羥基酪醇對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和腸道炎性因子的影響

蘇 丹,文曉賓,馬 騰,鐘儒清*,王 陽(yáng),陳 亮

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,青島 266000;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng) 全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

羥基酪醇(Hydroxytyrosol, HT)是一種天然單組分酚類化合物,主要以脂類的形式存在于橄欖果實(shí)、橄欖葉以及橄欖油中[1]。HT具有較好的水溶性和脂溶性,在動(dòng)物胃腸道中被吸收后,可迅速轉(zhuǎn)移并廣泛分布于體內(nèi)各組織中,是目前發(fā)現(xiàn)的生物利用度最高的一種酚類[2]。HT具有顯著的藥理學(xué)作用[3],能有效抗炎、抗菌、抗腫瘤,有良好的抗氧化性,是天然的抗氧劑之一[1]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)HT的研究主要集中在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域和保健行業(yè),在畜禽生產(chǎn)領(lǐng)域也將有重要應(yīng)用潛力。特別是在后抗生素時(shí)代,開發(fā)綠色、天然、高效的飼料“替抗”添加劑已經(jīng)成為畜禽行業(yè)重要的探索課題。前人研究發(fā)現(xiàn),HT對(duì)二硫化碳(CS2)誘導(dǎo)的小鼠睪丸組織損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制主要是HT維持了抗氧化酶的活性,緩解了氧化損傷[4]。本團(tuán)隊(duì)前期研究也發(fā)現(xiàn),飼喂100 mg·kg-1體重(BW)橄欖粗提物的小鼠可以通過(guò)改善結(jié)腸微生物群落提升機(jī)體的抗氧化能力[5]。進(jìn)一步深入探討揭示,羥基酪醇不僅顯著提高了氧化應(yīng)激小鼠小腸中Nrf2抗氧化通路相關(guān)基因的mRNA水平,還通過(guò)影響甘油磷酸以及戊糖和葡萄糖醛酸鹽轉(zhuǎn)化代謝通路,提高機(jī)體的抗氧化能力[6]。然而,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)HT的研究主要是以小鼠為研究對(duì)象,除了本團(tuán)隊(duì)在公豬精液品質(zhì)提升上的研究等少數(shù)幾個(gè)報(bào)道外[4],在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究還較少。而肉雞產(chǎn)業(yè)是我國(guó)目前畜禽養(yǎng)殖中集約化養(yǎng)殖程度最高的產(chǎn)業(yè),特別是飼料禁抗以后肉雞養(yǎng)殖對(duì)綠色替抗飼料添加劑產(chǎn)品的需求更為迫切。因此,本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加HT對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和腸道炎性因子等的影響,為在畜牧行業(yè)“禁抗、限抗”背景下開發(fā)一種以HT為核心成分的肉雞新型天然綠色添加劑提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取初始體重(BW)為(46.0±1.0)g的1日齡健康愛拔益加(AA)肉仔雞126只,隨機(jī)分為3個(gè)處理組,每個(gè)組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)7只雞。對(duì)照組(CON)飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,其為參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制的粉狀配合飼料,基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1?？股亟M(ANT)飼糧是在基礎(chǔ)飼糧中添加100 mg·kg-1的金霉素,另外的試驗(yàn)飼糧為在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg·kg-1HT的飼糧,試驗(yàn)期為21 d。試驗(yàn)所用HT為杭州唯鉑萊生物科技有限公司提供,純度為99%。

肉雞試驗(yàn)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室昌平試驗(yàn)基地開展,采用三層立體籠養(yǎng),所有籠子配置飲水器,試驗(yàn)期間自由采食和飲水。試驗(yàn)期間清洗、消毒、雞只免疫、飼養(yǎng)規(guī)程等按動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)定執(zhí)行。試驗(yàn)前1～3 d雞舍溫度控制在33 ℃左右,之后每2 d降低1 ℃,直到雞舍溫度降到26 ℃左右。整個(gè)試驗(yàn)期間每天記錄雞只的數(shù)量,每周記錄采食量,21 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱重。

1.2 樣品采集

在試驗(yàn)的第21天,從CON組、ANT組以及HT組中,每個(gè)重復(fù)里面隨機(jī)挑選1只接近平均體重的肉雞進(jìn)行樣品采集。從翼根靜脈采血至采血管,分離血清,于-20 ℃冰箱保存。頸靜脈放血致死,解剖后快速分離盲腸和空腸,將盲腸縱向切開,用無(wú)菌取樣匙取出其中的內(nèi)容物,放于液氮中保存。將空腸沿腸系膜剪開,輕輕除去食糜,用生理鹽水沖洗干凈,刮取中部黏膜組織,液氮速凍后置于-80 ℃中保存。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能 試驗(yàn)第21天稱取每只雞的體重,試驗(yàn)期間以重復(fù)為單位記錄采食量,根據(jù)肉雞體重和采食量計(jì)算1～21 d的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料肉比(F/G)等指標(biāo)。

1.3.2 器官重量及器官指數(shù) 將肉雞放血后進(jìn)行屠宰解剖,采集肝、脾、法氏囊、腎,用濾紙擦去血漬,去除脂肪后稱取器官重。器官指數(shù)按照如下公式計(jì)算:

器官指數(shù)(g·kg-1)= 器官重量(g)/活體重量(kg)。

1.3.3 血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定 將保存的血清進(jìn)行抗氧化指標(biāo)的測(cè)定,試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,所有操作均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,采用酶標(biāo)儀(Tecan Infinite 200 Pro,瑞士)測(cè)定血清中的總抗氧化能力(T-AOC,AO15-1-2)、丙二醛(MDA,A003-1-1)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD,A001-1-1)和過(guò)氧化氫酶(CAT,A007-1-1)的活性。

1.3.4 盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)含量的測(cè)定 稱取0.5 mg盲腸內(nèi)容物于1 mL的生理鹽水中,混勻后取0.8 mL的上清液,按照5∶1的比例加入25%的偏磷酸繼續(xù)混合均勻,室溫靜置反應(yīng)3～4 h后離心,45 μm微孔濾膜(尼龍系)過(guò)濾,加入上機(jī)瓶(600 μL以上),在色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 5975C,美國(guó))中主要檢測(cè)乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、異丁酸(isobutyric acid)、丁酸(butyric acid)、異戊酸(isovaleric acid)、戊酸(valeric acid)等,具體操作參考Tang等[7]的方法執(zhí)行。

1.3.5 基因表達(dá)檢測(cè)

1.3.5.1 肉雞腸道黏膜總RNA的提取:將腸道黏膜從-80 ℃冰箱中取出,稱取約10 mg組織,RNA提取按照Qiagen RNesay Kit試劑盒(QIAGEN,德國(guó))的說(shuō)明書在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。取1 μL總RNA使用超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop-μLite,英國(guó))進(jìn)行定量,確保RNA樣品的檢測(cè)數(shù)值A(chǔ)260/280=1.8～2.0即可。提取的總RNA通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量,確定RNA條帶清晰明亮且無(wú)拖尾現(xiàn)象后進(jìn)行定量、反轉(zhuǎn)錄和定量操作。

1.3.5.2 反轉(zhuǎn)錄及定量:采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,日本),對(duì)1 μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA用于熒光定量PCR。熒光定量PCR采用TB Green Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus, TaKaRa,日本)試劑盒在7500 Real-time PCR System (ABI,美國(guó))進(jìn)行,熒光定量PCR操作均按照說(shuō)明書進(jìn)行。組織中各基因相對(duì)表達(dá)量以β-actin和GAPDH雙管家基因?yàn)閮?nèi)參,基因表達(dá)量采用2-ΔΔct法進(jìn)行計(jì)算。以上操作均在超凈臺(tái)中完成。

1.3.5.3 PCR引物的設(shè)計(jì)合成:所有引物均使用Primer-BLAST(NCBI的引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)在線設(shè)計(jì)并檢驗(yàn)其特異性,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Toll樣受體4(TLR-4)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NK-κB)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及內(nèi)參基因(β-actin)所有引物均由模板梯度稀釋后做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算擴(kuò)增效率,經(jīng)測(cè)試所有引物擴(kuò)增效率均在90%～100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以JMP10.0軟件(A Business Unit of SAS SAS Campus Drive Cary, NC 27513)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示,采用單因素方差分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,采用Tukey法對(duì)不同處理的均值進(jìn)行多重比較。結(jié)果以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 羥基酪醇對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

從表2可知,在21 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí),HT組和ANT組肉雞的BW分別為855.35和859.23 g,相較于CON組(824.86 g)分別提高了3.70%和4.17%,但差異未達(dá)到顯著水平(P=0.285)。類似地,HT組和ANT組肉雞的ADG比CON組分別提高了1.36和1.73 g,亦未達(dá)到顯著水平。飼喂羥基酪醇肉雞的ADFI為57.17 g,顯著高于CON組和ANT組(P=0.007)。三組肉雞的料重比數(shù)據(jù)具有差異趨勢(shì)(P=0.069),分別為1.39(CON組)、1.34(ANT組)和1.48(HT組)。

2.2 羥基酪醇對(duì)肉雞器官重量及器官指數(shù)的影響

如表3所示,從數(shù)值上看,相較于CON組和ANT組,HT組肉雞肝重(22.48 g)、肝臟指數(shù)(28.5 g·kg-1)、腎臟重量(2.87 g)、腎臟指數(shù)(7.28 g·kg-1)以及法氏囊重量(1.75 g)最高,但差異未達(dá)到顯著水平。HT組肉雞的脾重(0.70 g)和

表2 羥基酪醇對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of hydroxytyrosol on growth performance of broilers

脾臟指數(shù)(0.89 g·kg-1)在數(shù)值上低于另外兩個(gè)組,但差異不顯著。

2.3 羥基酪醇對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知,與CON組相比,飼糧中添加HT和添加ANT均顯著降低肉雞血清中MDA含量(P<0.01)。添加HT的肉雞血清中CAT值為0.23 U·mL-1,遠(yuǎn)高于CON組(0.03 U·mL-1)和ANT組(0.06 U·mL-1,P<0.01)。與CON組相比,飼糧中添加HT和ANT還有提高血清中T-SOD的趨勢(shì)(P=0.068)。各組肉雞血清的T-AOC值沒有統(tǒng)計(jì)上的差異性。

表4 羥基酪醇對(duì)肉雞血清抗氧化能力的影響Table 4 Effect of hydroxytyrosol on serum antioxidant capacity of broilers

2.4 羥基酪醇對(duì)肉雞空腸炎性因子的影響

由圖1A可知,與CON組和ANT組相比,添加HT顯著降低空腸黏膜TLR4/NF-κB信號(hào)通路中TLR-4的mRNA水平(P<0.05)。HT組肉雞空腸黏膜NF-κB的mRNA表達(dá)量也低于ANT組(圖1B,P<0.05),但是與CON組沒有顯著差異。與CON組和ANT組相比,添加HT均能不同程度地降低致炎性因子IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)量(圖1C、1 D,P<0.05)。TNF-α的mRNA表達(dá)量在HT和ANT組間沒有顯著性差異,但是均顯著低于CON組(圖1F,P<0.05)。抑炎性因子TGF-β和IL-10的mRNA在HT組肉雞空腸黏膜中的表達(dá)量也顯著低于CON組和ANT組(圖1E、1 G,P<0.05)。

2.5 羥基酪醇對(duì)肉雞盲腸內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸的影響

由表5可知,三個(gè)處理組肉雞盲腸內(nèi)容物中的揮發(fā)性脂肪酸主要是乙酸、丙酸、丁酸,異丁酸、異戊酸和戊酸含量較低。以上不同揮發(fā)性脂肪酸含量在三個(gè)不同處理間差異并不顯著。

3 討 論

HT主要提取自橄欖果實(shí)、橄欖葉及橄欖相關(guān)加工品,我國(guó)亦有較為豐富的橄欖品種資源[8]。此外,使用合成生物學(xué)技術(shù)、化學(xué)合成法和光催化合成法是獲得HT的重要途徑[9]。大量文獻(xiàn)報(bào)道,HT具有抗氧化、抗炎、預(yù)防癌癥、降脂等多方面生物學(xué)功能[10],目前多應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品保健等行業(yè)上。在養(yǎng)殖行業(yè),對(duì)維護(hù)畜禽動(dòng)物腸道健康、保護(hù)肝、促進(jìn)骨骼發(fā)育等方面也具有巨大應(yīng)用潛力[8]。畜禽養(yǎng)殖業(yè),首先關(guān)注的就是對(duì)畜禽動(dòng)物的生長(zhǎng)性能及對(duì)飼料養(yǎng)分的消化吸收效率。Leskovec等[11]添加了10%的發(fā)酵橄欖葉于肉雞飼料中,發(fā)現(xiàn)可以顯著提升肉雞對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的利用效率。在以海鯛為對(duì)象的研究中發(fā)現(xiàn),飼料中添加橄欖殘?jiān)崛∥?具有提高其生長(zhǎng)性能的趨勢(shì)[12]。Vazquez-Gomez等[13]在豬的研究中表明,母體補(bǔ)充HT可以改善子代產(chǎn)前和產(chǎn)后的生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),添加HT可以顯著提高肉雞采食量,但是肉雞的終體重差異并不顯著?？赡苁且?yàn)楸驹囼?yàn)周期較短,其促進(jìn)生長(zhǎng)的功能效果還沒有完全體現(xiàn)出來(lái)[14]。大量文獻(xiàn)報(bào)道,HT可以通過(guò)抑制機(jī)體炎性反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,增加抗氧化活性等途徑發(fā)揮保護(hù)機(jī)體肝功能的作用[15-16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),500 mg kg-1HT處理組肉雞的肝重量和肝臟指數(shù)在數(shù)值上均高于CON組和ANT組,這與HT調(diào)控肉雞肝組織健康是否相關(guān)以及其具體作用途徑還需要進(jìn)一步驗(yàn)證探究。

若機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或者清除能力下降,機(jī)體氧化和抗氧化防御系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被破壞,進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激會(huì)損傷機(jī)體DNA、蛋白質(zhì)及組織結(jié)構(gòu),進(jìn)而誘發(fā)多種疾病,甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡[17]。MDA是氧化應(yīng)激的主要標(biāo)志物,其含量可以直接反映體內(nèi)自由基的反應(yīng)程度,也間接反映細(xì)胞的受損程度[18]。而SOD、CAT等則共同構(gòu)成機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng),能夠一定程度上清除過(guò)量產(chǎn)生的氧自由基,發(fā)揮抗氧化作用[17,19]。研究表明,HT可直接清除機(jī)體內(nèi)源性和外源性自由基和氧化物,又可通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2和JNK-p62/SQSTM1抗氧化系統(tǒng)間接抑制氧化應(yīng)激[20],其抗氧化能力是茶多酚的15倍、輔酶Q的3倍[16,21]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),飼喂HT顯著降低肉雞血清中的MDA含量,提高了CAT的活性,對(duì)SOD活性也有提升的趨勢(shì),這與本團(tuán)隊(duì)前期以小鼠和公豬為模式動(dòng)物的研究結(jié)果也相一致[4-6]。

TLR-4/NF-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)免疫應(yīng)答和機(jī)體炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼喂HT能夠不同程度地降低肉雞腸道黏膜的TLR-4和NF-κB的mRNA水平,抑制下游炎性因子的產(chǎn)生,這與Wang等[22]的報(bào)道相一致。本試驗(yàn)中,500 mg·kg-1HT添加組肉雞下游的致炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等均不同程度的降低,也再次驗(yàn)證HT的抗炎的作用。IL-10和TGF-β是體內(nèi)重要的抑炎細(xì)胞因子。有趣的是,本試驗(yàn)也同時(shí)發(fā)現(xiàn),飼喂HT肉雞腸道黏膜的IL-10和TGF-β表達(dá)量較CON和ANT組顯著降低,這與Wang等[23]及Shan和Miao[24]的研究結(jié)果不完全一致。推測(cè),這可能由于HT一定程度上影響了抑炎因子和促炎因子的動(dòng)態(tài)平衡,未來(lái)可以通過(guò)肉雞的腸道炎癥模型試驗(yàn)或者細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。

本試驗(yàn)還分析了HT對(duì)肉雞后腸SCFA的影響。SCFA是腸道微生物碳水化合物發(fā)酵的代謝產(chǎn)物,其含量與腸道菌群的數(shù)量和組成密切相關(guān)。前期本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物在HT發(fā)揮機(jī)體抗氧化功能過(guò)程中存在重要的介導(dǎo)作用[4-6],但是本研究并沒有發(fā)現(xiàn)飼喂HT對(duì)SCFA含量有顯著性的影響。這可能是HT大多在前消化道被吸收,少部分進(jìn)入后腸的HT通過(guò)改變關(guān)鍵菌的相對(duì)豐度發(fā)揮功能調(diào)節(jié)作用,而對(duì)微生物總量影響有限導(dǎo)致的[6]。后續(xù)還需要進(jìn)一步開展微生物多樣性和功能分析,以驗(yàn)證HT對(duì)肉雞腸道微生物的調(diào)節(jié)作用。

A.G. 分別為空腸TLR-4、NF-κB、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量。柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) A-G. The relative expression levels of TLR-4, NF-κB, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, TGF-β mRNA, respectively. Bars with different lowercase letters mean significant different(P<0.05)圖1 羥基酪醇對(duì)肉雞空腸炎性因子相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.1 Influence of hydroxytyrosol on the mRNA relative expression level of jejunal inflammatory factors of broilers

表5 飼料添加羥基酪醇對(duì)肉雞盲腸內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸的影響Table 5 Effects of dietary hydroxytyrosol on volatile fatty acids in cecum content of broilers μmol·g-1

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下,肉雞飼糧中添加羥基酪醇可以提高機(jī)體抗氧化能力,降低炎性因子水平,并可能通過(guò)此改善肉雞的生長(zhǎng)性能,一定程度上實(shí)現(xiàn)抗生素替代。其具體作用機(jī)制及在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)上的應(yīng)用前景還需要進(jìn)一步探討評(píng)估。