豬傳染性胃腸炎病毒感染仔豬免疫器官的組織病理學(xué)觀察

賀葉青,左百姣,李慶豪,孫 娟,金 鑫,夏 璐*,魏戰(zhàn)勇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046;2.動(dòng)物病原與生物安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046)

豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridaefamily)、α冠狀病毒屬(Alphacoronaviruses)成員,是引起仔豬腹瀉的重要病原[1]。1946年Doyle等首次發(fā)現(xiàn)該病毒是引起豬傳染性胃腸炎的病原,隨后該疾病在許多國(guó)家暴發(fā)[2]。我國(guó)于1956年發(fā)現(xiàn)該病,并在多個(gè)省份相繼報(bào)道[3]。TGEV感染通常發(fā)生在寒冷季節(jié),如冬季和早春,主要引起2周齡以?xún)?nèi)仔豬發(fā)生嘔吐、腹瀉和脫水,對(duì)仔豬的致死率高達(dá)100%,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前疫苗接種是防控TGEV感染的主要措施,但是近年來(lái)隨著TGEV變異株的出現(xiàn),使該病無(wú)法得到有效控制[4]。

研究表明,TGEV感染仔豬主要引起消化系統(tǒng)癥狀,導(dǎo)致空腸和回腸絨毛萎縮甚至脫落,腸壁滲透壓失衡而腹瀉脫水。最新研究發(fā)現(xiàn)變異的TGEV還可以感染呼吸道,在仔豬肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制,造成肺的廣泛損傷[5]。

目前關(guān)于TGEV組織嗜性的研究大多集中在感染仔豬的腸道。研究發(fā)現(xiàn)被感染仔豬回腸派伊爾氏結(jié)區(qū)域明顯縮小,sIgA陽(yáng)性細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低,并且在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到有病毒顆粒分布,提示TGEV還可感染仔豬的免疫系統(tǒng)[6]。因此,本文對(duì)TGEV感染后仔豬的免疫系統(tǒng)進(jìn)行全面、深入研究,不僅為T(mén)GEV的免疫致病機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)也對(duì)該病的診斷、防治提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 從河南某豬場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)10只健康狀況良好的5日齡仔豬,試驗(yàn)前經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)仔豬糞便中TGEV、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、豬輪狀病毒(porcine rotavirus,PoRV)、豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等常見(jiàn)豬腹瀉傳染病原核酸陰性,采集仔豬血清酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)仔豬血清中TGEV抗體陰性。

1.1.2 病毒、抗體及主要試劑 TGEV HN-2012毒株由河南省動(dòng)物源性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備和保存;TGEV N蛋白單克隆抗體由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院李彬研究員饋贈(zèng);(鼠/兔)SP試劑盒(貨號(hào)KIT-9720)、AEC顯色試劑盒(貨號(hào)AEC-0037),購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(貨號(hào)C1010),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和感染試驗(yàn) 10頭5日齡健康仔豬隨機(jī)分為空白對(duì)照組和TGEV感染組,每組5頭,分別飼養(yǎng)在兩個(gè)不同的封閉豬舍內(nèi),每隔6 h人工喂奶。感染組仔豬口服10 mL TGEV(TCID50為107·0.1 mL-1),空白對(duì)照組仔豬口服相同體積的DMEM培養(yǎng)基,仔豬在感染5 d后逐一進(jìn)行安樂(lè)死剖殺。所有動(dòng)物試驗(yàn)程序均按照河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理與使用委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.2.2 樣品采集與處理 仔豬處死后,分別采集仔豬的中樞免疫器官(胸腺)和外周免疫器官(脾、扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、髂下淋巴結(jié)、頸淺淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)),一式三份,固定在40 g·L-1多聚甲醛中以備后續(xù)使用。

1.2.3 組織切片的制備 仔豬的各臟器固定48 h后,從多聚甲醛中取出修塊,放入包埋盒中流水沖洗過(guò)夜,然后依次按照梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、石蠟切片機(jī)切片的過(guò)程處理,最后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)染色。

1.2.4 HE染色 為了解TGEV感染仔豬后免疫器官的病理變化,對(duì)免疫系統(tǒng)的各組織樣品進(jìn)行HE染色。制作好的石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水后,用HE染色,中性樹(shù)膠封片后進(jìn)行觀察和分析。

1.2.5 免疫組化染色 為了分析TGEV在仔豬免疫系統(tǒng)中的分布,用TGEV N蛋白單克隆抗體進(jìn)行染色。采集的各組織經(jīng)脫蠟、水化和流水沖洗后,用0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù),過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的干擾,50 g·L-1牛血清白蛋白溶液室溫封閉10 min阻斷抗體的非特異性結(jié)合。接著,將TGEV N蛋白單克隆抗體(1∶500)在4 ℃條件下孵育過(guò)夜,生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG聚合物與樣本室溫孵育10 min,鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶室溫孵育10 min,最后用AEC顯色試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行顯色。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)分析

2.1.1 中樞免疫器官的病理變化 胸腺組織的HE染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬胸腺的結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常,皮質(zhì)和髓質(zhì)邊界清晰,胸腺小體清晰可見(jiàn)(圖1A);TGEV感染組仔豬胸腺髓質(zhì)區(qū)域增大,淋巴細(xì)胞減少(圖1B)。

2.1.2 外周免疫器官的病理變化 脾組織的HE染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬脾的結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常,紅髓、白髓和邊緣區(qū)結(jié)構(gòu)清晰,淋巴細(xì)胞染色正常(圖2A);TGEV感染組仔豬脾被膜和小梁增厚,紅髓增多,脾索和脾竇界限不清晰,淋巴細(xì)胞減少,紅髓中有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B)。

扁桃體組織的HE染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬扁桃體的結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常,扁桃體被膜、結(jié)締組織和淋巴濾泡染色清晰(圖2C);TGEV感染組仔豬扁桃體細(xì)胞淡染,淋巴濾泡和淋巴細(xì)胞均減少(圖2D)。

淋巴結(jié)組織的HE染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常,淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)清晰完整(圖2E、2G、2I、2K和2M);TGEV感染組仔豬的淋巴結(jié)均有不同程度的損傷,顯微鏡觀察均可見(jiàn)淋巴結(jié)腫大,淋巴竇中有大量血細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有鐵銹色顆粒,提示巨噬細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)。頸淺淋巴結(jié)髓質(zhì)中髓索和髓竇界限不清,髓竇中充滿(mǎn)淡紅色紅染物質(zhì)(圖2F);腹股溝淋巴結(jié)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞增生,呈團(tuán)島狀分布,淋巴竇擴(kuò)張,髓質(zhì)的髓索變粗(圖2H);下頜淋巴結(jié)可見(jiàn)淋巴小結(jié)邊界模糊(圖2J);腸系膜淋巴結(jié)可見(jiàn)細(xì)胞淡染,淋巴細(xì)胞減少(圖2L);髂下淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞增多,小梁增厚(圖2N)。

2.2 TGEV在仔豬免疫系統(tǒng)的分布

2.2.1 中樞免疫器官TGEV的分布 胸腺的IHC染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬胸腺未見(jiàn)明顯陽(yáng)性著色(圖3A);TGEV感染組仔豬胸腺的被膜和皮質(zhì)中看到少量特異性紅色著色點(diǎn)(圖3B)。

2.2.2 外周免疫器官TGEV的分布 脾組織的IHC染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬脾未見(jiàn)明顯陽(yáng)性著色(圖4A);TGEV感染組仔豬脾紅髓和邊緣區(qū)可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞呈特異性紅色著色點(diǎn)(圖4B)。

扁桃體組織的IHC結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬扁桃體未見(jiàn)明顯陽(yáng)性著色(圖4C);TGEV感染組仔豬扁桃體被膜下方的彌散淋巴組織呈特異性紅色著色點(diǎn)(圖4D)。

淋巴結(jié)組織的IHC結(jié)果顯示,空白對(duì)照組仔豬淋巴結(jié)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性著色(圖4E、4G、4I、4K和4M);TGEV感染組仔豬頸淺淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)被膜下淺層皮質(zhì)區(qū)有大量淋巴細(xì)胞呈特異性紅色著色點(diǎn),大多分布在鐵銹色沉積周?chē)?圖4F和4H),下頜淋巴結(jié)可見(jiàn)淋巴小結(jié)周?chē)刑禺愋约t色著色點(diǎn)(圖4J),腸系膜淋巴結(jié)和髂下淋巴結(jié)淺層皮質(zhì)區(qū)有少量特異性紅色著色點(diǎn),與對(duì)照組對(duì)比不明顯(圖4L和4N)。

TGEV存在于多種免疫器官,病毒載量以脾為最高,其他器官病毒載量由高到低依次為頸淺淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、扁桃體、下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、髂下淋巴結(jié)、胸腺(圖5)。

3 討 論

TGEV是一種腸致病性冠狀病毒,主要引起仔豬嘔吐、腹瀉、脫水等臨床癥狀,剖檢可見(jiàn)感染仔豬的胃中充滿(mǎn)著未消化的凝乳塊,腸壁明顯變薄,腸腔內(nèi)充滿(mǎn)大量黃色液體內(nèi)容物,同時(shí)伴有腸系淋巴結(jié)出血[7-9]。鏡檢發(fā)現(xiàn)TGEV感染主要引起仔豬腸絨毛萎縮,上皮細(xì)胞空泡化并出現(xiàn)脫落,最終導(dǎo)致仔豬的營(yíng)養(yǎng)吸收障礙和腹瀉[7]。深入研究發(fā)現(xiàn),TGEV主要感染仔豬的腸上皮細(xì)胞,包括腸細(xì)胞、干細(xì)胞和杯狀細(xì)胞[6]。目前,TGEV感染仔豬的相關(guān)研究大多集中于腸道,而TGEV對(duì)仔豬全身免疫系統(tǒng)影響的研究報(bào)道較少[10-11]。免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫功能的機(jī)構(gòu),在抵御病原微生物入侵機(jī)體中發(fā)揮重要作用。因此,開(kāi)展TGEV對(duì)仔豬免疫系統(tǒng)的研究有助于全面了解該病毒的致病性,對(duì)臨床指導(dǎo)TGEV的防控具有重要的理論和實(shí)踐意義。本試驗(yàn)通過(guò)HE染色對(duì)TGEV感染仔豬后免疫器官的病理變化進(jìn)行分析,并且通過(guò)IHC染色檢測(cè)了病毒粒子在免疫器官內(nèi)的分布。

HE結(jié)果表明,TGEV感染仔豬可引起中樞免疫器官免疫細(xì)胞減少;外周免疫器官腫大、出血,免疫細(xì)胞減少。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染后病豬脾腫大、充血,部分淋巴結(jié)腫脹、充血,顏色變深呈紫紅色[8]。引起仔豬腹瀉的豬腸道冠狀病毒還包括PEDV、PDCoV等。PEDV感染仔豬后也發(fā)現(xiàn)仔豬的免疫系統(tǒng)受到損傷,如免疫細(xì)胞減少,腸系膜淋巴結(jié)毛細(xì)血管充血或輕微出血,脾內(nèi)有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[12]。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引發(fā)的新冠肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。調(diào)查發(fā)現(xiàn)COVID-19患者免疫功能受損在臨床中表現(xiàn)非常突出,主要表現(xiàn)為脾體積明顯縮小,紅髓脾竇擴(kuò)張、充血,白髓呈不同程度萎縮,嗜血細(xì)胞增多,中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞數(shù)量增多,嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量下降[13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),COVID-19患者外周血T淋巴細(xì)胞(CD4+和CD8+)過(guò)度激活,表現(xiàn)為CCR4+CCR6+Th17細(xì)胞的增加和CD8+T淋巴細(xì)胞的高細(xì)胞毒性,提示患者遭受了嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)損傷[14]。上述結(jié)果表明冠狀病毒可以對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)造成損傷,今后應(yīng)重視冠狀病毒對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。

IHC的結(jié)果顯示,TGEV存在于多種免疫器官,并且脾中的病毒載量最高(圖8P)。間接免疫熒光方法也在仔豬腸系膜淋巴結(jié)中檢測(cè)到了TGEV[15]。RT-PCR方法也在仔豬的脾、扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)等免疫器官內(nèi)檢測(cè)到了PDCoV和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的存在[16-17]。IHC和原位雜交等方法也在COVID-19患者脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到SARS-CoV-2[13]。這些研究說(shuō)明了冠狀病毒可以感染免疫系統(tǒng)。豬氨肽酶N(porcine aminopeptidase N, pAPN)是TGEV感染的主要功能性受體[18]。TGEV分布于多個(gè)免疫器官,作者猜測(cè)這些免疫器官中存在pAPN的表達(dá)。作者還發(fā)現(xiàn)感染仔豬脾的紅髓中有大量血細(xì)胞浸潤(rùn),淋巴組織中有大量血細(xì)胞浸潤(rùn)和鐵黃素沉積,推測(cè)TGEV感染仔豬后引起病毒血癥,通過(guò)血液循環(huán),到達(dá)脾、淋巴結(jié)等免疫器官,促使機(jī)體啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答,造成免疫器官損傷。

綜上,TGEV感染仔豬后,引起各免疫器官不同程度的損傷,且在各免疫器官內(nèi)均有TGEV分布,表明TGEV能夠感染仔豬免疫系統(tǒng)并引起仔豬各免疫器官組織損傷,降低機(jī)體的免疫功能。今后的研究中應(yīng)關(guān)注豬腸道冠狀病毒對(duì)仔豬免疫系統(tǒng)的影響,在臨床治療中采取相應(yīng)的干預(yù)措施。

4 結(jié) 論

TGEV感染損傷仔豬免疫器官,降低機(jī)體免疫功能。