縮骨鯽Cyt b基因和控制區(qū)序列克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析

李強(qiáng) 鄭鵬 黃文煒 彭蘇漢 周江偉 詹華偉 藍(lán)昭軍 桂林

摘 要：研究通過(guò)Sanger測(cè)序法對(duì)天然雌核發(fā)育的縮骨鯽（Carassius auratus var. Suogu）線(xiàn)粒體DNA的Cyt b基因和控制區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，并與已發(fā)表的其他鯽屬魚(yú)類(lèi)的Cyt b基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，探討縮骨鯽與其他鯽屬魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明：縮骨鯽線(xiàn)粒體DNA中Cyt b基因和控制區(qū)全序列分別長(zhǎng)1 141和924 bp；其中，Cyt b基因的堿基含量為29.1%（T）、27.9%（C）、28.7%（A）和14.3%（G），控制區(qū)序列的堿基含量為32.6%（T）、20.7%（C）、32.6%（A） 和14.1%（G）；2種序列中G+C含量均明顯低于A+T含量，且G含量偏低，顯示了與其他脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體核苷酸堿基含量相似的特征；控制區(qū)序列可以分為終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)3個(gè)區(qū)域，均識(shí)別到了對(duì)應(yīng)的保守序列；基于鄰接法（NJ）和最大簡(jiǎn)約法（MP）構(gòu)建縮骨鯽與其他鯽屬魚(yú)類(lèi)Cyt b 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，縮骨鯽與紅鯽和淇河鯽的親緣關(guān)系最近，而縮骨鯽與野鯽、淇河鯽和紅鯽分布在同一個(gè)姐妹支系，進(jìn)一步說(shuō)明縮骨鯽可能起源于野鯽，是野鯽的一個(gè)地方種群。

關(guān)鍵詞：縮骨鯽；細(xì)胞色素b基因；控制區(qū)；系統(tǒng)進(jìn)化分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q953.3； S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2023）10-0007-04

Sequence Cloning and Phylogenetic Analysis of Cyt b Gene and Control Region in mtDNA of Carassius auratus var. Suogu

LI Qiang1， ZHENG Peng1， HUANG Wen-wei1， PENG Su-han1， ZHOU Jiang-wei1， ZHAN Hua-wei1， LAN Zhao-jun2， GUI Lin1

（1. College of Life Science， Guangzhou University， Guangzhou 510006， PRC; 2. Shaoguan Fishery Technology Promotion Station， Shaoguan Fisheries Research Institute， Shaoguan 512006， PRC）

Abstract：The complete sequences of Cyt b gene and control region in mtDNA of natural gynogenesis triploid C. auratus var. Suogu were determined through Sanger sequencing method after PCR amplification. The phylogenetic analysis was performed by sequence alignment of the Cyt b gene between C. auratus var. Suogu and the other Carassius fishes in GenBank to explore their phylogenetic relationship. Results showed that the total length of Cyt b gene was 1 141 bp and the control region was 924 bp. The base composition of Cyt b gene was 29.1% T， 27.9% C， 28.7% A and 14.3% G， and control region was 32.6% T， 20.7% C， 32.6% A and 14.1% G. In these two sequences， the contents of G+C （42.2%， 34.8%） were significantly lower than those of A+T （57.8%， 65.2%）， and the G base contents were low， which showed a similarity to those of other vertebrates. The sequence of control region was divided into three regions： termination sequence region， central conserved region and conserved sequence region， in which the corresponding conserved sequences were identified. The phylogenetic trees constructed by the neighbor-joining method （NJ） and maximum parsimony （MP） based on Cyt b gene in C. auratus var. Suogu and other Carassius fishes have revealed that C. auratus var. Suogu is closely related to C. auratus red var. and C. auratus var. Qihe. In addition， the C. auratus var. Suogu is distributed in the same sister branch with C. auratus auratus， C. auratus var. Qihe and C. auratus red var.， which has indicated that the C. auratus var. Suogu may be originated from C. auratus auratus and belongs to a local population of C. auratus auratus.

Key words：Carassius auratus var. Suogu; cytochrome b gene; control region; phylogenetic analysis

收稿日期：2023–05–08

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201804010486）；廣東省教育科學(xué)規(guī)劃課題（2021GXJK097）

作者簡(jiǎn)介：李 強(qiáng)（1983—），男，廣東韶關(guān)市人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事淡水魚(yú)類(lèi)生態(tài)與親緣地理研究。

通信作者：桂 林

縮骨鯽（Carassius auratus var. Suogu）是一種天然雌性核發(fā)育的三倍體鯽魚(yú)，屬鯉形目鯉科鯽屬，主要分布在廣東省韶關(guān)地區(qū)，為該地方特有的鯽魚(yú)品種[1]。與其他鯽魚(yú)形態(tài)特征相比，縮骨鯽的尾柄長(zhǎng)明顯小于尾柄高，體高明顯比其他鯽魚(yú)品種突出[2]，這一形態(tài)是漫長(zhǎng)的環(huán)境適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果，為可遺傳性狀。由于縮骨鯽體短而高的特點(diǎn)，其含肉比例較高，且口感鮮美，是產(chǎn)區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)，由于環(huán)境污染和過(guò)度捕撈等人為干涉，縮骨鯽的野生資源銳減，亟待加以保護(hù)和可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用。目前有關(guān)縮骨鯽的研究主要集中在生物學(xué)特性[1-2]、人工繁殖[3]、基因克隆[4-5]等方面，尚無(wú)縮骨鯽系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究報(bào)道。

線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)基因重組、進(jìn)化速度比核基因快等特點(diǎn)，是研究魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性的理想分子標(biāo)記[6]。其中，細(xì)胞色素b基因（Cyt b）是mtDNA中結(jié)構(gòu)和功能被研究得最為廣泛的基因之一，該基因進(jìn)化速度適中，較適合研究種內(nèi)和種間遺傳變異[7]；另外，控制區(qū)是mtDNA中主要的非編碼區(qū)，屬于進(jìn)化最快的片段，常作為分子標(biāo)記來(lái)探討各種魚(yú)類(lèi)的種群遺傳多樣性和種內(nèi)遺傳分化[8]。該研究通過(guò)對(duì)縮骨鯽線(xiàn)粒體的Cyt b基因和控制區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，與已發(fā)表的其他鯽屬魚(yú)類(lèi)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，探討縮骨鯽與其他鯽屬魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，旨在為縮骨鯽種質(zhì)資源保護(hù)、研究和利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用縮骨鯽來(lái)自廣東省韶關(guān)市水產(chǎn)研究所的試驗(yàn)基地。隨機(jī)選取5尾縮骨鯽活魚(yú)樣品，樣品形態(tài)見(jiàn)圖1。

1.2 DNA 提取和PCR擴(kuò)增

采用動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取縮骨鯽總DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：PCR Master Mix 12.5 μL、Primer1 1μL、Primer2 1μL、模板DNA 3 μL、滅菌雙蒸水7.5 μL。反應(yīng)在PTC100或PTC200型PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序： 95℃預(yù)變性3 min；95℃變性0.5 min，53℃退火0.5 min ，72℃延伸1.5 min ，循環(huán)35次；72℃ 延伸10 min。Cyt b基因克隆的引物為L(zhǎng)14724和H15915[9]，控制區(qū)序列克隆的引物為CR1和CR2[10]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。電泳檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化并雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)得的序列使用Sequence Analysis 5.2 軟件進(jìn)行拼接。通過(guò)MEGA 7.0 軟件分析各序列的結(jié)構(gòu)特征[11]。為了探討縮骨鯽在鯽屬魚(yú)類(lèi)中的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載鯽屬魚(yú)類(lèi)的Cyt b 基因和控制區(qū)全序列，包括野鯽（C. auratus auratus）、淇河鯽（C. auratus var. Qihe）、彭澤鯽（C. auratus var. Pengze）、滁州鯽（C. auratus var. Chuzhou）、方正銀鯽（C. auratus gibelio）、方正銀鯽A系（C. auratus gibelio clone A）、方正銀鯽D系（C. auratus gibelio clone D）、方正銀鯽E系（C. auratus gibelio clone E）、蘭氏鯽（C. auratus langsdorfi）、日本白鯽（C. cuvierius）、萍鄉(xiāng)肉紅鯽（C. auratus var. Pingxiangnensis）、紅鯽（C. auratus red var.）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio），Genbank中的序列登錄號(hào)依次為JN105355、KJ476998、KJ874429、KM659025、GU138989、JF496198、JF496197、KX611160、AB006953、AB045144、HQ875340、KJ874430和AP009047?；贑yt b 基因構(gòu)建鄰接法（NJ）和最大簡(jiǎn)約法（MP）的鯽屬魚(yú)類(lèi)的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)粒體DNA Cyt b基因和控制區(qū)序列分析

縮骨鯽線(xiàn)粒體Cyt b 基因和控制區(qū)序列經(jīng)軟件拼接后的長(zhǎng)度分別為1 141和923? bp。Cyt b 基因的起始密碼子是ATG，終止密碼子是T，共編碼380個(gè)氨基酸。Cyt b? 基因中T、C、A 和G 的含量分別為29.1%、27.9%、28.7%和14.3%，A+T含量（57.8%）明顯大于G+C含量（42.2%）；控制區(qū)序列的T、C、A和G含量分別為32.6%、20.7%、32.6%和14.1%，A+T含量（65.2%）明顯大于G+C含量（34.8%）?？s骨鯽線(xiàn)粒體Cyt b 基因和控制區(qū)序列中，G含量顯著低于其他3種堿基，且具有明顯的AT偏好性。

2.2 線(xiàn)粒體控制區(qū)序列結(jié)構(gòu)

縮骨鯽和其他硬骨魚(yú)類(lèi)的控制區(qū)相似，位于tRNAPro和tRNAPhe之間，全長(zhǎng)923 bp。通過(guò)與其他魚(yú)類(lèi)控制區(qū)及各個(gè)區(qū)域關(guān)鍵序列和保守序列的比對(duì)，縮骨鯽的控制區(qū)也可以劃分為3個(gè)部分：終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)。由圖2可知，終止序列區(qū)位于控制區(qū)的5'端，是控制區(qū)變異最大的區(qū)域，識(shí)別出1個(gè)終止相關(guān)序列（TAS），其堿基序列為T(mén)ACATATATGTA；中央保守區(qū)識(shí)別出了CSB-F（ATGTAGTAAGAGACCACC）、CSB-E（ATGATA GAATCAGGGACAT）和CSB-D（TTATACTGGCATCTGA TTAA）等關(guān)鍵序列；保守序列區(qū)識(shí)別出了CSB-1（ATATAAATGAATTATCGTAAGACATA）、CBS-2（CAAACCCCCCTACCCCC）和CBS-3（TGTCAAACCCC GAAACCA）等保守序列（圖2）。

2.3 基于鄰接法（NJ）和最大簡(jiǎn)約法（MP）的縮骨鯽系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

基于鄰接法（NJ）和最大簡(jiǎn)約法（MP）構(gòu)建縮骨鯽與其他鯽屬魚(yú)類(lèi)Cyt b 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以鯉魚(yú)作為外類(lèi)群，結(jié)果如圖3所示。2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，鯽屬魚(yú)類(lèi)聚成Ⅰ和Ⅱ 2支。來(lái)自中國(guó)的鯽屬魚(yú)類(lèi)組成了第Ⅰ支，而來(lái)自日本的蘭氏鯽和日本白鯽組成了第Ⅱ支，支系Ⅰ和Ⅱ之間的遺傳距離為6.7%，這說(shuō)明蘭氏鯽和日本白鯽與中國(guó)的鯽屬魚(yú)類(lèi)發(fā)生了明顯的遺傳分化。在Ⅰ支中，又可分為A和B個(gè)2姐妹群。A群包含了方正銀鯽系列、彭澤鯽、滁州鯽和萍鄉(xiāng)肉紅鯽；B群則包含野鯽、縮骨鯽、淇河鯽、紅鯽等物種，A群和B群之間的遺傳距離為1.8%，中國(guó)鯽屬魚(yú)類(lèi)的遺傳分化程度較小。從B支系可知，縮骨鯽與淇河鯽和紅鯽聚成一支，這說(shuō)明縮骨鯽與淇河鯽和紅鯽的親緣關(guān)系較近。

3 討 論

3.1 序列組成及控制區(qū)結(jié)構(gòu)

魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體DNA是研究魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的理想分子標(biāo)記[12]。目前，研究最多是Cyt b基因、COI基因、ATPase8/6基因和控制區(qū)序列。該研究首次獲得了縮骨鯽的線(xiàn)粒體Cyt b基因和控制區(qū)的全序列，它們的長(zhǎng)度分別為1 141和923 bp?？s骨鯽這2種序列的堿基A+T含量均高于G+C，G含量顯著低于其他3種堿基，這些都與脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA的特點(diǎn)相一致[13]。Cyt b基因以單獨(dú)的T堿基作為終止密碼子，在其他動(dòng)物類(lèi)群中也常見(jiàn)[14]。一般認(rèn)為不完全終止密碼子是由于蛋白質(zhì)編碼基因3'端與tRNA基因重疊所致[15]，不完全的終止密碼子將在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中由mRNA 3'端的 Poly（A）尾補(bǔ)全[16]?？刂茀^(qū)是脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組中主要的非編碼片段，是變異最大的區(qū)域[6]?？s骨鯽線(xiàn)粒體基因組控制區(qū)的長(zhǎng)度為923 bp，在終止序列區(qū)識(shí)別出1個(gè)終止相關(guān)序列（TAS），中央保守區(qū)識(shí)別出了CSB-F、CSB-E和CSB-D等關(guān)鍵序列，保守序列區(qū)識(shí)別出了CSB-1、CBS-2和CBS-3等保守序列，這與劉良國(guó)等[10]報(bào)道的其他鯽屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體控制區(qū)結(jié)構(gòu)相似。

3.2 縮骨鯽系統(tǒng)地位

我國(guó)的鯽屬魚(yú)類(lèi)包括鯽和黑鯽2種，前者又可以分為鯽指名亞種和銀鯽亞種，銀鯽亞種主要分布在黑龍江和額爾齊斯河河水系，而鯽幾乎遍布全國(guó)各主要水系[17]。鯽適應(yīng)性強(qiáng)、是遺傳背景復(fù)雜的類(lèi)群，在長(zhǎng)期的生態(tài)適應(yīng)過(guò)程中形成了諸如方正銀鯽、滇池高背鯽、江西彭澤鯽、河南淇河鯽、貴州普安鯽、安徽滁州鯽、廣東縮骨鯽等許多不同的鯽種群[18]。廣東縮骨鯽主要分布在廣東省韶關(guān)地區(qū)的翁源縣等地，謝楠等[19]將其歸為銀鯽的地方類(lèi)群。張輝等[20]用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)銀鯽、彭澤鯽、縮骨鯽和野鯽的mtDNA進(jìn)行單倍型分析認(rèn)為，縮骨鯽屬于野鯽的一個(gè)地方品系。而劉良國(guó)等[21]對(duì)廣東地區(qū)彭澤鯽、縮骨鯽和野鯽進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明彭澤鯽和縮骨鯽的親緣關(guān)系較近，推測(cè)它們可能共同起源于野鯽。

該研究使用NJ和MP 2種方法構(gòu)建的鯽屬魚(yú)類(lèi)Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，方正銀鯽系列、彭澤鯽、滁州鯽、和萍鄉(xiāng)肉紅鯽聚成一支；野鯽、縮骨鯽、淇河鯽和紅鯽聚成另一支，這2支相互形成姐妹群，具有很高的支持率，分別代表了銀鯽類(lèi)群和非銀鯽類(lèi)群。這一結(jié)果也表明，縮骨鯽與紅鯽、淇河鯽和野鯽的親緣關(guān)系較近，與方正銀鯽、滁州鯽、彭澤鯽的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，縮骨鯽可能起源野鯽，屬于野鯽的一個(gè)地方種群，而非銀鯽地方種群，這與張輝等[20]的研究結(jié)果相似。

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（責(zé)任編輯：成 平）