HPLC法同時測定少林正骨精中5種成分的含量 及近紅外定量模型的建立

王秋玲

(1.漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司,福建 漳州 363000;2.福建省片仔癀天然醫(yī)藥研發(fā) 企業(yè)重點實驗室,福建 漳州 363000)

少林正骨精收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第六冊,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為WS3-B-1108-92,是由仙桃草、當(dāng)歸、五加皮、獨活、羌活、醋三棱、醋莪術(shù)、土鱉蟲、艾葉、醋延胡索、花椒、血竭、乳香、伸筋草等20味藥物組成的中藥酊劑,具有活血祛瘀、消腫止痛、祛風(fēng)散寒的功效,用于跌打損傷、積瘀腫痛、腰肢麻木、風(fēng)濕骨痛。目前針對該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法較少,部頒標(biāo)準(zhǔn)對冰片鑒別項和乙醇含量做了規(guī)定,王健[1]對血竭素、華春紅[2]對蛇床子素的含量測定進行了研究,國家藥典委員會最新公示的擬修訂標(biāo)準(zhǔn)新增當(dāng)歸、羌活、獨活、血竭對照藥材鑒別項和樟腦、薄荷腦、冰片的含量測定項,暫未對該產(chǎn)品的藥材成分進行含量測定研究。方中獨活、羌活、當(dāng)歸具有活血止痛等功效,同時現(xiàn)代藥理學(xué)表明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛等藥效[3]。本實驗擬對少林正骨精中獨活、羌活、當(dāng)歸的主要活性成分含量進行考察。

獨活的主要化學(xué)成分為香豆素類、揮發(fā)油類等,香豆素類的蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯是其主要活性成分[4];羌活的主要化學(xué)成分為香豆素類、揮發(fā)油類和烯炔類化合物,香豆素類的羌活醇、異歐前胡素為主要活性成分,且具有專屬性[5];當(dāng)歸的主要化學(xué)成分為有機酸類、揮發(fā)油類等,其中阿魏酸最具代表性,為其主要活性成分[6,7]。本實驗擬建立HPLC法同時測定少林正骨精中阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量,為少林正骨精的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

中藥具有復(fù)雜的成分,混合均勻度直接影響產(chǎn)品質(zhì)量的一致性、安全性、有效性,在工藝穩(wěn)定性評估過程中,應(yīng)用色譜分析等方法時,操作繁瑣、耗時較長,無法及時得到結(jié)果反饋,因此本研究引入近紅外光譜法建立快速定量分析模型。近紅外譜區(qū)主要記錄C-H、O-H、N-H等基團,這些基團是有機物的重要組成元素,用于中藥檢測能得到豐富的信息,近紅外光譜技術(shù)具有分析速度快、分析效率高、樣品無需預(yù)處理等優(yōu)點,結(jié)合化學(xué)計量學(xué)充分提取光譜中的有效信息建立定量模型[8],可應(yīng)用于中藥生產(chǎn)過程的質(zhì)量評估[9,10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(安捷倫公司,美國,型號:1260系列 DAD檢測器),電子天平(梅特勒托利多科技(中國)有限公司,型號:XPR205/A),數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市江南實驗儀器廠),數(shù)控超聲波清洗器KQ-500DE(昆山市超聲儀器有限公司),MILLIPORE超純水機(默克公司,德國,Direct-Q5 UV Kit),布魯克MAP型傅里葉變換近紅外光譜儀(布魯克公司,德國,OPUS6.5光譜工作站)。

1.2 試藥

阿魏酸(批號:110773-201915,純度99.4%),羌活醇(批號:111820-202106,純度97.5%),蛇床子素(批號:110822-202111,純度99.7%),異歐前胡素(批號:110827-202113,純度99.2%),二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯(批號:111583-202006,純度98.9%),均購于中國食品藥品檢定研究院;少林正骨精(漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z35020235)。乙腈為色譜純(Merck),甲醇、二氯甲烷、磷酸為分析純(西隴科學(xué)股份有限公司),水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定5個成分的含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱采用中譜紅PX-C18(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈為流動相A,0.1%磷酸水溶液為流動相B,梯度洗脫,色譜條件,見表1。流速1.0mL/min,檢測波長320nm,柱溫30℃,進樣體積為5μL。

表1 色譜條件

2.1.2 對照品混合溶液制備 精密稱取對照品阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯適量,分別置于25mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,制成阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的單一對照品母液。

分別精密量取上述對照品母液2mL、2mL、5mL、2mL、2mL于同一個25mL棕色量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻,即得,濃度分別為阿魏酸36.48μg/mL、羌活醇37.32μg/mL、蛇床子素98.50μg/mL、異歐前胡素35.68μg/mL、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯36.36μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取少林正骨精樣品10mL,用二氯甲烷萃取3次,每次20mL,合并二氯甲烷液,蒸干,殘渣加甲醇使溶解,分次轉(zhuǎn)移至5mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,用0.45μm濾頭過濾,即得。陰性樣品溶液的制備:取按處方比例制備同時缺獨活、羌活、當(dāng)歸藥材的陰性樣品,按供試品溶液制備方法處理,即得。

2.1.4 專屬性試驗 分別吸取對照品混合溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各5μL,在“2.1.1”項色譜條件下進樣分析。記錄相應(yīng)的色譜,見圖1。陰性樣品在與對照混合溶液相應(yīng)的保留時間處,羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯未有峰干擾,阿魏酸處有小峰,根據(jù)后面的實驗結(jié)果表明對含量測定無影響,5個主成分峰的分離度符合要求。

2.1.5 線性關(guān)系及定量限考察 精密稱取阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品適量于同一個50mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,得到母液。分別精密量取1mL母液于100mL、50mL、25mL、10mL、5mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,得到系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為阿魏酸2.22μg/mL、4.44μg/mL、8.88μg/mL、22.21μg/mL、44.41μg/mL、222.06μg/mL,羌活醇2.32μg/mL、4.63μg/mL、9.27μg/mL、23.17μg/mL、46.33μg/mL、231.66μg/mL,蛇床子素5.92μg/mL、11.84μg/mL、23.68μg/mL、59.20μg/mL、118.40μg/mL、592.02μg/mL,異歐前胡素2.17μg/mL、4.35μg/mL、8.70μg/mL、21.74μg/mL、43.49μg/mL、217.45μg/mL,二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯2.73μg/mL、5.46μg/mL、10.93μg/mL、27.32μg/mL、54.63μg/mL、273.16μg/mL,注入液相色譜儀,測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行線性回歸,回歸方程、相關(guān)系數(shù)r值、線性范圍,見表2。表明各成分在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。以信噪比10∶1(S/n=10)作為定量限,測得定量限分別為阿魏酸1.11ng、羌活醇5.79ng、蛇床子素2.96ng、異歐前胡素5.44ng、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯6.83ng。

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液,于“2.1.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次,阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積的RSD分別為1.43%、1.86%、1.40%、1.14%、2.00%,表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取按“2.1.3”項供試品溶液制備好的同一份供試品溶液,分別在0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h時,于“2.1.1”項色譜條件下測定,阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積的RSD分別為1.42%、1.33%、1.69%、1.68%、1.87%,結(jié)果表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取同一份樣品溶液,按“2.1.3”項供試品溶液制備,平行提取6份供試品溶液,按“2.1.1”項色譜條件測定,測得阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量平均值分別為15.26μg/mL、12.07μg/mL、42.96μg/mL、9.74μg/mL、7.38μg/mL,RSD分別為1.54%、1.44%、1.84%、1.80%、1.98%,結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收試驗 取已知含量的同一批次樣品(樣品:9#)9份,每份精密吸取5mL,3份為一組,按供試品中待測成分與對照品加入量之比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例,加入適量對照品混合溶液,按“2.1.3”項下方法操作,制成供試品溶液,在“2.1.1”色譜條件下測定,計算回收率,結(jié)果表明本法具有較好的準(zhǔn)確度,見表3。

2.1.10 樣品的測定 取10個批次的少林正骨精,按“2.1.3”項下方法操作,于“2.1.1”項色譜條件下測定,計算阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量,測定結(jié)果見表4。

表4 少林正骨精中5個成分的含量結(jié)果 (n=10)

2.2 近紅外光譜模型建立及應(yīng)用

2.2.1 光譜數(shù)據(jù)采集 吸取適量的樣品溶液于掃描玻璃管中,置于樣品臺上,設(shè)置光譜采集參數(shù):采集方式透射式Near-IR Transmittance(NIT),掃描波長為全波長(12 500～4 000cm-1),掃描次數(shù)為32Scans,分辨率為8cm-1,每份樣品掃描3次,采集24個批次的樣品溶液,近紅外光譜見圖2。

圖2 少林正骨精近紅外光譜

2.2.2 建立定量模型 樣品中復(fù)雜的有機物質(zhì)在近紅外譜區(qū)多個波段都有信息,屬于復(fù)雜光譜,通過OPUS6.5光譜工作站對光譜進行預(yù)處理,按照上述“2.1”項的含量測定方法對24個批次樣品進行含量測定,得到5個主要成分的含量測定結(jié)果,選取其中21個批次作為參考集,剔除>2.5的吸收單位,選擇波長12 500～7 100cm-1和6 500～5 300cm-1建模,運用偏最小二乘法(PLS)進行擬合建立阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的定量分析模型,定量模型見圖3。本研究運用矢量歸一化(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)+MSC、一階導(dǎo)數(shù)+SNV、多元散射校正、無光譜預(yù)處理等11種經(jīng)典預(yù)處理方法進行優(yōu)化,以均方根誤差(RMSECV)為評價指標(biāo),優(yōu)選出合適的預(yù)處理方法,并進行交叉驗證,另取3個批次樣品作為測試集,進行外部驗證,得到預(yù)測值與化學(xué)測定值的RSD。優(yōu)化后各個成分的較優(yōu)的光譜預(yù)處理方法、RMSECV、波段范圍、相關(guān)系數(shù)r值、預(yù)測均方根誤差(RMSEP)、外部驗證預(yù)測值與化學(xué)測定值的RSD范圍見表5。

圖3 阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、異歐前胡

表5 近紅外模型參數(shù)

2.2.3 模型的運用 本模型可用于少林正骨精灌裝前配制液的快速檢測。對少林正骨精灌裝前的配制液進行多點取樣,根據(jù)“2.2.1”光譜數(shù)據(jù)采集方法采集少林正骨精配制液的近紅外光譜圖,運用“2.2.2”建立的近紅外定量分析模型對配制液的5個成分進行含量結(jié)果預(yù)測,得到各個配制液取樣點的5個成分的含量結(jié)果,并計算不同取樣點同一個成分含量結(jié)果的RSD值,根據(jù)“2.2.2”項下表5近紅外模型參數(shù)中的RSD范圍設(shè)定RSD值<13.10%時,該數(shù)值可以一定程度上反映配制液是否混合均勻,從而反映產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 含量測定

3.1.1 提取方法考察 分析少林正骨精的提取工藝,水提醇沉與醇提液混合,乙醇含量為51%～59%,乙醇水溶液極性較大溶解成分多,直接進樣雜峰較多,影響分離效果,水溶性成分不易溶于中極性有機溶劑,香豆素類和有機酸均可溶于中極性有機試劑[11],試驗分別考察了乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷提取率、提取次數(shù)、提取溶劑加入量對結(jié)果的影響,結(jié)果表明三氯甲烷和二氯甲烷,分3次提取,每次20mL可提取完全,考慮到三氯甲烷為易制毒試劑,最終選定二氯甲烷為提取溶劑,分3次提取,每次20mL。

3.1.2 檢測波長及色譜條件的考察 通過DAD在190～400nm范圍內(nèi)對5個主成分峰和樣品溶液進行光譜掃描,發(fā)現(xiàn)阿魏酸在322nm、羌活醇在310nm、蛇床子素在322nm、異歐前胡素在310nm、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯在326nm有最大吸收,根據(jù)樣品中各個成分的吸收值大小,最終選定320 nm為檢測波長。流動相分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%冰醋酸水溶液體系,柱溫分別考察了25℃、30℃、35℃,流速考察了0.8mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min。結(jié)合5個主峰的峰形、分離度和柱效,最終選定乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫,柱溫30℃,流速1.0mL/min。色譜柱考察了中普紅PX-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Thermo BDS Hypersil C18(4.6mm×250mm,5μm),在上述的色譜條件下三者均能達到較好的分離效果[12-15]。

3.1.3 專屬性及回收率結(jié)果 由陰性樣品色譜圖可知,香豆素類成分具有良好的專屬性,在陰性樣品色譜圖中阿魏酸的保留時間相對應(yīng)的位置出現(xiàn)小峰,推測因為本方中艾葉含有微量的阿魏酸[16],但該色譜峰的信噪比僅為7.2低于定量限,結(jié)合阿魏酸的加樣回收試驗結(jié)果,可判斷不影響本方法阿魏酸含量測定的專屬性。

3.2 近紅外定量分析模型

羌活醇、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的真值與預(yù)測值RSD較大,一是因為近紅外的吸收強度比中紅外弱1～5個數(shù)量級,隨著基頻振動合頻和倍頻的增加,吸收峰重疊越嚴(yán)重,吸收越來越弱,近紅外光譜技術(shù)適合含量>0.1%的常量分析[17];二是建模的批次較少,在后續(xù)的生產(chǎn)過程中會繼續(xù)增加參考集的批次,進一步修正模型。該定量分析模型用于含量預(yù)測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性稍顯不足,可用于半定量判斷少林正骨精配制液的均一性,用于少林正骨精生產(chǎn)過程中的在線監(jiān)測。

本研究首次建立了一種高效液相色譜法同時測定少林正骨精中5種有效成分含量的方法,該方法簡單有效,符合方法學(xué)驗證,可用于少林正骨精質(zhì)量控制;并應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)建立了少林正骨精定量模型,作為生產(chǎn)過程在線監(jiān)測體系中的一環(huán),用于在產(chǎn)品灌裝前判斷配制液的均勻性,保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。