黃芩苷通過促進Ⅰ型干擾素表達抑制雞傳染性支氣管炎病毒復制

賈藝泉,于夢婷,劉衛(wèi)容,方守國,章松柏,3

(1.長江大學醫(yī)學部,荊州 434023;2.長江大學農(nóng)學院,荊州 434025;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中游作物 綠色高效生產(chǎn)重點實驗室(部省共建),長江大學農(nóng)學院,荊州 434025)

雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)屬于冠狀病毒科Gamma冠狀病毒屬,是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。IBV是一種常見的呼吸道疾病病原體,對家禽業(yè)構成嚴重威脅。截至目前,已鑒定出多種具有持續(xù)突變能力的IBV毒株,并且由于不同毒株間可以進行不斷重組,導致IBV的基因型和血清型更加多樣化和復雜,這是目前預防和控制傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)面臨的主要難題。因此,制定一些新的策略對于防治IBV感染,減少與IBV感染相關的經(jīng)濟損失迫在眉睫[2-4]。

在抗病毒方面,中草藥因其安全、有效及低成本而備受關注,多種植物提取物或植物中的有效成分被證實在體內(nèi)外具有積極的抗病毒作用[5]。黃芩苷是從黃芩(Scutellari)根中分離出的黃酮類化合物[6],具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤和抗氧化等多種藥理活性,其中以抗病毒活性著稱[7],對流感病毒(influenza virus,IV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、柯薩奇病毒(coxsackieviruses,CV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)以及嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2(SARS-CoV-2)等均具有一定的抑制作用[8-11]。在IB防治方面,黃芩苷的抗病毒作用及其作用機制仍知之甚少。有報道指出,黃芩苷在雞胚及雛雞上對IBV感染具有一定的抑制效果[12-13],但其潛在的作用機制尚不清楚。另有報道顯示,黃芩苷可通過靶向Ras-GTPase激活蛋白結合蛋白1(Ras GTPase-activating protein-binding protein 1,G3BP1)誘導PKR/eIF2α通路磷酸化及應急顆粒(stress granules,SG)形成,啟動抗病毒反應,抑制IBV在Vero細胞中的復制[14]。在本課題前期研究中,中草藥黃芩乙醇提取物對IBV在H1299細胞中的復制有較明顯的抑制效果[15]。中草藥具有多種化學成分,其發(fā)揮某種藥效可能是由單個化學成分起作用或由多個化學成分共同起作用。為確定黃芩提取物中發(fā)揮抗IBV藥理活性的關鍵藥效物質(zhì),本研究將進一步分析黃芩的主要活性成分黃芩苷對IBV的抑制作用。

先天免疫系統(tǒng)是保護宿主免受病毒感染的第一道防線,而誘導Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)合成是先天免疫系統(tǒng)的重要抗病毒機制[16]。越來越多的研究表明,傳統(tǒng)中草藥可以通過調(diào)節(jié)宿主的先天免疫反應發(fā)揮抗病毒作用[17-18]。在一項研究中,黃芩苷可通過上調(diào)干擾素的表達,激活其下游JAK-STAT通路,在RSV-感染小鼠中發(fā)揮抗病毒活性[19]。但目前未見黃芩苷參與調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生與IBV感染之間關系的報道。本研究擬在分析黃芩苷對IBV抑制作用的基礎上,進一步探究黃芩苷對宿主細胞Ⅰ型干擾素信號通路的調(diào)控作用,明晰黃芩苷影響IBV復制的作用機制,為黃芩苷在獸醫(yī)臨床上的應用及相關靶點藥物的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 H1299細胞(人非小細胞肺癌細胞)系由新加坡南洋理工大學生物學院病毒實驗室惠贈;Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)由本實驗室保存。因固有的基因缺陷,Vero細胞不能表達抗病毒干擾素,文章中除病毒噬斑分析,其余研究均在能表達干擾素的H1299細胞中進行。病毒IBV Beaudette 株(IBV-p65)由長江大學農(nóng)學院病毒學實驗室保存;重組病毒IBV-3ab-luc由長江大學農(nóng)學院病毒學實驗室構建,是利用反向遺傳學技術,在IBV全基因組的基礎上,用熒光素酶(luciferase)的基因序列替代IBV-p65的3ab片段構建而成。

1.1.2 主要試劑 黃芩苷(批號:N15GB167969),購自上海源葉生物科技有限公司;胎牛血清FBS、0.25% 胰酶、基礎培養(yǎng)基DMEM 購自Gibco 公司;2×TaqPCR StarMix為GenStar公司產(chǎn)品;苯甲基磺酰氟PMSF、RIPA 組織/細胞裂解液購自Solarbio公司;IBV N多克隆抗體由本實驗室制備并保存;IL-6抗體、IFN-β抗體、STAT1抗體、p-STAT1抗體、SOCS3抗體購自ABclonal公司;IRF3抗體、p-IRF3抗體購自Abcam公司;ExFect 轉染試劑購自Vazyme 公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Omega 公司。

1.2 黃芩苷對H1299細胞活性影響分析

稱取黃芩苷粉末500 μg溶于1 mL的無血清DMEM培養(yǎng)液中,制成濃度為500 μg·mL-1的黃芩苷母液,隨后用一定體積的DMEM將黃芩苷母液倍比稀釋成500、250、125、62.5、31.3 μg·mL-15個不同濃度。H1299細胞在96孔板中培養(yǎng)至覆蓋率達90%左右時,加入不同濃度的黃芩苷,100 μL·孔-1,每濃度設3個復孔,留一列細胞作為正常細胞對照,每孔只加100 μL DMEM,37 ℃,50 mL·L-1CO2條件下培養(yǎng)24 h。每孔加10 μL MTT溶液和90 μL DMEM培養(yǎng)液,細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 1 000 r·min-1離心5 min,再用150 μL 甲瓚溶液孵育10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值,并計算不同濃度藥物處理下對應的細胞抑制率。計算公式如下:抑制率(%)=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。本試驗中,對細胞的抑制率低于10%的黃芩苷濃度被選為無毒濃度,被用于后續(xù)試驗。

1.3 黃芩苷對IBV的抑制作用分析

1.3.1 病毒感染前加藥 在12孔板中,待H1299細胞覆蓋率達90%左右時,去掉上清液,加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液1 mL,先用黃芩苷預處理細胞3 h,再用 MOI=0.5 的IBV-3ab-luc感染細胞,每濃度設3個復孔,同時設病毒對照,即只用病毒感染不加黃芩苷處理。24 h后觀察病毒感染情況,按照熒光素酶檢測試劑盒說明書進行病毒熒光值檢測,分析病毒復制情況。

1.3.2 病毒感染后加藥 在12孔板中,待H1299細胞覆蓋率達90%左右時,去掉上清液,加入1 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液,先用 MOI=0.5 的IBV-3ab-luc病毒感染細胞3 h,再加入黃芩苷,每個濃度設3個復孔,同時設病毒對照。按“1.3.1”方法檢測病毒熒光值,分析病毒復制情況。

1.3.3 不同濃度的黃芩苷對IBV的抑制作用 將黃芩苷以最大無毒濃度為起點,倍比稀釋成不同濃度,在12孔板中,待H1299細胞覆蓋度達90%左右時,去掉上清液,加入1 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液,再分別加入MOI=0.5 的重組病毒IBV-3ab-luc和不同濃度的黃芩苷,各濃度均設復孔。按前述步驟進行病毒熒光值檢測,分析病毒復制情況。

1.4 病毒噬斑分析

將Vero細胞接種于6孔板,待細胞覆蓋率達90%左右時棄去培養(yǎng)液,用1%的PBS緩沖液潤洗細胞2次,加入1 mL無血清的DMEM培養(yǎng)液。將“1.3”中收集到的各組病毒原液梯度稀釋101倍～106倍,每孔中加入200 μL病毒稀釋液,每個稀釋梯度3個重復,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待病毒吸附細胞2～3 h,棄去6孔板中培養(yǎng)液,往每孔中加入3 mL含0.4%瓊脂糖的稀釋液覆蓋細胞,培養(yǎng)72 h,10%的甲醛液固定10 min,結晶紫染色。選取噬斑清楚且便于計數(shù)的視野統(tǒng)計噬斑數(shù),計算病毒滴度。

1.5 實時熒光定量PCR檢測干擾素通路相關基因mRNA表達水平

1.5.1 引物設計及合成 根據(jù)GenBank中IL-6、IRF3、IFN-β、SOCS3基因序列,利用Premier3.0軟件設計PCR引物,引物信息見表1。引物均由華大基因有限公司合成。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測基因的mRNA表達水平 將試驗設為4組:空白組(normal)、IBV組、病毒感染前加藥組(pre-treatment)、病毒感染后加藥組(post-treatment),在病毒感染細胞24 h后收集各組細胞,提取總RNA并反轉錄合成cDNA。按照表1設計的引物以合成的cDNA為模板,qPCR擴增相關基因片段。PCR反應體系20 μL: 2×TSINGKE Master qPCR Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板cDNA 1.0 μg ,ddH2O 補足總體積至20 μL。PCR反應程序: 95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s,61 ℃ 30 s,40個循環(huán)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 Western blot檢測干擾素通路相關基因蛋白表達水平

試驗分組同“1.5.2”,按照分組加入病毒和藥物。病毒感染細胞24 h后棄去培養(yǎng)液,采用一定體積RIPA與PMSF(體積比100∶1)混合液裂解各組細胞提取總蛋白,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離,低溫下轉至PVDF膜上,采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST 清洗PVDF膜。將PVDF膜與IL-6、SOCS3、IRF3、p-IRF3、IFN-β、STAT1、p-STAT1一抗4 ℃孵育過夜,次日TBST清洗3次。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗,37 ℃條件下?lián)u床孵育2 h,TBST 清洗3次,ECL發(fā)光底液進行顯色。

1.7 IBV對干擾素治療的敏感性分析

將重組人IFN-α(100 ng·mL-1)在病毒感染細胞2 h后加入IBV組和加藥組細胞培養(yǎng)體系中。18 h后,間接免疫熒光檢測IBV N蛋白的表達,分析各組在IFN-α處理后病毒的復制情況。

1.8 間接免疫熒光檢測p-STAT1核移位

將H1299細胞接種于24孔板,按分組加入病毒和藥物。病毒感染細胞24 h后棄去培養(yǎng)液,PBS潤洗2遍,4%多聚甲醛固定15 min,0.5% Triton-100透膜15 min。加入含3% BSA的封閉液室溫封閉1 h,滴加特異性一抗(p-STAT1,l∶200稀釋度),4 ℃過夜,PBS漂洗3次,每次5 min。滴加與第一抗體種屬匹配的熒光素標記二抗,37 ℃避光孵育30 min,PBS漂洗3次,每次5 min,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染細胞核15～20 min,甘油磷酸緩沖液封片,熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.9 RNA干擾試驗分析STAT1沉默對病毒復制的影響

根據(jù) GenBank中STAT1基因序列,以其mRNA轉錄本不同區(qū)域為靶點設計兩對STAT1 shRNA序列:pLKO.1-STAT1-1(Forwards:5′-GATCCGCAGGTTCACCAGCTTTATGATTCAAGAG-ATCATAAAGCTGGTGAACCTGCTTTT-TTG-3′,Reverses:5′-AATTCAAAAAAGCAGGTTCA-CCAGCTTTATGATCTCTTGAATCATAAAGC-TGGTGAACCTGCG-3′),pLKO.1-STAT1-2(Forwards:5′-GATCCGCTGAATGTCACTGAACTT-ACTTCAAGAGAGTAAGTTCAGTGACATTCA-GCTTTTTTG-3′,Reverses:5′-AATTCAAAAAA-GCTGAATGTCACTGAACTTACTCTCTTGAA-GTAAGTTCAGTGACATTCAGCG-3′)。用T4 DNA連接酶將載體pLKO.1和shRNA過夜連接,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞后挑取單菌落進行測序鑒定,將鑒定正確的菌落搖菌后提取質(zhì)粒轉染H1299細胞,使用Western blot鑒定表達。用重組病毒IBV-3ab-luc分別感染正常H1299細胞和干擾質(zhì)粒轉染后的H1299細胞后用黃芩苷處理,分析STAT1沉默對黃芩苷抗病毒作用的影響。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量,ImageJ軟件計算蛋白灰度值,GraphPadPrism8.0軟件繪圖,SPSS13.0軟件進行單因素方差分析,組間差異采用t檢驗,結果用“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 不同濃度的黃芩苷對H1299細胞活性的影響

黃芩苷按濃度500、250、125、62.5、31.3 μg·mL-1加入H1299細胞培養(yǎng)體系中,MTT法檢測不同濃度黃芩苷對細胞活性的影響。結果顯示,黃芩苷在31.3、62.5和125 μg·mL-1濃度下對細胞活性無明顯影響,細胞活性均在90%以上,而250和500 μg·mL-1濃度對H1299細胞活性具有顯著影響(圖1)。因此,選擇濃度為125 μg·mL-1的黃芩苷用于后續(xù)研究。

2.2 黃芩苷抑制IBV在Vero細胞及H1299細胞中的復制

本研究主要利用重組病毒IBV-3ab-luc研究黃芩苷對IBV的抑制作用及作用機制。采用細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)、噬斑分析、病毒熒光值測定分析黃芩苷對IBV復制的影響。結果顯示,IBV感染H1299細胞24 h后觀察到明顯的合胞體細胞,即由病毒復制而產(chǎn)生的CPE。當分別在病毒感染前或感染后經(jīng)黃芩苷處理后由病毒感染形成的CPE明顯減輕(圖2A)。病毒熒光值檢測顯示,感染前加藥組及感染后加藥組所測得的病毒熒光值均極顯著低于IBV組(P<0.01)(圖2B)。進一步,將上述各試驗組收集的病毒原液連續(xù)稀釋后接種于Vero細胞上,觀察噬斑形態(tài)并定量病毒滴度。與IBV組相比,黃芩苷處理后病毒噬斑數(shù)量、大小和病毒滴度均極顯著降低(P<0.01)(圖2C)。上述結果表明,黃芩苷在體外對IBV的復制具有明顯的抑制作用。

圖1 不同濃度的黃芩苷對H1299細胞活性影響Fig.1 Effects of different concentrations of baicalin on the viability of H1299 cells

A.不同試驗組IBV感染后H1299細胞的形態(tài)學變化。箭頭表示CPE;B.不同試驗組病毒熒光值檢測;C.不同試驗組IBV感染Vero細胞后病毒噬斑形成和滴度測定。與IBV組相比,**. P<0.01A. Morphological changes of IBV-infected H1299 cells in different experimental groups. Arrows represent CPE;B. Detection of virus fluorescence value in different experimental groups;C. Virus plaque formation and titer determination of IBV-infected Vero cells in different experimental groups. Compared with IBV group,**. P<0.01圖2 黃芩苷抑制IBV在Vero細胞及H1299細胞中的復制Fig.2 Baicalin inhibits IBV replication in Vero cells and H1299 cells

2.3 黃芩苷對IBV的抑制作用呈濃度依賴性

將黃芩苷倍比稀釋成不同濃度后處理IBV感染的H1299細胞,24 h 后檢測各組病毒熒光值,分析病毒復制情況。結果顯示,黃芩苷濃度越高,病毒熒光值越低,說明黃芩苷對IBV的抑制呈濃度依賴性(圖3)。

2.4 黃芩苷上調(diào)IBV感染細胞中IRF3誘導的IFN-β表達

利用qRT-PCR和Western blot方法檢測干擾素相關基因IRF3、p-IRF3和IFN-β的轉錄和表達。PCR結果顯示,IBV感染會降低宿主細胞IFN-β的mRNA表達水平(P<0.05),用黃芩苷處理后,IRF3和IFN-β的mRNA表達水平均顯著增加(P<0.05)(圖4A)。Western blot結果顯示,與正常對照組相比,IBV組p-IRF3和IFN-β的蛋白表達水平極顯著降低(P<0.01),用黃芩苷處理后,病毒感染前加藥組IRF3(P<0.05)、p-IRF3(P<0.01)和IFN-β(P<0.05)的蛋白表達水平均顯著增加,病毒感染后加藥組p-IRF3和IFN-β的蛋白表達水平也極顯著增加(P<0.01)(圖4B)。這些結果表明黃芩苷可通過IRF3途徑促進宿主細胞內(nèi)IFN-β的表達。

圖3 不同濃度的黃芩苷對IBV抑制作用Fig.3 Inhibiting effect of IBV by baicalin with different concentration

A. qRT-PCR檢測IBV感染細胞中IRF3、IFN-β mRNA表達;B. Western blot檢測IBV感染細胞中IRF3、p-IRF3和IFN-β 蛋白表達。IBV組與正常對照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;黃芩苷組與IBV組相比,*. P<0.05,**. P<0.01A. The mRNA expressions of IRF3 and IFN-β were detected by qRT-PCR in IBV-infected cells;B. The protein expressions of IRF3, p-IRF3 and IFN-β were detected by Western blot in IBV-infected cells. When IBV group compared with normal control group,#.P<0.05,##.P<0.01; When baicalin and ribavirin groups compared with IBV group, *. P<0.05,**. P<0.01圖4 黃芩苷上調(diào)IBV感染細胞中IRF3誘導的IFN-β表達Fig.4 Baicalin promotes IRF3-mediated IFN-β production in IBV-infected cells

2.5 黃芩苷增加了IBV對IFN治療的敏感性

用重組人IFN-α處理黃芩苷組和IBV組病毒感染的細胞后,以間接免疫熒光檢測IBV N的蛋白表達水平,分析病毒的復制情況。結果顯示,在未經(jīng)黃芩苷處理的IBV感染細胞中加入IFN-α對病毒的復制影響較小,而黃芩苷處理后再加入IFN-α,病毒復制明顯減弱(圖5)。因此,黃芩苷可以增加IBV對IFN治療的敏感性。

圖5 黃芩苷增加了IBV對干擾素治療的敏感性Fig.5 Baicalin increases the sensitivity of IBV to interferon therapy

2.6 黃芩苷促進IBV感染細胞中STAT1的磷酸化和p-STAT1核移位

Western blot檢測STAT1及p-STAT1的蛋白表達水平,結果顯示,STAT1總蛋白的表達在各組間差異無顯著性,而p-STAT1的表達在各組間差異具有顯著性。與正常組相比,IBV組p-STAT1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),用黃芩苷處理后,在感染前加藥組及感染后加藥組p-STAT1表達水平顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)增加(圖6A)。進一步,間接免疫熒光分析顯示,黃芩苷處理能顯著增加p-STAT1的核移位(P<0.01)(圖6B)。因此,黃芩苷可以促進STAT1的磷酸化和p-STAT1核移位。

2.7 黃芩苷負調(diào)控IBV感染細胞中SOCS3和IL-6的表達

SOCS3是JAK-STAT信號通路的負調(diào)控因子,IL-6是SOCS3的刺激因子。Western blot檢測SOCS3和IL-6的蛋白表達情況。結果顯示,與正常組相比,IBV組SOCS3和IL-6表達水平極顯著增加(P<0.01)。用黃芩苷處理后,感染前加藥組及感染后加藥組SOCS3和IL-6表達水平均極顯著降低(P<0.01)(圖7)。因此,黃芩苷能負調(diào)控SOCS3和IL-6的表達,從而拮抗SOCS3對干擾素通路的抑制作用。

2.8 STAT1沉默減弱了黃芩苷對IBV的抑制作用

用真核表達質(zhì)粒pLKO.1-STAT1轉染H1299細胞對STAT1進行敲低,分析敲低STAT1對黃芩苷抗病毒作用的影響。結果顯示,敲低STAT1后再用黃芩苷處理病毒感染的細胞,與敲低前相比病毒的復制能力明顯增加,說明敲低STAT1會減弱黃芩苷的抗病毒藥理活性,從而促進病毒復制(圖8)。

3 討 論

IB、禽流感、新城疫等由病毒感染引起的呼吸道疾病給世界范圍內(nèi)的家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前,疫苗接種是預防IBV感染和控制IB最有效的策略。然而,一些商業(yè)疫苗對異種血清型IBV毒株提供的保護作用有限[20],因此,IB的防治仍然是一個挑戰(zhàn),有必要開發(fā)一些新的有效的抗病毒策略或藥物來對抗IBV感染。中醫(yī)藥在病毒病防治方面受到了許多研究者的關注,一些有效的中藥產(chǎn)品已被用于預防或治療病毒性疾病。如蛇肝地龍顆粒聯(lián)合強力霉素可預防IBV感染[21];植物精油通過抑制病毒增殖和調(diào)控宿主免疫功能在肉雞中發(fā)揮抗IBV作用[22]。黃芩苷是從黃芩根中分離出的黃酮類化合物,黃酮類化合物可通過抑制病毒感染周期的不同階段發(fā)揮直接的抗病毒作用,也可通過調(diào)節(jié)宿主與病毒之間的相互作用產(chǎn)生間接抗病毒作用[23]。本研究對黃芩苷在Vero細胞和H1299細胞中對IBV的抗病毒活性進行了評價,結果顯示黃芩苷在體外對IBV的復制具有顯著的劑量依賴性抑制作用,這表明黃芩苷可能是一種潛在的用于家禽業(yè)防治IBV感染的藥物。

A. Western blot檢測IBV感染細胞中STAT1和p-STAT1蛋白表達;B.間接免疫熒光分析IBV感染細胞中p-STAT1的核表達。IBV組與正常對照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;黃芩苷組與IBV組相比,*. P<0.05,**. P<0.01A. The protein expressions of STAT and p-STAT1 were detected by Western blot in IBV-infected cells;B. Immunofluorescence detection of p-STAT1 nuclear expression in IBV-infected cells. When IBV group compared with normal control group, #.P<0.05,##.P<0.01; When baicalin and ribavirin groups compared with IBV group, *. P<0.05,**. P<0.01圖6 黃芩苷促進IBV感染細胞中STAT1的磷酸化和p-STAT1核移位Fig.6 Baicalin promotes STAT1 phosphorylation and nuclear translocation of p-STAT1 in IBV-infected cells

IBV組與正常對照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;黃芩苷組與IBV組相比,*. P<0.05,**. P<0.01 When IBV group compared with normal control group, #.P<0.05,##.P<0.01; When baicalin and ribavirin groups compared with IBV group, *. P<0.05,**. P<0.01圖7 Western blot檢測IBV感染細胞中SOCS3和IL-6蛋白的表達Fig.7 The protein expressions of SOCS3 and IL-6 were detected by Western blot in IBV-infected cells

IBV Beaudette株最初只適應雞胚,后經(jīng)多次連續(xù)傳代適應了雞原代腎細胞 (chicken kidney cell,CKC)和Vero細胞,進而Vero細胞適應株IBV經(jīng)傳代也可感染人類細胞系H1299和Huh[24]。在感染宿主細胞的過程中,IBV編碼4種結構蛋白(S、E、M和N)和15種非結構蛋白(nonstructural protein,nsp)參與病毒復制、吸附、入侵和釋放[25]。吸附是病毒感染細胞的第一步,RNA病毒借助S蛋白與宿主細胞受體結合進入宿主細胞,隨后,在S蛋白介導下病毒-細胞和細胞-細胞融合形成合胞體細胞,即CPE,CPE形成是病毒進入宿主細胞并向鄰近細胞傳播感染的必要條件[26]。在本研究中,IBV感染Vero細胞和H1299細胞后觀察到明顯的CPE形成,隨著感染時間的延長,CPE逐漸蔓延至幾乎整個單層細胞。在黃芩苷處理后,IBV感染細胞中CPE的形成顯著降低,與此同時,病毒噬斑數(shù)量也減少。這提示,黃芩苷可抑制IBV感染后S蛋白介導的合胞體細胞的形成,阻止病毒向鄰近細胞的傳播,抑制IBV在細胞內(nèi)的復制。有報道顯示,黃酮類化合物可通過競爭性抑制S蛋白與宿主細胞受體結合從而阻止病毒吸附進入宿主細胞[27-28]。本研究中,黃芩苷在IBV感染前預處理對病毒復制也起到抑制作用,該抑制作用是否與阻止病毒吸附進入宿主細胞有關有待進一步研究。

干擾素作為主要的抗病毒分子,在宿主被病毒感染的靶細胞和器官中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,限制病毒的傳播。然而,冠狀病毒已經(jīng)進化出多種策略拮抗宿主的先天免疫反應,為病毒復制創(chuàng)造有利的環(huán)境。SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和IBV的結構蛋白(M和N)、非結構蛋白(nsp1和nsp3)以及輔助蛋白均可以作為IFN拮抗劑,抑制宿主天然免疫反應[29-31]。此外,IBV可通過抑制STAT1的磷酸化和核移位阻斷干擾素下游信號通路,促進病毒復制[32]。因此,研究病毒與宿主之間的互作并尋找有效的干預措施對冠狀病毒相關疾病的防治也至關重要。本研究在對黃芩苷抗病毒的作用機制中發(fā)現(xiàn)黃芩苷處理上調(diào)了宿主細胞IFN-β的表達,增加了IBV對干擾素治療的敏感性,提示黃芩苷對IBV的抑制作用與干擾素通路的調(diào)控有關。隨后對干擾素下游的STAT信號通路的研究發(fā)現(xiàn),干擾素介導的STAT1磷酸化在黃芩苷處理組的感染細胞中顯著增加。磷酸化是干擾素誘導STAT1核移位的關鍵步驟,只有p-STAT1才能與STAT2和IRF9結合形成干擾素刺激基因因子3 (interferon stimulator gene factor 3,ISGF3),ISGF3轉位進入細胞核后,結合到ISG啟動子調(diào)控區(qū)的干擾素刺激應答元件上,啟動ISG的轉錄[33],發(fā)揮抗病毒效應。作者的研究也證實了黃芩苷處理后p-STAT1核移位增加。因此,黃芩苷影響IBV對干擾素治療的敏感性與其促進STAT1磷酸化和p-STAT1核移位有關。利用RNA干擾技術對STAT1進行沉默后發(fā)現(xiàn),STAT1沉默減弱了黃芩苷對IBV的抑制作用,這進一步說明,黃芩苷對IBV的抑制作用與STAT1通路的調(diào)控有關。綜上所述,黃芩苷可通過誘導干擾素產(chǎn)生并進一步激活干擾素下游的信號通路而發(fā)揮抗病毒作用(圖9)。

細胞因子信號轉導抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)是SOCS家族的重要分子之一,可以通過負反饋調(diào)控機制抑制JAK-STAT信號通路,在病毒免疫逃避中發(fā)揮重要作用[34]。SOCS3的表達受多種炎癥因子的調(diào)控,其中IL-6是主要因子之一,IL-6可通過激活STAT3誘導SOCS1和SOCS3基因表達[35]。在本研究中,黃芩苷處理顯著下調(diào)了宿主細胞SOCS3和 IL-6蛋白表達水平,這說明,黃芩苷不僅能正向調(diào)控干擾素信號通路,同時也能負調(diào)控干擾素信號通路的抑制因子,通過不同途徑促進宿主天然免疫反應,抑制IBV復制(圖9)。

圖9 黃芩苷抗IBV作用的分子機制Fig.9 The molecular mechanism for the anti-IBV properties of baicalin

4 結 論

黃芩苷可通過誘導宿主細胞Ⅰ型干擾素產(chǎn)生、激活干擾素下游信號通路而抑制IBV復制,減輕病毒感染對細胞造成的免疫損傷。該研究為尋找抗IBV的天然藥物提供了新的思路。