基于AHP-CRITIC混合加權(quán)法結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)選 參芪益氣方提取工藝研究

朱芝慧,龔芬芳,李 慧,4,黃璐琦,5*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 院士工作站,江西 南昌 330004;2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè) 研究所,江西 南昌 330115;3.江西中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)研究院,江西 南昌 330115; 4.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所,北京 100700;5.中國中醫(yī)科學(xué)院,北京 100700)

隨著社會(huì)的迅速發(fā)展,高強(qiáng)度快節(jié)奏的工作模式使亞健康人群日益增加[1]。根據(jù)WTO的一項(xiàng)全球性調(diào)查研究顯示,如今全世界處于亞健康狀態(tài)的群體高達(dá)75%[2]?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)表明,在亞健康初期通過適當(dāng)干預(yù),可以有效阻止其向疾病方向轉(zhuǎn)變,這與中醫(yī)“治未病”思想相吻合[3]。且現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)“補(bǔ)氣”可以改善亞健康人群倦怠乏力、精神萎靡等免疫力低下狀態(tài)[4]。參芪益氣方為臨床經(jīng)驗(yàn)方,由人參、黃芪、陳皮等6味藥材組成,主要用于提高人體免疫力、改善人體亞健康狀態(tài)。方中人參性偏寒而走里,可大補(bǔ)“元?dú)狻?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺,為君藥;黃芪性偏溫而走外,可補(bǔ)“衛(wèi)氣”、生津養(yǎng)血、健脾升陽,為臣藥。君臣兩藥相須協(xié)同,陰陽共補(bǔ),表里結(jié)合,大補(bǔ)人體之氣[5-6]。同時(shí)方中佐以陳皮理氣燥濕,疏通經(jīng)絡(luò),暢通氣血,輔助補(bǔ)氣藥更好達(dá)到療效。諸藥合用,補(bǔ)氣理氣,陰陽互助,共奏扶正固本、益氣健脾、理氣燥濕之功。因此該方的開發(fā)有助于服務(wù)亞健康人群,推動(dòng)“大健康”發(fā)展。

本研究以人參皂苷Rg1、Re、Rb1及黃芪甲苷和干膏得率作為提取工藝的評價(jià)指標(biāo),并建立了一種準(zhǔn)確便捷、可同時(shí)測定多指標(biāo)成分的檢測方法,用于優(yōu)選參芪益氣方提取工藝。此外,本研究在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上,引入更加科學(xué)合理的AHP-CRITIC混合加權(quán)法分配權(quán)重系數(shù),優(yōu)選參芪益氣方最佳提取工藝,為后期參芪益氣方的制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司);Allchrom Model 6100蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰公司);XBridge Shield RP18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);ME204(萬分之一)、XSR105(十萬分之一)型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);98-I-BN型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1(批號:110703-202034,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.0%)、人參皂苷Re(批號:110754-202129,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.0%)、人參皂苷Rb1(批號:110704-202129,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.3%)、黃芪甲苷(批號:110781-202118,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純(美國 Fisher 公司),甲醇為分析純(西隴科學(xué)股份有限公司);處方藥材均購自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片公司,按照 2020 版《中華人民共和國藥典》(一部)項(xiàng)下的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果均符合規(guī)定[7]。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷對照品適量,加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.301 4、0.186 8、0.283 2、0.550 6mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 樣品濃縮液制備 按處方稱取藥材,置圓底燒瓶中,加8倍量水,提取1次,每次1h,進(jìn)行回流提取,趁熱以200目無紡布濾過,濾液減壓濃縮至一定密度,得樣品濃縮液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取濃縮液10mL,加水飽和正丁醇溶液50mL萃取,共4次;合并正丁醇液,加氨試液50mL,洗滌3次,棄氨試液層,取正丁醇層蒸干,殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.1.4 陰性對照溶液制備 分別稱取參芪益氣方除人參、黃芪以外的其他處方量藥材,按“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理上述樣品,即得缺人參和缺黃芪的陰性對照溶液。

2.1.5 色譜條件 XBridge Shield RP18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相:乙腈-水,梯度洗脫程序見表1,柱溫:30℃,流速:1mL·min-1,ELSD檢測器,漂移管溫度:106.5℃,以氮?dú)鉃檩d氣,氮?dú)饬魉?.9L·min-1,進(jìn)樣量2～10μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性考察 分別取混合對照品溶液、陰性對照溶液及參芪益氣方供試品溶液各10μL,按“2.1.5”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,對系統(tǒng)適用參數(shù)進(jìn)行考察。人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,理論板數(shù)以各峰計(jì)均在5 000以上,參芪益氣方中其他組分不干擾4種成分的測定,表明該方法專屬性良好。結(jié)果見圖1。

注:1.人參皂苷Rg1;2.人參皂苷Re;3.人參皂苷Rb1;4.黃芪甲苷。A.混合對照品B.缺人參陰性對照;C.缺黃芪陰性對照;D.參芪益氣方供試品。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷的混合對照品母液,用甲醇依次倍半稀釋成系列混合對照品溶液,得到系列質(zhì)量濃度,按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定,以對照品進(jìn)樣量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X),峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y),計(jì)算各成分的回歸方程,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷分別在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液,按照“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算各成分峰面積的RSD值,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷峰面積的RSD值分別為1.27%、1.67%、2.13%、1.60%,表明儀器精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、8、12、24h依次進(jìn)樣測定,計(jì)算各成分峰面積的RSD值,結(jié)果見表4。結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷峰面積的RSD值分別為1.49%、2.84%、2.62%、2.02%,表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,按“2.1.5”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算各成分濃縮液平均含量和RSD值,結(jié)果見表5。結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷的含量的RSD值分別為1.07%、1.29%、1.62%、0.86%,表明該方法重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知含量的濃縮液5mL,平行6份,精密加入含人參皂苷Rg、Re、Rb1和黃芪甲苷對照品溶液適量,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算各成分平均加樣回收率和RSD值,結(jié)果見表6。結(jié)果顯示,人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷的平均加樣回收率分別為97.54%、99.12%、102.97%、100.00%,RSD為1.89%、2.26%、1.17%、2.84%,表明該方法各成分的回收率良好。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.7 干膏得率測定 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下濃縮液10mL,置已恒重的蒸發(fā)皿中,105℃干燥至恒重,取出,干燥器中冷卻至室溫,精密稱定質(zhì)量,按 2020 年版《中華人民共和國藥典》(四部)通則 0831 干燥失重測定法測定,計(jì)算干膏得率。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選提取工藝

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為影響因素。按比例稱取處方量藥材,以加水量(A)、提取時(shí)間(B)和提取次數(shù)(C)為考察因素,以各成分轉(zhuǎn)移率和干膏得率為評價(jià)指標(biāo),采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),篩選參芪益氣方最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素水平見表7。

表7 正交試驗(yàn)因素水平

2.3.2 指標(biāo)權(quán)重的確立 (1)AHP 法確定權(quán)重系數(shù)[8]。參芪益氣方中人參為君藥,黃芪為臣藥,根據(jù)君臣佐使配伍規(guī)律和藥理作用,結(jié)合參芪益氣方功效主治及組方特點(diǎn),將各指標(biāo)性成分和干膏得率作為權(quán)重指標(biāo)予以量化,即將5個(gè)指標(biāo)分成3個(gè)層次,并確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)槿藚⒃碥誖g1、Re、Rb1優(yōu)于黃芪甲苷優(yōu)于干膏得率,構(gòu)建各指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣,并得到各成分的評分,結(jié)果見表8。結(jié)果顯示,人參皂苷Rg1、Re、Rb1、黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率和干膏得率項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)(ω)分別為0.291 9、0.291 9、0.291 9、0.097 3、0.026 9。一致性比例因子(CR)可以評價(jià)權(quán)重系數(shù)是否合理,通過檢驗(yàn),本試驗(yàn)CR=0.080 2<0.10,說明指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣合理,所得的權(quán)重系數(shù)可用于參芪益氣方提取工藝的綜合評分。

表8 指標(biāo)成對判斷優(yōu)先矩陣

(2)CRITIC 法確定權(quán)重系數(shù)[9]。CRITIC是一種以評價(jià)指標(biāo)間的對比強(qiáng)度及沖突性作為基礎(chǔ),通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差來體現(xiàn)對比強(qiáng)度及沖突性的客觀權(quán)重賦值方法。將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性差值歸一化,消除單位量綱,公式為[指標(biāo)成分值=(實(shí)測值-最小值)/(最大值-最小值)]×100,采用 SPSSAU 在線系統(tǒng)計(jì)算各指標(biāo)的指標(biāo)變異性、指標(biāo)沖突性、信息量以及權(quán)重,結(jié)果見表9。結(jié)果顯示,人參皂苷Rg1、Re,Rb1、黃芪甲苷和干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.172 6、0.204 3、0.143 4、0.211 3、0.268 3。

表9 CRITIC 法相關(guān)計(jì)算數(shù)據(jù)

2.3.3 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法確定權(quán)重 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法既保留了 AHP 法的主觀特點(diǎn),又具有 CRITIC 法的客觀性,較單一的賦權(quán)方法來說更加全面合理。將2種方法結(jié)合,計(jì)算綜合權(quán)重(ωij)=ωAHP-ijωCRITIC-ij/∑ωAHP-ijωCRITIC-ij,得到人參皂苷Rg1、Re、Rb1、黃芪甲苷和干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.280 4、0.331 9、0.233 0、0.114 4、0.040 2。

2.3.4 綜合評分及結(jié)果分析 綜合評分=[(人參皂苷Rg1轉(zhuǎn)移率/人參皂苷Rg1轉(zhuǎn)移率最大量)×0.280 4+(人參皂苷Re轉(zhuǎn)移率/人參皂苷Re轉(zhuǎn)移率最大量)×0.331 9 +(人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率/人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率最大量)×0.233 0 +(黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率/黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率最大量)×0.114 4 +(干膏得率/干膏得率最大量)×0.040 2]×100。

正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果見表10,方差分析結(jié)果見表11。從表10中綜合評分的直觀分析結(jié)果可以看出,各因素對水提工藝影響的主次為:C>A>B;因素A中K3>K2>K1,提示綜合評分隨加水倍數(shù)的增加而增高,選擇溶劑倍量為10倍;因素B中K1>K2>K3,選擇提取時(shí)間為1h;因素C中K2>K3>K1,選擇提取次數(shù)為2次,因此直觀分析優(yōu)選的組合為A3B1C2。表11的方差分析結(jié)果表明,提取次數(shù)(C)對指標(biāo)成分有顯著性影響,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綜上所示,參芪益氣方的水提工藝以A3B1C2組合為佳,即加10倍量水,提取2次,每次1h。

表10 正交試驗(yàn)安排及直觀分析結(jié)果

表11 指標(biāo)成分綜合評分方差分析結(jié)果

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方稱取藥材,平行3份,按最佳水提工藝進(jìn)行提取,同法計(jì)算各指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率、干膏得率和綜合評分,驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表12。結(jié)果顯示3批驗(yàn)證試驗(yàn)的平均總評分為95.37,RSD為1.23%,表明本試驗(yàn)所優(yōu)選的工藝穩(wěn)定,重復(fù)性好,可作為參芪益氣方的提取工藝。

表12 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

3 討論

參芪益氣方中人參為君藥,黃芪為臣藥,人參皂苷Rg1、Re、Rb1及黃芪甲苷作為人參和黃芪主要活性成分,具有提高免疫力、抗腫瘤、抗腦缺血再灌注損傷等作用[10-11],但分別檢測兩種皂苷類成分耗時(shí)耗力[12-13],故本研究建立了一種可同時(shí)測定上述4種活性成分的含量測定方法,大大縮短了分析時(shí)間,節(jié)省資源,提高檢測效率。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,所建方法準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,并通過提取工藝的正交試驗(yàn)證明了該方法的可行性和適用性,同時(shí)也為主要以皂苷結(jié)構(gòu)類型為活性成分的制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究思路。

中藥具有多成分、多療效的特點(diǎn),在提取過程中各有效成分的轉(zhuǎn)移率會(huì)影響到方劑的療效。因此在工藝優(yōu)選過程中,以單一成分含量高低為評價(jià)指標(biāo)存在一定局限性。干膏得率也是反映提取工藝的關(guān)鍵指標(biāo),是制劑成型的重要保證[14]。故本研究選取4種成分的轉(zhuǎn)移率和干膏得率形成多指標(biāo)評價(jià)體系,可更全面地反映提取工藝的優(yōu)劣,體現(xiàn)復(fù)方的整體性和有效性。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜,不同成分在提取過程中存在相互作用,使得各成分對復(fù)方整體效果的貢獻(xiàn)也不同[15],因此對指標(biāo)的賦權(quán)是中藥提取工藝中多指標(biāo)評價(jià)的重要環(huán)節(jié)。目前常用的方法有綜合評分法、歸一化法、AHP 法、CRITIC 法等[16]。AHP 法雖然體現(xiàn)出了復(fù)方中君臣佐使配伍的規(guī)律特點(diǎn),但也易受主觀判斷而失去客觀性;CRITIC 法可以客觀地評價(jià)權(quán)重系數(shù),卻也存在完全依賴本身屬性忽視各指標(biāo)間輕重關(guān)系的缺點(diǎn)。基于此,本實(shí)驗(yàn)將兩者方法相結(jié)合,使用 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法賦予指標(biāo)權(quán)重[17],使其既可以避免 AHP 法的主觀臆斷,又能減少 CRITIC 法對指標(biāo)間重要性的忽視,進(jìn)一步保證評價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,使評價(jià)結(jié)果更為科學(xué)合理。

本研究使用 HPLC-ELSD 法對人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷進(jìn)行測定,并通過L9(34)正交試驗(yàn),采用 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法對權(quán)重系數(shù)進(jìn)行綜合評分,優(yōu)選出參芪益氣方的水提工藝為加10倍量水,提取2次,每次1 h。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,該方法穩(wěn)定可靠,可以為參芪益氣方的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。