先天性巨結(jié)腸細(xì)胞治療研究進(jìn)展

何雨晨 蔡多特 張書(shū)豪 金 益 高志剛 邵 敏

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung disease，HD）是一種腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙導(dǎo)致的先天性結(jié)構(gòu)畸形，是造成新生兒和嬰幼兒腸梗阻的主要原因，在全球新生兒的發(fā)病率約為1/5 000～1/3 500，亞洲人群發(fā)病率最高［1］。HD 是胚胎發(fā)育階段遠(yuǎn)端腸道缺少神經(jīng)細(xì)胞定植導(dǎo)致［2］，依據(jù)無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段的長(zhǎng)度可分為短段型、長(zhǎng)段型和全結(jié)腸型［3］。目前，公認(rèn)的HD 治療方式仍是外科手術(shù)，通過(guò)外科手術(shù)可將無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸段切除，并將正常腸段與肛管吻合。常用的根治手術(shù)術(shù)式有Swenson、Duhamel、Soave 和Rehbein 等［4］。近十年來(lái)，隨著微創(chuàng)技術(shù)的推廣，傳統(tǒng)根治手術(shù)得到了改良，腹腔鏡輔助技術(shù)使HD 根治術(shù)的解剖精度有了極大的飛躍，術(shù)后頑固性便秘和小腸結(jié)腸炎等并發(fā)癥發(fā)生率在一定程度上改善，但仍不能徹底消除，而且大便失禁、泌尿系統(tǒng)損傷等手術(shù)導(dǎo)致的副損傷仍時(shí)有發(fā)生，一旦發(fā)生則嚴(yán)重影響HD 患者的術(shù)后生活質(zhì)量［5］。非手術(shù)方式治療HD 是一種減少手術(shù)創(chuàng)傷、避免手術(shù)副損傷的前沿醫(yī)學(xué)研究，也是臨床醫(yī)師追尋期許的治療新策略，細(xì)胞治療就是其中一種，其潛在優(yōu)勢(shì)在于不僅可以有效規(guī)避外科手術(shù)相關(guān)的不良預(yù)后，還能最大程度地重建腸道神經(jīng)結(jié)構(gòu)以及恢復(fù)腸道功能，現(xiàn)已成為HD新治療策略的研究熱點(diǎn)［6］。本文擬從細(xì)胞來(lái)源、問(wèn)題與挑戰(zhàn)、總結(jié)與展望3 方面對(duì)HD 細(xì)胞治療的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞來(lái)源

再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展為HD 的治療帶來(lái)了一種基于細(xì)胞層面的新策略，目前可用于HD 治療的細(xì)胞類(lèi)型有多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSC）、腸神經(jīng)嵴來(lái)源細(xì)胞（entericneural crest-derived cells，ENCDC）等。除此之外，Pan 等［7］發(fā)現(xiàn)來(lái)源于HD 患者無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段表達(dá)PLP1 的施旺細(xì)胞擁有分化潛力，可以將其分化出的神經(jīng)嵴細(xì)胞（enteric neural crest cells，ENCC）移植回HD 患者的腸段用于治療。

1.1 PSC PSC 可分為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）和人胚胎干細(xì)胞（human pluripotent stem cells，hPSC），PSC 的增殖能力使其在細(xì)胞療法中潛力巨大。相較于其他細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞治療方法，PSC 的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)在于可以通過(guò)基因編輯（例如Crisper/Cas9 基因編輯技術(shù)）的方式糾正HD 相關(guān)的基因突變［8］，也為從基因水平研究HD 的發(fā)病機(jī)制提供了便利。早在2007 年，Takahashi 等［9］通過(guò)4 種逆轉(zhuǎn)錄因子——Oct3/4、Sox2、Klf4 以及c-Myc 將成人的體細(xì)胞重新編碼為多能干細(xì)胞，且與hPSC 有著相似的形態(tài)、基因表達(dá)、端粒酶活性等?？茖W(xué)家為了減少HD 患者移植后機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，嘗試?yán)胔PSC 對(duì)患者病變腸管進(jìn)行細(xì)胞治療，F(xiàn)attahi 等［10］通過(guò)抑制hPSC 的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，將其分化為ENCC 并移植到HD 小鼠（Ednrbs-l/s-l），成功降低了小鼠HD 相關(guān)死亡率。Frith等［11］則在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)維A 酸可以更快速地通過(guò)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）水平，高效地在體外誘導(dǎo)出ENCC，并可在腸道內(nèi)定植，優(yōu)化了PSC 細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞治療策略。雖然PSC 分化成ENCC 的速度得到了顯著提升，但是PSC 分化方向的不確定性導(dǎo)致其誘導(dǎo)產(chǎn)生有效ENCC 的數(shù)量不足，這始終是困擾科學(xué)家們的一大難題。Lau 等［12］建立了一種新型的實(shí)驗(yàn)算法，可以為hPSC 分化成ENCC 提供指導(dǎo)，其發(fā)現(xiàn)Hedgehog 信號(hào)通路可以追蹤未成熟的ENCC 過(guò)渡到成熟ENCC 以及從ENCC 發(fā)育成腸神經(jīng)元的過(guò)程，在利用hPSC 對(duì)HD 患者進(jìn)行細(xì)胞治療時(shí)，可以利用這一算法指導(dǎo)ENCC 譜系以最大產(chǎn)量向著最適配的功能分化。而在全結(jié)腸型危重HD 的細(xì)胞治療中，F(xiàn)an 等［13］通過(guò)在HD 小鼠（Ednrb KO/NSG，腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏從結(jié)腸延伸到小腸）盲腸內(nèi)注射hPSC 來(lái)源的迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞（vagal neural crest cells，VNC）和骶骨神經(jīng)嵴細(xì)胞（sacral neural crest cells，SNC）的等比例混合液，顯著延長(zhǎng)了與單一注射VNC 或SNC 相比小鼠的存活時(shí)間，為全結(jié)腸型危重HD 患者的細(xì)胞治療方法增添了新思路。

1.2 ENCDC 在腸道神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，ENCDC 在腸管中受到遺傳和環(huán)境因素影響，被多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)（如一部分ENCDC 會(huì)表達(dá)結(jié)腸癌缺失基因（deleted in colorectal cancer，DCC）受體，其介導(dǎo)的軸突導(dǎo)向因子信號(hào)通路是ENCDC 在腸道進(jìn)行放射狀遷移到黏膜下肌層所必需的），從而沿著整個(gè)腸道進(jìn)行增殖、分化并遷移，最終形成腸道神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［14］。近幾年，已經(jīng)有研究證實(shí)人類(lèi)機(jī)體來(lái)源的ENCDC 移植入小鼠無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸段，受腸段的微環(huán)境影響，移植的ENCDC 會(huì)向無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病變腸段遷移，改善HD小鼠的腸道癥狀，甚至能達(dá)到治愈的效果［15-17］。但是由于HD 腸道炎癥和腸道菌群紊亂等原因，ENCDC 短期定植到HD 腸段會(huì)發(fā)生大規(guī)模的凋亡。Tian 等［18］研究發(fā)現(xiàn)借助糞便微生物可以增加短鏈脂肪酸通過(guò)MEK1/2 信號(hào)改善ENCDC 定植存活率低的問(wèn)題。除此之外，也有科學(xué)家［19-20］提出調(diào)節(jié)HD 腸段內(nèi)細(xì)胞生態(tài)位分子水平及細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用，對(duì)維持ENCDC 移植發(fā)育的良好微環(huán)境，提高ENCDC 定植成功率有重大意義。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)于ENCDC 的最佳來(lái)源也展開(kāi)了各種研究。Cheng 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，黏膜下和肌間神經(jīng)叢的ENCDC 擁有相似的分化潛能，Wilkinson 等［22］研究團(tuán)隊(duì)從HD 無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸段中分離出可以用來(lái)細(xì)胞治療的ENCDC，且與正常腸段中分離出的ENCDC 一樣具有分化和遷移能力。

目前，在模式動(dòng)物中植入ENCDC 的相關(guān)研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，已經(jīng)有報(bào)道［23］用野生型小鼠作為移植供體，成功地將表達(dá)ChR2 的神經(jīng)元移植到HD 小鼠的無(wú)神經(jīng)節(jié)區(qū)。顯微注射技術(shù)是將分化完成的細(xì)胞移植到HD 模式動(dòng)物腸管的主要方法，而內(nèi)窺鏡下的顯微注射技術(shù)會(huì)給受體提供一個(gè)更安全、有效的細(xì)胞移植方式。Cheng 等［24］發(fā)現(xiàn)在內(nèi)窺鏡下進(jìn)行顯微注射比直接進(jìn)行開(kāi)放性手術(shù)更節(jié)約時(shí)間，且被移植小鼠未出現(xiàn)并發(fā)癥。Cooper 等［15］則提出移植前的細(xì)胞準(zhǔn)備程序是影響移植成功與否的重要一環(huán)，主要包括了檢驗(yàn)移植細(xì)胞是否具有正常功能、是否能夠安全移植等流程。針對(duì)移植ENCDC 的效率，Zhao 等［25］團(tuán)隊(duì)通過(guò)Y-27632 抑制ROCK 信號(hào)通路顯著加速了ENCDC 在體內(nèi)外的生長(zhǎng)和遷移。

1.3 施旺細(xì)胞 有研究表明，除了VNC 和SNC，施旺細(xì)胞前體也參與了腸道神經(jīng)系統(tǒng)的形成，而膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell derived neurotrophie factor，GDNF）和內(nèi)皮素3（endothelin 3，EDN3）則是起到了趨化引導(dǎo)腸道神經(jīng)細(xì)胞在腸道內(nèi)遷移定植的作用［26］。在腸道神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程被更多地研究背景下，Soret等［27］發(fā)現(xiàn)對(duì)HD 小鼠（HolTg/Tg、Ednrbs-l/s-l 以及雌性TashTTg/Tg）進(jìn)行GDNF 灌腸，可以導(dǎo)致全結(jié)腸的內(nèi)源性GDNF 和Ret 因子表達(dá)水平升高，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的形成，全面改善結(jié)腸結(jié)構(gòu)和功能。雖然對(duì)GDNF 誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制了解尚不清楚，但是該研究發(fā)現(xiàn)有1/3 的新生神經(jīng)元細(xì)胞來(lái)自外源性Dhh-Cre+施旺細(xì)胞。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)以C57BL/6N 為遺傳背景的HD 小鼠（HolTg/Tg）與以FVB/N 為遺傳背景的HolTg/Tg小鼠相比，在進(jìn)行GDNF 灌腸后會(huì)產(chǎn)生更為密集的腸道神經(jīng)元細(xì)胞［28］。Pan 等［7］則利用細(xì)胞培養(yǎng)、活體細(xì)胞成像等研究成功完成了對(duì)在HD 患者無(wú)神經(jīng)節(jié)腸段中定植表達(dá)PLP1 的施旺細(xì)胞的分離、擴(kuò)增，再度證明了用施旺細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生腸神經(jīng)元細(xì)胞的可能性，為細(xì)胞治療的細(xì)胞來(lái)源增添了新的選擇。

2 問(wèn)題與挑戰(zhàn)

2.1 治療效果 近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，HD 患者不僅存在遠(yuǎn)端腸道神經(jīng)缺失的現(xiàn)象［29-30］，還有Cajal 間質(zhì)細(xì)胞的缺乏、內(nèi)在B 淋巴細(xì)胞缺陷［31］、腸道菌群紊亂［32］等其他腸道改變。而目前HD 患者的細(xì)胞治療策略主要針對(duì)的是遠(yuǎn)端腸道無(wú)神經(jīng)定植的問(wèn)題，細(xì)胞治療能否同時(shí)矯治腸道神經(jīng)缺乏之外的病變具有不確定性，因此細(xì)胞治療是否能完全恢復(fù)HD 患者的腸道功能便成了亟待回答的問(wèn)題。雖然Bhave 等［33］通過(guò)移植ENCC 到HD 小鼠缺乏腸道神經(jīng)的腸段可以顯著增加HD 小鼠的Cajal 間質(zhì)細(xì)胞，解決HD 病變腸道Cajal 間質(zhì)細(xì)胞缺乏的問(wèn)題。但是Cajal 間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加能否對(duì)HD 腸道蠕動(dòng)功能的恢復(fù)提供幫助，相關(guān)研究仍然較少。同樣，細(xì)胞治療對(duì)HD 患者的免疫功能、腸道平滑肌功能等的影響作用也是不確定的。此外，細(xì)胞治療過(guò)程中是否可以產(chǎn)生足夠的腸道來(lái)源細(xì)胞，移植后是否可以發(fā)生有效的細(xì)胞遷移，使移植后的腸道神經(jīng)細(xì)胞穩(wěn)定定植在HD 病變腸段等問(wèn)題，目前都有待進(jìn)一步探索。

2.2 安全性評(píng)估 細(xì)胞癌變主要發(fā)生在利用PSC 分化ENCC 的過(guò)程中，由于是通過(guò)人工技術(shù)化生或維持PSC 的，這些細(xì)胞的生存條件很大程度地偏離了生物體內(nèi)自然環(huán)境，更容易發(fā)生染色體畸變、拷貝數(shù)變異或單核苷酸變異等突變，這成為其惡變傾向的主要因素［6，34］。因此，研究者想要從臨床試驗(yàn)中得到細(xì)胞治療是否會(huì)癌變的安全性評(píng)價(jià)，長(zhǎng)時(shí)間的隨訪必不可少［6］。這種突變可在分化之前和分化之后發(fā)生，而分化之后發(fā)生的遺傳物質(zhì)改變更容易被忽略［35］。除此之外，細(xì)胞療法的致癌性還可能與介導(dǎo)重新編碼的因子持續(xù)在PSC 中保持活性有關(guān)，這進(jìn)一步提高了基因突變的概率［35］。例如，介導(dǎo)體細(xì)胞重新編碼為PSC 的逆轉(zhuǎn)錄因子c-Myc，正是最常見(jiàn)的癌變因子之一［9］。因此，安全性評(píng)估和如何有效控制細(xì)胞癌變是HD 細(xì)胞治療亟待解決的關(guān)鍵性課題之一。

2.3 倫理道德 雖然現(xiàn)在大部分細(xì)胞療法的細(xì)胞來(lái)源都是自體細(xì)胞，但是在臨床和科研的探索過(guò)程中，細(xì)胞療法大多使用的還是同種異體的細(xì)胞，這就可能導(dǎo)致倫理道德問(wèn)題的發(fā)生［36］。此外，采用損傷人類(lèi)胚胎的代價(jià)來(lái)?yè)Q取對(duì)某個(gè)疾病的緩解，這個(gè)倫理問(wèn)題仍一直困擾著各種細(xì)胞治療方案，這不僅僅是針對(duì)HD，也是導(dǎo)致近十年只有少數(shù)細(xì)胞療法能通過(guò)監(jiān)管批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)的原因［37］。

臨床試驗(yàn)之前風(fēng)險(xiǎn)收益比評(píng)估也是一項(xiàng)必要的倫理評(píng)價(jià)指標(biāo)［38］。在現(xiàn)有接受根治手術(shù)的HD 患者中，總體優(yōu)良存活率≥95%［39-40］，這就引發(fā)了這樣一個(gè)問(wèn)題：是否有必要在這些患者中開(kāi)展首例人類(lèi)細(xì)胞療法臨床試驗(yàn)？Alhawaj 等［37］對(duì)此提出了一個(gè)臨床試驗(yàn)設(shè)想：將存在造瘺高風(fēng)險(xiǎn)的長(zhǎng)段型巨結(jié)腸患者作為先期試驗(yàn)對(duì)象，將細(xì)胞治療作為根治手術(shù)的輔助治療方案，類(lèi)似于晚期惡性腫瘤的術(shù)前化療方案，這部分患者將有可能在細(xì)胞療法試驗(yàn)中獲益，減少腸造瘺概率，改善根治術(shù)前的生活質(zhì)量，同時(shí)有望在試驗(yàn)成功時(shí)治愈疾病無(wú)需手術(shù)。

3 總結(jié)與展望

雖然HD 的細(xì)胞治療仍處于起步階段，各類(lèi)臨床研究和試驗(yàn)還有很長(zhǎng)的路要走，但是近十年的研究成果已經(jīng)可以看到這一領(lǐng)域有著巨大的潛力，有望在未來(lái)可以推動(dòng)臨床上HD 的非手術(shù)治療進(jìn)展，不僅如此，細(xì)胞治療也在HD 的致病機(jī)制、模型構(gòu)建［41］、藥物開(kāi)發(fā)［42］等領(lǐng)域有著不可替代的地位。

與此同時(shí)，細(xì)胞治療在進(jìn)入大眾視野之前，還需要經(jīng)受許多考驗(yàn)和挑戰(zhàn)：如何在進(jìn)行臨床試驗(yàn)和研究過(guò)程中不觸碰倫理道德底線，如何能夠在體外更精確地控制細(xì)胞分化，以及如何最大程度減少移植細(xì)胞的癌變等都是未來(lái)需要解決的難題。