,然后將反應(yīng)盒置于檢測模塊,儀器自動化檢測。反應(yīng)結(jié)束后,檢測結(jié)果可直接在檢測系統(tǒng)窗口下觀察。

1.3.2二代CPA檢測 取用于Xpert MTB/RIF檢測后剩余液化標(biāo)本1 mL加至1.5 mL離心管中, 14 170×g離心3 min,棄上清。同時將MTB-DNA提取液充分混勻,全部轉(zhuǎn)入MTB-內(nèi)標(biāo)管中,靜置10～20 s后,充分混勻至管底無可見紫色附著物。將混合液全部轉(zhuǎn)入已棄上清的標(biāo)本離心管中,充分混勻至管底無可見附著物。最后將總混合液全部轉(zhuǎn)入MTB-全自動檢測管中,蓋好管蓋上機檢測。以試劑盒自帶的MTB-陽性/陰性對照作為外部質(zhì)控。MTB檢測結(jié)果呈現(xiàn)典型S型擴增曲線(包括未到平臺期的S曲線),當(dāng)MTB Tt≤40時,MTB為陽性;否則MTB為陰性(同時滿足內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果接受標(biāo)準(zhǔn))。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。Xpert MTB/RIF和二代CPA對不同標(biāo)本類型的MTB陽性檢出率比較采用χ2檢驗,p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;二者的一致性比較采用Kappa檢驗,Kappa值0～0.20示極低的一致性,0.21～0.40示一般的一致性,0.41～0.60示中等的一致性,0.61～0.80示高度的一致性,0.81～1示幾乎完全一致。

2 結(jié) 果

2.1235例標(biāo)本同步進行Xpert MTB/RIF和二代CPA檢測,Xpert MTB/RIF檢測MTB陽性率為43.38%(103/235),二代CPA檢測MTB陽性率為42.13%(99/235)。不同標(biāo)本類型的MTB陽性檢出率比較見表1。

表1 Xpert MTB/RIF和二代CPA檢測各種標(biāo)本類型的MTB陽性率比較

2.2二代CPA與Xpert MTB/RIF對235例標(biāo)本檢測MTB的結(jié)果比較 二者對全部標(biāo)本的陽性符合率88.35%,陰性符合率93.94%,總符合率91.49%,一致性比較,Kappa=0.83。

2.3Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果為“MTB高”的標(biāo)本有11例,為“MTB中”的標(biāo)本有44例,為“MTB低”的標(biāo)本有30例,上述標(biāo)本二代CPA檢測均為MTB陽性;Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果為“MTB 極低”的標(biāo)本有18例,二代CPA檢測MTB陽性有6例,陰性有12例;Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果為“MTB 未檢出”的標(biāo)本有132例,二代CPA檢測MTB陽性有8例,陰性有124例。

3 討 論

有研究[6]中,LAMP、SAT和Xpert MTB/RIF一樣,對檢測MTB均表現(xiàn)出較高的靈敏性和特異性,明顯高于抗酸染色和羅氏培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法,極大地提高了臨床標(biāo)本的MTB檢出率。Xpert MTB/RIF是較為成熟的TB快速分子診斷技術(shù),在長期的實踐中已得到了臨床的廣泛認(rèn)可[7]。

本文結(jié)果顯示,不同標(biāo)本類型間檢測MTB的陽性率比較,二代CPA和Xpert MTB/RIF差異均顯示無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。全部標(biāo)本的統(tǒng)計學(xué)比較,二者檢測MTB的結(jié)果也有著極高的一致性(Kappa=0.83)。表明應(yīng)用二代CPA和Xpert MTB/RIF對胃吸液檢測MTB的靈敏性和特異性相似,與文獻[8]研究結(jié)果基本相符。

研究發(fā)現(xiàn)二代CPA和Xpert MTB/RIF對MTB含菌量較多的標(biāo)本(Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果為“MTB 低”及以上),二者檢測結(jié)果完全一致,差異主要表現(xiàn)在少數(shù)Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果為“MTB 極低”或“MTB 未檢出”的標(biāo)本,這可能與二者的最低檢出限值存在差異有關(guān)。一方面二者靶基因不同,二代CPA的靶基因是IS6110,屬多拷貝基因,而Xpert MTB/RIF的靶基因是rpoB,屬單拷貝基因。有文獻[9]報道,以單拷貝基因為檢測靶基因的方法比以多拷貝基因為檢測靶基因的方法敏感性低。本文結(jié)果顯示,二代CPA比Xpert MTB/RIF的陽性率略低(42.13% vs 43.38%),這或許與本研究的標(biāo)本量不夠大有關(guān)。另一方面二者自動化操作有差異,二代CPA多一步上機前標(biāo)本離心富集的手工過程,如果該步驟處理不當(dāng),可能反而會導(dǎo)致菌量的丟失,這或許是本研究二代CPA比Xpert MTB/RIF陽性率低的另一原因。熟練掌握二代CPA的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,將有益于提高二代CPA的檢測質(zhì)量。

二代CPA和Xpert MTB/RIF都具有操作簡便、高度自動化的優(yōu)勢,整個過程不到2 h,而二者檢測MTB的結(jié)果具有極高的一致性,因此,二代CPA同Xpert MTB/RIF一樣可推薦用于臨床對MTB的快速檢測。但Xpert MTB/RIF可以同時檢測利福平耐藥性則是它的另一大優(yōu)勢。就檢測成本而言,二代CPA明顯低于Xpert MTB/RIF,二代CPA更適合在經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)推廣應(yīng)用。