牛乳來(lái)源外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化調(diào)控作用的研究

郭心雨,王昊天,張雪梅,王小龍,李和平,楊彥賓,鐘 凱*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046; 2.河南省銀豐生物工程技術(shù)有限公司,鄭州 450000)

奶牛乳腺炎(bovine mastitis)是由多種細(xì)菌引起的乳房?jī)?nèi)感染,被列為奶牛的四大疾病之一,也是影響牛奶高產(chǎn)的最大問(wèn)題之一[1]。目前關(guān)于奶牛乳腺炎已經(jīng)有了大量的臨床研究,但尚未取得很好的實(shí)際治療效果。病原微生物大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)及其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激是誘發(fā)乳腺炎的主要原因之一[2]。乳腺炎患牛最直接的影響是引起乳汁中的體細(xì)胞增加,奶牛乳腺感染病原微生物時(shí),乳腺的免疫防御機(jī)制被激活,大量的白細(xì)胞透過(guò)乳腺和毛細(xì)血管進(jìn)入乳汁,另外,因微生物感染和損傷脫落的乳腺細(xì)胞也進(jìn)入到乳汁中,引起了乳汁中體細(xì)胞數(shù)量急劇增加[3],因此乳腺炎檢測(cè)中最常用的指標(biāo)是牛乳中的體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count, SCC)檢測(cè)法[4]。根據(jù)美國(guó)乳房炎協(xié)會(huì)(National Mastitis Council,NMC)規(guī)定,SCC超過(guò)2.0×105·mL-1的奶牛即使沒(méi)有其他臨床癥狀,也被認(rèn)為患有亞臨床型乳房炎[5]。

機(jī)體發(fā)生各種炎癥反應(yīng)的根本環(huán)節(jié)是巨噬細(xì)胞的激活與損傷,奶牛乳腺炎微環(huán)境細(xì)胞中巨噬細(xì)胞起主要作用,巨噬細(xì)胞的極化參與其進(jìn)展,同時(shí)又受其調(diào)控[6]。巨噬細(xì)胞在不同條件刺激下可極化為促炎M1型或抗炎M2型,M1型巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng),促進(jìn)機(jī)體釋放一氧化氮(nitric oxide,NO)和分泌促炎因子以發(fā)揮殺傷作用,LPS、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型分化,以高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及共刺激分子CD86等為特征,M2型巨噬細(xì)胞可以激活Th2型免疫反應(yīng),活化后以分泌白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、精氨酸酶-2(arginase-2,Arg-2)和甘露糖受體(CD206)等為特征,可以促進(jìn)纖維變性、組織重塑修復(fù)和腫瘤發(fā)生,具有免疫抑制作用,巨噬細(xì)胞極化的平衡對(duì)炎癥的發(fā)生、發(fā)展和維持體內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著重要作用[7]。外泌體(exosomes, Exo)是細(xì)胞分泌的一種活性囊泡[8],在正?；虿±?xiàng)l件下,可以攜帶多種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA和非編碼RNA,介導(dǎo)細(xì)胞、組織與器官之間的信息交流。Exo中的mRNA和miRNA在受到病理生理刺激和疾病影響后會(huì)發(fā)生改變,進(jìn)而把這種信息傳遞給受體細(xì)胞,引起受體細(xì)胞功能的改變[9]。通過(guò)Exo介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化影響炎癥反應(yīng)的研究也與日俱增,2017年,Lo Sicco等[10]的研究證明,脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞釋放具有強(qiáng)大的抗炎能力的Exo,促巨噬細(xì)胞M2極化;并且既往的研究發(fā)現(xiàn),牛奶Exo的成分可因乳腺感染而發(fā)生改變[11],然而,奶牛乳腺炎牛乳來(lái)源的Exo影響巨噬細(xì)胞表型和功能的研究極少,因此本研究通過(guò)探究牛乳來(lái)源Exo對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響,旨在探討牛乳來(lái)源Exo是否具有影響巨噬細(xì)胞極化的能力,為進(jìn)一步研究奶牛乳腺炎感染免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與乳樣采集

經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物使用與護(hù)理委員會(huì)批準(zhǔn),從河南興豫源牧場(chǎng)以及河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園區(qū)牛場(chǎng)共選取10頭泌乳前中期、年齡3～4歲、胎次2～3胎的荷斯坦奶牛用于本試驗(yàn)研究。其中4頭為無(wú)奶牛乳腺炎臨床癥狀的健康奶牛,6頭為有乳房發(fā)紅,腫脹或疼痛等乳腺炎臨床癥狀的奶牛。采樣前先用高錳酸鉀溶液清洗奶牛乳房、乳頭,然后用75%酒精對(duì)乳頭進(jìn)行消毒。每個(gè)乳區(qū)擠去頭2～3把奶然后無(wú)菌操作進(jìn)行采樣,采集乳樣400 mL·頭-1,部分樣品送至河南省奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定中心及實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定和細(xì)菌學(xué)鑒定,剩余樣品用于超速離心提取Exo。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

本試驗(yàn)所用的小鼠巨噬細(xì)胞(Raw264.7)購(gòu)自北京BNCC公司;大腸桿菌來(lái)源LPS、蛋白酶抑制劑(PMSF)、青-鏈霉素雙抗混合液均購(gòu)自上海碧云天生物有限公司;鼠抗人(CD63、TSG101、β-actin)一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-EDTA、無(wú)血清細(xì)胞凍存液、DMEM培養(yǎng)基、D-PBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;PVDF膜、Millipore Western blot化學(xué)發(fā)光HRP底物ECL發(fā)光液購(gòu)自德國(guó)Millipore公司;引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.3 牛乳樣品細(xì)菌培養(yǎng)鑒定

每份樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)立即取100 μL均勻涂布在麥康凱培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上,倒置在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,根據(jù)平板上菌落形態(tài),挑取不同單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),對(duì)純化后培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。

另以1∶100的比例取適量牛乳樣品用LB或BHI肉湯增菌培養(yǎng)。

1.4 DNA提取

用Easy Pure Genomic DNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取篩選到的菌株的基因組DNA,具體步驟如下:①向菌體沉淀中加入100 μL Lys,37 ℃水浴2 h;②水浴后向菌體沉淀中加入100 μL LB2和20 μL Proteinasek,震蕩至菌體徹底懸浮,55 ℃孵育15 min;③加入500 μL BB2,立即渦旋5 s,室溫孵育10 min;④將全部菌液加入離心柱中,12 000 r·min-1離心30 s,棄去廢液;⑤加入500 μL CB2,12 000 r·min-1離心30 s,棄去廢液;⑥重復(fù)⑤一次;⑦加入500 μL加入無(wú)水乙醇的WB2,12 000 r·min-1離心30 s,棄去廢液;⑧重復(fù)⑦一次,開(kāi)蓋晾干無(wú)水乙醇;⑨將離心柱置于一干凈的EP管中,在離心柱的中央加入200 μL EB,室溫靜置1 min,12 000 r·min-1離心1 min,洗脫DNA;⑩-20 ℃保存,做好標(biāo)記。

1.5 PCR擴(kuò)增

使用細(xì)菌16S rDNA序列的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,正向引物)和1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′,反向引物)以基因組DNA為模板,擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因片段,PCR反應(yīng)體系20 μL:DNA 1 μL,Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,12 ℃ 1 min。擴(kuò)增樣品送華大基因科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的在線序列比對(duì)軟件BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 超速離心純化提取Exo

取40 mL乳樣置于50 mL無(wú)菌離心管中,300×g,4 ℃離心10 min,收集上層乳清;4 ℃下2 000×g離心10 min,收集上層乳樣;加鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.6,4 ℃靜置2 h,10 000×g,4 ℃離心30 min,收集上清;重復(fù)上一步驟兩次;0.22 μm濾頭過(guò)濾上清,110 000×g,4 ℃離心70 min,棄上清;加入少量PBS重懸,110 000×g,4 ℃離心70 min,棄去上清;用100 μL PBS重懸沉淀,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Exo透射電鏡(TEM)觀察

使用100 μL 2%多聚甲醛重懸Exo,滴5 μL Exo懸液至銅網(wǎng)上,室溫靜止20 min;PBS漂洗3次;1%戊二醛固定5 min;ddH2O漂洗10次;4%醋酸雙氧鈾負(fù)染5 min,室溫晾干后使用TECNAIG2上機(jī)觀察。

1.8 Exo納米顆粒跟蹤分析(NTA)

300 μL PBS重懸Exo后加入10 mL PBS進(jìn)行二次稀釋,將樣品緩慢打入樣品池,避免產(chǎn)生氣泡,推入主機(jī)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作儀器檢測(cè);選60 s錄制時(shí)間,進(jìn)行影像錄制;視頻分析完畢后,導(dǎo)出報(bào)告。

1.9 Exo熒光示蹤

預(yù)先在24孔板中加入合適直徑的細(xì)胞爬片,以3×104個(gè)細(xì)胞·孔-1密度將Raw264.7細(xì)胞接種在爬片上,每孔1 mL培養(yǎng)基。按照PKH67熒光標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光標(biāo)記Exo:將50 μL Exo稀釋在500 μL稀釋液中,混勻標(biāo)為管①;2 μL PKH67熒光染料中加入500 μL稀釋液,混勻標(biāo)為管②;將管①與管②混勻,37 ℃孵育5 min,加入1 mL含0.5% BSA的PBS終止標(biāo)記反應(yīng);120 000×g,4 ℃,離心60 min,用50 μL PBS重新富集熒光標(biāo)記好的Exo;將熒光標(biāo)記后的Exo以80 μg·mL-1終濃度加入接種Raw264.7細(xì)胞的24孔板中,共培養(yǎng)3 h;用200 μL PBS沖洗3次,加入20 μL 4%多聚甲醛固定20 min;PBS沖洗3次,加200 μL DAPI染色細(xì)胞核1 h,用PBS沖洗2次;滴一滴抗熒光淬滅劑在載玻片上,將有Raw264.7細(xì)胞的一面爬片覆蓋在載玻片上;使用電子熒光顯微鏡成像后,放4 ℃長(zhǎng)期保存。

1.10 細(xì)胞分組

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Raw264.7細(xì)胞,培養(yǎng)至第三代,以1×105·孔-1密度接種于6孔板中,細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),換用去除掉Exo FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),將細(xì)胞分對(duì)照(CT)組、LPS組、正常牛乳來(lái)源Exo(N-Exo)組、低體細(xì)胞數(shù)牛乳來(lái)源Exo(L-Exo)組、高體細(xì)胞數(shù)牛乳來(lái)源Exo(H-Exo)組:CT組不做任何處理為陰性對(duì)照;LPS組使用100 ng·mL-1大腸桿菌來(lái)源LPS處理Raw264.7細(xì)胞24 h,構(gòu)建體外炎癥模型做陽(yáng)性對(duì)照;N-Exo、L-Exo、H-Exo組分別使用健康牛乳樣本(Con)、低體細(xì)胞數(shù)乳腺炎牛乳樣本(Low SCC);高體細(xì)胞數(shù)乳腺炎牛乳樣本(High SCC)來(lái)源Exo以100 μg·mL-1濃度處理Raw264.7細(xì)胞24 h,每組6個(gè)重復(fù)。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)

用Trizol試劑反復(fù)吹打各處理組Raw264.7細(xì)胞提取總RNA,隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA,根據(jù)NCBI GenBank中白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、精氨酸酶(Arg)-1、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子(TGF)-β和IL-10核苷酸登錄號(hào)查詢(xún)到的序列,用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10 μL:cDNA 1.5 μL,SYBR Mix 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,ddH2O 2.7 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,4 ℃ 1 min,以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.12 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)

收集各組細(xì)胞上清液,利用ELISA試劑盒檢測(cè)各組TNF-α、IL-6、一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、IL-10、TGF-β以及甘露糖受體(CD206)表達(dá)水平,具體操作參照制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在450 nm處的吸光值。

1.13 BCA法蛋白定量檢測(cè)

將牛血清白蛋白(2 g·L-1)梯度稀釋成0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g·L-1,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線;將待測(cè)蛋白樣本進(jìn)行稀釋,使其濃度處于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi);將試劑盒中的Solution A和Solution B按體積為50∶1混合,配制BCA工作液;分別將2 μL各稀釋濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣本依次加入至96孔板中;按照蛋白質(zhì)溶液與工作液比例為1∶20,加入40 μL BCA工作液。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;將加好液體的孔板37℃孵育30 min;酶標(biāo)儀于595 nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算Exo的蛋白含量。

1）數(shù)據(jù)分類(lèi)。數(shù)據(jù)分類(lèi)主要將檔案實(shí)體數(shù)據(jù)按照數(shù)據(jù)類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)，不同類(lèi)型的數(shù)據(jù)需要通過(guò)不同的特征提取技術(shù)進(jìn)行特征提取。在實(shí)際應(yīng)用中，檔案數(shù)據(jù)都是經(jīng)過(guò)著錄整理過(guò)的有序數(shù)據(jù)，一般已經(jīng)歸檔的檔案數(shù)據(jù)均包含數(shù)據(jù)類(lèi)別信息。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.14 蛋白免疫印跡(WB)檢測(cè)

用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定Exo濃度,加5×SDS上樣緩沖液,99 ℃金屬浴中加熱10 min;上樣進(jìn)行10% SDS-PAGE;轉(zhuǎn)膜后室溫下用5% BSA封閉2 h,清洗后依次孵育一抗以及二抗,最后加入ECL試劑顯影后觀察結(jié)果。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 牛乳體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)

牛奶記錄系統(tǒng)(dairy herd improvement, DHI)檢測(cè)結(jié)果顯示,4份乳樣SCC<2.0×105·mL-1,判定為健康牛乳樣本組(Con,n=4);3份乳樣SCC為2.0×105～2.0×106·mL-1,判定為低體細(xì)胞數(shù)乳腺炎牛乳樣本組(Low SCC,n=3);3份乳樣SCC>2.0×106·mL-1,判定為高體細(xì)胞數(shù)乳腺炎牛乳樣本組(High SCC,n=3),如表2所示。

表2 乳樣DHI檢測(cè)結(jié)果Table 2 DHI test results of milk samples

2.2 奶牛乳腺炎感染細(xì)菌鑒定

2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 在6份SCC>2.0×105·mL-1的牛乳樣本中,有4份在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落,將此4份樣本標(biāo)記為L(zhǎng)21946、L10133、L14891、H24095。革蘭染色后,在光鏡下觀察到細(xì)菌呈紅色桿狀,可初步判定為革蘭陰性桿菌(圖1)。

2.2.2 16S rDNA目的基因擴(kuò)增 對(duì)提取的4個(gè)細(xì)菌樣品進(jìn)行16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增。從PCR的擴(kuò)增結(jié)果可見(jiàn),4個(gè)細(xì)菌樣品16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)清晰完整的條帶,而且這些樣品16S rDNA序列的PCR產(chǎn)物處于同一位置,大小約為1 500 bp(圖2)。

A～D. L21946、L10133、L14891、H24095樣本革蘭染色鏡檢結(jié)果 A-D. Microscopic examination after Gram staining of L21946, L10133, L14891 and H24095 samples圖1 牛乳樣本的細(xì)菌光鏡照片(400×)Fig.1 Microscopic observation of the bacteria of the milk sample(400×)

2.2.3 16S rDNA序列測(cè)定 基于分子生物學(xué)技術(shù),將分離株測(cè)序得到的16S rDNA基因序列提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)查找其同源序列,結(jié)果顯示L21946和L10133兩個(gè)細(xì)菌樣本與大腸桿菌(E.coil)的相似性最高,基因序列具有99.8%和99.9%的相似性;L14891細(xì)菌樣本與數(shù)據(jù)庫(kù)上的綠膿桿菌(P.aeruginosa)16S rDNA基因序列具有100%的相似性;H24095細(xì)菌樣本與數(shù)據(jù)庫(kù)上的克雷伯肺炎桿菌(K.pneumoniae)的相似性最高,16S rDNA基因序列具有99.8%的相似性,由此確定L21946和L10133兩個(gè)細(xì)菌樣本的鑒定結(jié)果為E.coil;L14891細(xì)菌樣本的鑒定結(jié)果為P.aeruginosa;H24095細(xì)菌樣本的鑒定結(jié)果為K.pneumoniae,均為革蘭陰性菌(表3)。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～5. L21946、L10133、L14891、H24095、陰性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果 M. DL2000 DNA marker; 1-5. PCR amplification result of sample L21946,L10133,L14891,H24095, and negative control圖2 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplication of 16S rDNA

表3 細(xì)菌標(biāo)本 16S rDNA序列測(cè)定的比對(duì)結(jié)果Table 3 The BLAST of 16S rDNA sequences of the bacterial specimens

2.3 牛乳來(lái)源Exo鑒定

2.3.1 透射電鏡(TEM)觀察 TEM觀察結(jié)果顯示,正常牛乳(Normal)、低體細(xì)胞數(shù)乳腺炎牛乳(Low SCC)和高體細(xì)胞數(shù)乳腺炎乳牛(High SCC)來(lái)源的Exo均呈圓形或橢圓形、具有雙層膜結(jié)構(gòu),中間凹陷、邊緣清晰、呈典型的“杯盤(pán)”狀形態(tài)(圖3)。

2.3.3 BCA檢測(cè) 使用BCA試劑盒檢測(cè)所有樣本Exo蛋白濃度,結(jié)果如圖5所示,健康、低以及高體細(xì)胞數(shù)牛乳來(lái)源Exo蛋白濃度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3.4 Western blot檢測(cè) Western blot結(jié)果如圖6所示,N-Exo、L-Exo和H-Exo均能特異性表達(dá)CD63和TSG101蛋白。

圖3 牛乳來(lái)源Exo透射電鏡鑒定結(jié)果Fig.3 Transmission electron microscopy identification results of bovine milk-derived exosomes

圖6 牛乳Exo Western blot鑒定結(jié)果Fig.6 Western blot identification results of bovine milk-derived exosomes

2.4 Exo被巨噬細(xì)胞內(nèi)化

熒光共聚焦顯微鏡拍攝圖片顯示(圖7),N-Exo與Raw264.7細(xì)胞共培養(yǎng),3 h時(shí)N-Exo還有少量未被Raw264.7細(xì)胞所內(nèi)化,而6 h時(shí)N-Exo被Raw264.7細(xì)胞內(nèi)化完全,細(xì)胞內(nèi)化Exo呈時(shí)間依賴(lài)性,因此采用6 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究,結(jié)果顯示N-Exo、L-Exo和H-Exo均能被Raw264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)化,無(wú)顯著差異(圖8)。

2.5 Exo通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化影響奶牛乳腺炎癥反應(yīng)

圖7 共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)N-Exo被巨噬細(xì)胞攝取效果(400×)Fig.7 Uptake effect of N-Exo by macrophages at different time points of co-culture (400×)

A. 炎性因子(IL-1β、TNF-α、IL-6) mRNA表達(dá)水平;B. 抗炎因子(Arg-1、TGF-β、IL-10) mRNA表達(dá)水平;*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001A. mRNA expression levels of Inflammatory factors (IL-1β, TNF-α, IL-6); B. mRNA expression levels of Anti-inflammatory factors (Arg-1, TGF-β, IL-10); *. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001圖9 牛乳Exo作用巨噬細(xì)胞后在基因水平對(duì)不同細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.9 Effects of milk-derived exosomes on the expression of different cytokines at the gene level after acting on macrophages

2.5.1 牛乳來(lái)源Exo對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響 RT-PCR檢測(cè)牛乳來(lái)源Exo作用于巨噬細(xì)胞后相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖9A、B。與CT組相比,L-Exo處理組使Raw264.7細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNF-α的mRNA水平升高極顯著(P<0.001),IL-1β高水平表達(dá)(P<0.01),IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),而抗炎性細(xì)胞因子Arg-1和IL-10 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05),TGF-β表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01);H-Exo處理組使Raw264.7細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)均極顯著升高(P<0.001),抗炎性細(xì)胞因子TGF-β和Arg-1的表達(dá)極顯著降低(P<0.001),IL-10 mRNA水平也顯著降低(P<0.05),而N-Exo處理組的TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)水平未有明顯改變,但I(xiàn)L-1β mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),Arg-1和TGF-β mRNA的表達(dá)水平極顯著升高(P<0.001),IL-10 mRNA高水平表達(dá)(P<0.01)。

2.5.2 牛乳來(lái)源Exo對(duì)巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 ELISA檢測(cè)牛乳來(lái)源Exo作用于巨噬細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖10A、B。與CT組相比,L-Exo組使Raw264.7細(xì)胞的TNF-α和CD206蛋白表達(dá)水平升高極顯著(P<0.001),IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),iNOS的蛋白水平也有所升高(P<0.05),且TGF-β的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);H-Exo組使Raw264.7細(xì)胞的TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.001),IL-1β、CD206和iNOS的蛋白高水平表達(dá)(P<0.01),IL-10和TGF-β的蛋白表達(dá)受到極顯著抑制(P<0.001),而N-Exo組TNF-α和CD206蛋白表達(dá)受到極顯著抑制(P<0.001)、IL-6的蛋白水平也顯著降低(P<0.01),IL-1β、iNOS的表達(dá)水平呈明顯下降趨勢(shì)(P<0.05),TGF-β的蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01),IL-10表達(dá)有升高趨勢(shì)(P<0.05)。但M2型表面標(biāo)記蛋白CD206的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果與M1型各蛋白類(lèi)似,此外,H-Exo處理組的各蛋白表達(dá)水平與LPS處理組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

全球約三分之一的奶牛都受奶牛乳腺炎影響,該病已嚴(yán)重影響了全球畜牧產(chǎn)業(yè)以及乳制品行業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展[12]。根據(jù)乳樣中能否檢出病原菌以及乳樣是否有明顯變化,該病可分為非特異性臨床型乳腺炎、非特異性亞臨床型乳腺炎、感染性臨床型乳腺炎以及感染性亞臨床型乳腺炎,而乳腺炎檢測(cè)中最常用的指標(biāo)是牛乳中的SCC檢測(cè)法[4,13]。本研究于河南省兩個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集泌乳期、年齡、胎次均無(wú)顯著差異的荷斯坦奶牛共10份牛乳樣品,其中4份樣品來(lái)源于表觀健康奶牛,6份樣品采集自已出現(xiàn)乳腺炎臨床癥狀的奶牛,乳樣送至河南省奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定中心進(jìn)行SCC的檢測(cè),根據(jù)其SCC水平將牛乳樣品分為3組:正常乳樣組(SCC<2.0×105·mL-1)(n=4),低體細(xì)胞數(shù)乳腺炎組(2.0×1052.0×106·mL-1)(n=3)。但SCC計(jì)數(shù)法只能鑒定乳腺炎癥的發(fā)生,不能區(qū)分細(xì)菌感染類(lèi)型。本研究進(jìn)一步對(duì)乳樣進(jìn)行細(xì)菌鑒定,結(jié)果顯示,部分高體細(xì)胞數(shù)乳樣被檢測(cè)到細(xì)菌感染,所感染的細(xì)菌經(jīng)鑒定為E.coil、P.aeruginosa和K.pneumoniae,均為革蘭陰性菌。其余有兩份高體細(xì)胞數(shù)樣本未被檢測(cè)出感染致病菌,可能是屬于非特異性亞臨床型乳房炎病例(即在沒(méi)有檢測(cè)出細(xì)菌感染的情況下也有很高的SCC)[14]。上述結(jié)果表明,奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)革蘭陰性菌造成的奶牛乳腺炎相當(dāng)普遍,并且表觀正常的奶牛也可能已經(jīng)感染乳房炎,因此對(duì)其的防控措施還需加強(qiáng)。

最近越來(lái)越多的研究表明,可以通過(guò)檢測(cè)Exo內(nèi)含物反映其細(xì)胞起源和疾病狀態(tài),或通過(guò)其細(xì)胞間信息與物質(zhì)傳遞能力影響靶細(xì)胞生物功能,使Exo成為診斷和治療疾病的潛在生物標(biāo)志物[15]。牛乳來(lái)源的Exo可通過(guò)細(xì)胞間傳遞生物信息物質(zhì)參與胎兒的生理和免疫反應(yīng)[16]。因此本研究從不同牛乳樣本中超速離心純化得到的Exo并進(jìn)行鑒定,電鏡觀察到其形態(tài)為圓形或橢圓形,中間凹陷,具有“杯盤(pán)”狀和雙層膜結(jié)構(gòu),直徑均為30～150 nm,特異性表達(dá)Exo標(biāo)志蛋白CD63和TSG101,均符合Exo典型特征,并且BCA結(jié)果顯示正常、低和高體細(xì)胞數(shù)牛乳來(lái)源Exo濃度無(wú)顯著性差異,證明本試驗(yàn)采用超速離心法成功分離純化得到牛乳來(lái)源Exo,能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的需求,并且正常以及乳腺炎牛乳來(lái)源Exo的生物學(xué)特征無(wú)顯著性差異。

巨噬細(xì)胞極化的平衡對(duì)炎癥的發(fā)生、發(fā)展和維持體內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著重要作用[17]。部分研究表明,炎癥微環(huán)境中Exo與巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān),通過(guò)表型可鑒定巨噬細(xì)胞的類(lèi)型,研究巨噬細(xì)胞在不同生理和病理?xiàng)l件下所發(fā)揮的功能具有重要的意義[18]。Jiao等[19]研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞來(lái)源Exo誘導(dǎo)膿毒癥相關(guān)急性肺損傷中Rawa264.7巨噬細(xì)胞M1極化并啟動(dòng)巨噬細(xì)胞焦磷酸作用來(lái)促進(jìn)肺部炎癥。劉文濤等[20]研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Exo可以調(diào)控Raw264.7巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化,并且抑制M2型巨噬細(xì)胞活性。Hyv?rinen等[21]的研究也證明巨噬細(xì)胞來(lái)源的Exo通過(guò)抑制IL-23和IL-22的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗炎表型M2極化。但關(guān)于奶牛乳腺炎來(lái)源的Exo對(duì)于免疫細(xì)胞的影響鮮有報(bào)道,因此本研究通過(guò)富集純化奶牛乳腺炎以及正常牛乳來(lái)源的Exo與Raw264.7細(xì)胞共培養(yǎng),探究其對(duì)Raw264.7細(xì)胞極化的影響,為排除培養(yǎng)基中Exo對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾,本試驗(yàn)所使用的細(xì)胞培養(yǎng)基和小牛血清均進(jìn)行了去Exo處理。結(jié)果顯示,共培養(yǎng)6 h時(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)Exo的攝取量顯著高于3 h,因此選取6 h為后續(xù)共培養(yǎng)時(shí)間節(jié)點(diǎn);此外正常、低體細(xì)胞數(shù)牛乳以及高體細(xì)胞數(shù)牛乳來(lái)源Exo均能無(wú)差異地被巨噬細(xì)胞內(nèi)化,乳腺炎牛乳來(lái)源Exo能促使巨噬細(xì)胞向M1型極化,高表達(dá)促炎性細(xì)胞因子;而正常牛乳來(lái)源的Exo能促使巨噬細(xì)胞向M2型極化,表達(dá)高水平的抗炎性細(xì)胞因子。Admyre等[22]發(fā)現(xiàn)人乳中的Exo也具有免疫調(diào)節(jié)作用,支持本研究結(jié)果。上述結(jié)果提示病原感染導(dǎo)致的乳腺炎會(huì)使牛乳中Exo對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向產(chǎn)生影響,進(jìn)而改變免疫微環(huán)境,但其中的發(fā)生機(jī)制仍需深入研究,應(yīng)易恬等[23]的研究結(jié)果表明乳腺炎病原感染可引起宿主細(xì)胞所分泌的Exo成分發(fā)生改變;Reinhardt等[24]也證實(shí)乳腺感染可引起牛奶Exo蛋白組分發(fā)生改變;其他研究發(fā)現(xiàn),從經(jīng)LPS預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞中分離出的Exo可能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA let-7b從而對(duì)巨噬細(xì)胞極化和慢性炎癥的消退具有良好的調(diào)節(jié)能力[25]。此外本實(shí)驗(yàn)室之前研究發(fā)現(xiàn)乳腺炎奶牛牛乳來(lái)源的Exo中miR-223與miR-146a與正常牛乳Exo相比有顯著差異,因而,在本研究中觀察到的乳腺炎牛乳Exo對(duì)巨噬細(xì)胞極化產(chǎn)生的影響可能是由于病原微生物感染導(dǎo)致Exo內(nèi)容物變化而發(fā)揮作用,但對(duì)于炎癥相關(guān)Exo介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化具體作用機(jī)制以及信號(hào)通路的研究甚少,后續(xù)還需進(jìn)行深入探究。另需指出的是,目前牛源性的巨噬細(xì)胞分離純化較為困難,沒(méi)有商品化的細(xì)胞系,而小鼠巨噬細(xì)胞是研究細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象,鼠源Raw264.7細(xì)胞是研究炎癥最常見(jiàn)的體外模型之一,也是研究巨噬細(xì)胞極化的常用細(xì)胞系,因此本試驗(yàn)選取小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象。此外,通常認(rèn)為CD206是M2型巨噬細(xì)胞的特異性蛋白,但Jaguin等[26]觀察到CD206的表達(dá)在M1和M2巨噬細(xì)胞之間沒(méi)有差異,并提出M2型巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的是CD200R膜糖蛋白,而并非CD206。作者的研究結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論,ELISA結(jié)果顯示,炎性Exo和LPS作用于Raw264.7細(xì)胞后,CD206的表達(dá)反而上調(diào),而正常Exo作用Raw264.7細(xì)胞后,CD206的表達(dá)下降,與M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)情況一致。此外,雖然牛乳Exo主要來(lái)自乳腺上皮細(xì)胞(MECs),但病原微生物也可產(chǎn)生Exo[27],因而,在本研究中觀察到的乳腺炎牛乳Exo的生物學(xué)效應(yīng)可能是宿主和病原微生物產(chǎn)生的Exo的共同效應(yīng)。

綜上所述,本研究證實(shí)了乳腺炎牛乳來(lái)源的Exo通過(guò)細(xì)胞內(nèi)化作用與巨噬細(xì)胞進(jìn)行信息交流與物質(zhì)傳遞,使巨噬細(xì)胞極化為M1型,而健康狀態(tài)下的牛乳來(lái)源Exo可以顯著抑制巨噬細(xì)胞M1型蛋白的表達(dá),促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化,參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化平衡,對(duì)增強(qiáng)抗病原微生物入侵或抑制有害炎癥對(duì)機(jī)體產(chǎn)生進(jìn)一步損傷有重要意義,也能為奶牛乳腺炎開(kāi)發(fā)新的治療方法提供新思路。但Exo中何種物質(zhì)以及通過(guò)何種信號(hào)通路發(fā)揮作用,還需在此基礎(chǔ)上結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)及蛋白組學(xué)等方面的研究,但目前全球?qū)τ贓xo應(yīng)用于大動(dòng)物模型中的研究很少,一方面Exo還未能實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn),另一方面對(duì)于Exo應(yīng)用于治療大動(dòng)物疾病所用劑量還需進(jìn)一步摸索,Exo作為大動(dòng)物臨床治療手段還有很長(zhǎng)的路要走。

4 結(jié) 論

乳腺炎牛乳來(lái)源Exo可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化,正常牛乳來(lái)源Exo可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。