H1N1亞型流感病毒感染A549細(xì)胞的環(huán)狀RNA表達(dá)分析

蔣盛強(qiáng),胡 靖,陳紅英

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,楊凌 712100)

流感病毒能夠引起人類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和豬等多種宿主發(fā)生呼吸道疾病,每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在眾多流感病毒中,甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)是在全球范圍內(nèi)引發(fā)大規(guī)模疫情的主要毒株。IAV屬正黏病毒科,有包膜,基因組由8股單鏈負(fù)義RNA片段組成[2]。根據(jù)病毒表面蛋白的抗原性,IAV分為18種血凝素(HA)亞型(H1～H18)和11種神經(jīng)氨酸酶(NA)亞型(N1～N11)[3]。其中,H1N1 IAV是在人群中最廣泛傳播的病毒亞型之一,它在1918年和2009年先后造成了兩次大流行,對(duì)人類(lèi)健康造成了重大威脅[4-5]。

在IAV感染過(guò)程中,需要調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的狀態(tài),利用細(xì)胞的底物和合成系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行病毒的生物合成。病毒對(duì)細(xì)胞的感染還可以通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)依賴(lài)性信號(hào)通路激活宿主的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生干擾素(interferon, IFN)和其他細(xì)胞因子,激活干擾素刺激基因(IFN-stimulated gene, ISG)的表達(dá)[6-7]。先天免疫的激活能限制病毒復(fù)制并導(dǎo)致病毒清除;相應(yīng)的,IAV也會(huì)進(jìn)化出多種策略來(lái)拮抗宿主先天免疫反應(yīng),來(lái)實(shí)現(xiàn)病毒的自我復(fù)制[8-9]。了解宿主因子及其在IAV感染中的作用,對(duì)于全面揭示IAV的感染調(diào)控機(jī)制、控制該病毒感染引起的疾病具有重要的意義。已有的研究表明,流感病毒的感染可以改變大量的宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄水平。但是相關(guān)研究大部分都集中在蛋白質(zhì)編碼基因上,只有少量報(bào)道涉及了長(zhǎng)鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA等非編碼RNA在流感病毒感染中的作用[10-12]。環(huán)狀RNA具有共價(jià)閉合的單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu),沒(méi)有5′ 和3′末端,因此對(duì)外切核糖核酸酶的降解具有較強(qiáng)的抵抗力,比線性RNA更穩(wěn)定[13]。已有研究證明環(huán)狀RNA在病毒感染中能夠影響病毒復(fù)制,因此越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注環(huán)狀RNA在病毒感染中的作用[14-15]。盡管病毒感染對(duì)環(huán)狀RNA表達(dá)的影響尚不清楚,但考慮到環(huán)狀RNA的高度穩(wěn)定性以及其在抗病毒免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用,環(huán)狀RNA也被認(rèn)為是診斷和治療病毒性疾病的潛在靶標(biāo)[16-17]。近年來(lái),有研究在流感病毒感染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)的環(huán)狀RNA。例如,在H7N9流感病毒感染的小鼠肺部鑒定出數(shù)千個(gè)環(huán)狀RNA的表達(dá),其中186個(gè)在感染PB2突變病毒時(shí)差異表達(dá)[18];另一項(xiàng)研究在H3N2和H5N1流感病毒感染的MDCK細(xì)胞中分別發(fā)現(xiàn)了262和189個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA[19];最近的一項(xiàng)研究在H9N2流感病毒感染的A549細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了411種差異表達(dá)的環(huán)狀RNA,其中一種新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA AIVR被鑒定為一種抗病毒因子,它可以通過(guò)吸收miRNA來(lái)增強(qiáng)CREBBP的表達(dá),以此促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生[20]。此外,研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA GATAD2A可以通過(guò)抑制自噬來(lái)促進(jìn)H1N1復(fù)制,circ-0050463可以作為miR-33b-5p的海綿來(lái)上調(diào)真核翻譯延伸因子1A1的表達(dá),從而促進(jìn)IAV復(fù)制[21-22]。這些研究結(jié)果表明,環(huán)狀RNA在IAV的病毒感染中可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究中,作者通過(guò)RNAseq對(duì)H1N1 AIV感染和未感染的A549細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜進(jìn)行了分析,對(duì)病毒感染前后差異表達(dá)的環(huán)狀RNA進(jìn)行了篩選和功能富集分析,為深入研究環(huán)狀RNA在H1N1病毒感染過(guò)程中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。甲型流感病毒Influenza A virus (strain A/Wilson-Smith/1933 H1N1)毒株由湖北醫(yī)藥學(xué)院劉龍博士惠贈(zèng)。A549細(xì)胞在37 ℃,50 mL·L-1CO2培養(yǎng)條件下,使用含有10 mL·L-1胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的Ham’s F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)。將A549細(xì)胞接種在100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí),使用MOI為0.1的A/WSN/33(H1N1)流感病毒感染細(xì)胞。在37 ℃下孵育2 h后將培養(yǎng)基更換為含有1 mL·L-1牛血清蛋白(BSA)和0.2 μg·mL-1TPCK胰酶的F12K培養(yǎng)基。細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)處理后用作對(duì)照。在感染36 h后收集細(xì)胞并提取RNA。

1.2 主要試劑

Trizol RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司),核糖體RNA去除試劑盒(New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA),NEBNext? Ultra II Directional RNA建庫(kù)試劑盒(New England Biolabs),Ham’s F-12K培養(yǎng)基,TPCK胰酶(Sigma),青鏈霉素(Sangon Biotech),牛血清蛋白(BSA,Solarbio),磷酸鹽緩沖液,RNase R(500 U·mL-1, GENESEED),HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit (Cwbio, China)反轉(zhuǎn)錄試劑盒,ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量PCR Mix(Vazyme, China)。

1.3 主要儀器

核酸電泳儀,NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific),BioAnalyzer 2100 system(Agilent Technologies),illumina Hiseq測(cè)序儀,熒光定量PCR儀。

1.4 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.4.1 RNA提取和樣品檢測(cè) 使用Trizol法提取RNA,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性及是否存在基因組DNA污染。利用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度。通過(guò)OD260 nm/OD280 nm比值來(lái)評(píng)估RNA的質(zhì)量,并將比值在1.8～2.1的樣品視為合格。

1.4.2 文庫(kù)建庫(kù)及測(cè)序 高通量測(cè)序服務(wù)由上海云序生物技術(shù)有限公司提供。具體步驟包括:使用核糖體RNA去除試劑盒,從總RNA中去除核糖體RNA。將處理后的總RNA經(jīng)超聲波處理,隨機(jī)打斷至200～300 bp。使用建庫(kù)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并添加測(cè)序接頭和引物,最終生成測(cè)序文庫(kù)。通過(guò)BioAnalyzer 2100系統(tǒng)評(píng)估文庫(kù)的長(zhǎng)度分布和濃度。長(zhǎng)度主要分布在100～600 bp且濃度大于2 ng·μL-1的文庫(kù)質(zhì)量視為合格,并使用illumina Hiseq測(cè)序儀進(jìn)行150 bp雙端測(cè)序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 使用fastqc軟件對(duì)原始測(cè)序fastq文件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。使用Cutadapt(v1.9.3)軟件去除低質(zhì)量和測(cè)序接頭污染的reads,最終得到高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)[23]。

1.5.2 參考基因組比對(duì)和環(huán)狀RNA鑒定 使用STAR(v2.5.1b)軟件將得到的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到hg38參考基因組后使用DCC(v0.4.4)軟件鑒定環(huán)狀RNA[24-25]。DCC軟件能夠利用STAR軟件的比對(duì)結(jié)果并結(jié)合hg38注釋文件來(lái)識(shí)別剪接位點(diǎn),最終特異性地檢測(cè)和定量環(huán)狀RNA。

1.5.3 差異表達(dá)環(huán)狀RNA的篩選及功能分析 使用EdgeR(v3.16.5)包,以|log2FC|≥1、Pvalue<0.05為條件篩選出流感病毒感染后差異表達(dá)的環(huán)狀RNA[26]。使用R包pheatmap對(duì)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA進(jìn)行聚類(lèi)分析[27]。使用R包ClusterProfiler對(duì)差異表達(dá)環(huán)狀RNA的來(lái)源基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析[28]。

1.6 環(huán)狀RNA驗(yàn)證

1.6.1 熒光定量PCR驗(yàn)證環(huán)狀RNA差異表達(dá) 使用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit試劑盒將H1N1亞型流感病毒感染和未感染細(xì)胞的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照,使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù),通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)環(huán)狀RNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如表1所示。熒光定量檢測(cè)的程序?yàn)轭A(yù)變性:95 ℃ 30 s;40個(gè)循環(huán)反應(yīng):95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s;熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。

1.6.2 RNase R消化和Sanger測(cè)序驗(yàn)證環(huán)狀RNA表達(dá) 使用RNase R將RNA樣品在37 ℃下消化30 min,然后在70 ℃下滅活10 min。未用RNase R處理的RNA用作對(duì)照。使用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用特異性引物(表1),對(duì)環(huán)狀RNA hsa_circ_0104558、hsa_circ_0077717和hsa_circ_0000025的反向剪接位點(diǎn)進(jìn)行2～3輪PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行Sanger測(cè)序。

表1 用于環(huán)狀RNA PCR擴(kuò)增的引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification of circRNAs

2 結(jié) 果

2.1 總RNA的提取和質(zhì)量檢驗(yàn)

將提取的總RNA在1%的瓊脂糖凝膠中,150 V電壓下電泳分離20 min,如圖1所示, RNA條帶清晰完整。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定,樣品的OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0(表2),質(zhì)量合格,可以用于測(cè)序。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)情況如表3所示。感染組(E)和未感染組(C)分別獲得了246 438 632和276 572 244條原始讀數(shù)。將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾后,最終分別得到239 048 836和272 234 451條高質(zhì)量讀數(shù)。這些高質(zhì)量讀數(shù)的堿基Q30值均高于92.77%,GC含量趨近于55%,表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,能夠進(jìn)行后續(xù)分析。

表2 RNA質(zhì)量檢驗(yàn)Table 2 RNA quality inspection

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析Table 3 Sequencing data quality analysis

2.3 環(huán)狀RNA的鑒定及其特性分析

經(jīng)過(guò)DCC軟件鑒定,在感染組(H1N1)和未感染組(Mock)中分別檢測(cè)到1 101個(gè)和676個(gè)環(huán)狀RNA表達(dá),其中只有116個(gè)環(huán)狀RNA在病毒感染前后均表達(dá)。這表明流感病毒感染顯著改變了宿主細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)模式(圖2A)。統(tǒng)計(jì)病毒感染前后環(huán)狀RNA的染色體分布,發(fā)現(xiàn)在所有的染色體上均有環(huán)狀RNA表達(dá),并且在感染組中每條染色體上檢測(cè)到的環(huán)狀RNA數(shù)量比未感染組更多(圖2B)。環(huán)狀RNA的長(zhǎng)度分析表明,大約60%的環(huán)狀RNA長(zhǎng)度在300～1 000 nt,約20%的環(huán)狀RNA長(zhǎng)度超過(guò)2 000 nt。未感染組中環(huán)狀RNA的平均長(zhǎng)度為3 567 nt,在感染組中為3 556 nt(圖2C)。根據(jù)來(lái)源,將環(huán)狀RNA分為5類(lèi),分別為外顯子型(exonic)、內(nèi)含子型(intronic)、基因間型(intergenic)、反義鏈轉(zhuǎn)錄本(antisense)、正義鏈重疊型(sense overlapping)。流感病毒感染前后,大部分(75%～82%)環(huán)狀RNA都來(lái)源于外顯子,少部分(1%～4%)來(lái)源于內(nèi)含子型、基因間型和反義鏈轉(zhuǎn)錄本(圖2D)。

A.環(huán)狀RNA在H1N1感染組和Mock未感染組A549細(xì)胞中的表達(dá)數(shù);B.環(huán)狀RNA在H1N1感染組和Mock未感染組A549細(xì)胞中的染色體分布;C.環(huán)狀RNA在H1N1感染組和Mock未感染組A549細(xì)胞中的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì);D.環(huán)狀RNA在H1N1感染組和Mock未感染組A549細(xì)胞中的來(lái)源類(lèi)型。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖A. The number of circRNAs identified in uninfected and H1N1-infected A549 cells; B. Distribution of circRNAs on chromosomes in uninfected and H1N1-infected cells; C. Length statistics of circRNAs in uninfected and H1N1-infected cells; D. Classification of circRNAs in uninfected and H1N1-infected cells.The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖2 環(huán)狀RNA在A549細(xì)胞中的表達(dá)概況Fig.2 The expression profile of circRNAs in A549 cells

2.4 差異表達(dá)環(huán)狀RNA分析

使用EdgeR包對(duì)流感病毒感染前后表達(dá)的環(huán)狀RNA進(jìn)行差異表達(dá)分析,共篩選出54個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)和18個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)的環(huán)狀RNA(|log2FC|≥1,Pvalue<0.05) (圖3A)。對(duì)這72個(gè)差異表達(dá)環(huán)狀RNA進(jìn)行層次聚類(lèi)分析,表明這些環(huán)狀RNA的表達(dá)水平在組內(nèi)具有良好的重復(fù)性,并且在病毒感染前后表達(dá)水平有明顯差異(圖3B)。差異表達(dá)環(huán)狀RNA主要分布在5、12、16和19號(hào)染色體,而在14、20和Y染色體上未檢測(cè)到差異表達(dá)的環(huán)狀RNA(圖3C)。根據(jù)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)顯示,約62%的差異表達(dá)環(huán)狀RNA長(zhǎng)度在300～1 000 nt,約25%的環(huán)狀RNA長(zhǎng)度超過(guò)2 000 nt(圖3D)。分析差異表達(dá)環(huán)狀RNA的來(lái)源,72%的差異表達(dá)環(huán)狀RNA屬于外顯子型,24%屬于正鏈重疊型,剩下的4%來(lái)源于內(nèi)含子型、基因間型和反義鏈轉(zhuǎn)錄本(圖3E)。

2.5 差異表達(dá)環(huán)狀RNA來(lái)源基因的富集分析

為了研究環(huán)狀RNA的潛在功能,對(duì)差異表達(dá)環(huán)狀RNA的來(lái)源基因進(jìn)行了GO富集分析和KEGG通路分析,并以Pvalue<0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選出顯著富集的GO條目和KEGG通路。在生物進(jìn)程方面,差異表達(dá)環(huán)狀RNA來(lái)源基因主要富集到RNA定位、超分子纖維組織的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的響應(yīng)和膽固醇合成等條目。在分子功能方面,來(lái)源基因主要富集在單鏈DNA結(jié)合、RNA帽子結(jié)合和Tau蛋白激酶活性等條目。在細(xì)胞組分方面,其主要富集到細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞基底等條目(圖4A)。KEGG通路分析顯示,環(huán)狀RNA主要富集到纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸降解通路、FoxO信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等(圖4B)。

A. 差異表達(dá)環(huán)狀RNA火山圖;B.差異表達(dá)環(huán)狀RNA表達(dá)量聚類(lèi)熱圖;C.差異表達(dá)環(huán)狀RNA染色體分布;D.差異表達(dá)環(huán)狀RNA長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì);E.差異表達(dá)環(huán)狀RNA分類(lèi)。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖A.Volcano plot of differentially expressed circRNAs; B.Cluster heatmap of the expression levels of differentially expressed circRNAs; C.Distribution of differentially expressed circRNAs on chromosomes; D.Length statistics of differentially expressed circRNAs; E.Classification of differentially expressed circRNAs.The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖3 環(huán)狀RNA差異表達(dá)分析Fig.3 Differential expression analysis of circular RNA

A.C. GO富集分析結(jié)果;D. KEGG通路富集結(jié)果。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖 A-C. The result of GO enrichment; D. The result of KEGG pathway analysis.The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖4 差異表達(dá)環(huán)狀RNA來(lái)源基因富集分析Fig.4 Enrichment analysis of parent gene of differentially expressed circRNAs

2.6 差異表達(dá)環(huán)狀RNA驗(yàn)證

為了驗(yàn)證環(huán)狀RNA鑒定的準(zhǔn)確性,用外切核糖核酸酶RNase R對(duì)提取的RNA進(jìn)行了消化處理,然后逆轉(zhuǎn)錄,用于PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,經(jīng)RNase R消化后,在流感病毒感染和未感染的細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到GAPDH mRNA的表達(dá),但是可以檢測(cè)到三種環(huán)狀RNA的表達(dá),這證實(shí)了這三種環(huán)狀RNA具有抵抗外切核糖核酸酶消化的能力(圖5A)。經(jīng)Sanger測(cè)序證實(shí)了三種環(huán)狀RNA的反向剪接位點(diǎn)(圖5B)。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR來(lái)檢驗(yàn)感染前后環(huán)狀RNA的表達(dá)水平,結(jié)果表明:在流感病毒感染細(xì)胞后,環(huán)狀RNA SNUPN(has_circ_0104558)和DCBLD1(hsa_circ_0077717)的表達(dá)顯著下調(diào);EIF4G3(hsa_circ_0000025)的表達(dá)顯著上調(diào),與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致(圖5C)。綜上所述,這些結(jié)果對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和環(huán)狀RNA鑒定的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證,證實(shí)了三種環(huán)狀RNA在病毒感染前后的差異表達(dá)。

3 討 論

環(huán)狀RNA是一類(lèi)不具有5′帽子和3′尾巴結(jié)構(gòu),由RNA反向剪接而形成的閉環(huán)非編碼RNA,能夠參與調(diào)控多種生物進(jìn)程[29]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn),對(duì)環(huán)狀RNA的研究也越來(lái)越深入。已有研究結(jié)果顯示,環(huán)狀RNA在疾病發(fā)展的進(jìn)程中起著重要調(diào)控作用,有可能從中篩選出用于疾病診斷或預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物[30-31]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA能以不同的方式調(diào)控病毒感染。例如,RIG-I能夠識(shí)別外源環(huán)狀RNA,從而激活免疫反應(yīng),保護(hù)宿主以抵抗病毒感染[14];dsRNA結(jié)合蛋白NF90和NF110能夠調(diào)控胞內(nèi)環(huán)狀RNA的表達(dá),從而影響病毒復(fù)制[15];卡波西肉瘤皰疹病毒能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中circ_0001400的表達(dá),以維持病毒在細(xì)胞內(nèi)的潛伏感染狀態(tài)[32]。最近的研究表明,由IAV的H3N2、H5N1、H7N9和H9N2毒株引起的感染能夠?qū)е聰?shù)百個(gè)環(huán)狀RNA的差異表達(dá)[17,19-20]。本研究中,作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)1N1亞型流感病毒感染前后的A549細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜進(jìn)行了分析,在感染組和未感染組中分別檢測(cè)到了1 101和676個(gè)環(huán)狀RNA表達(dá)。相比于未感染組,在感染組的各個(gè)染色體上檢測(cè)到了更多的環(huán)狀RNA表達(dá),這表明H1N1亞型流感病毒感染能夠全面提高細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)豐度。這些環(huán)狀RNA的表達(dá)水平是由于轉(zhuǎn)錄或者剪接活性的改變而上調(diào),還是由于病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢,從而選擇性地降解線性RNA分子,導(dǎo)致環(huán)狀RNA的積累?還需要進(jìn)一步的深入研究來(lái)回答這個(gè)問(wèn)題。

差異表達(dá)分析結(jié)果顯示,與未感染的細(xì)胞相比,H1N1病毒感染的A549細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了72個(gè)顯著差異表達(dá)的環(huán)狀RNA,其中54個(gè)表達(dá)上調(diào)和18個(gè)表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)環(huán)狀RNA大多分布在5、12、16和19號(hào)染色體,而在14、20和Y染色體上未檢測(cè)到。雖然H1N1亞型流感病毒感染能夠引起環(huán)狀RNA的差異表達(dá),但是目前尚不清楚差異表達(dá)的環(huán)狀RNA在H1N1亞型病毒感染期間的作用,需要進(jìn)一步研究來(lái)揭示它們之間的關(guān)聯(lián)。

A.環(huán)狀RNA抗RNase R降解能力的檢測(cè)。上排和下排膠圖分別展示了RNA未使用RNase R處理和使用RNase R處理后的檢測(cè)結(jié)果。GAPDH mRNA作為線性RNA對(duì)照;B.三種環(huán)狀RNA反向剪接位點(diǎn)鄰近序列的Sanger測(cè)序結(jié)果;C.以GAPDH為內(nèi)參,通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證IAV感染前后環(huán)狀RNA的差異表達(dá)。左側(cè)柱狀圖為RT-qPCR結(jié)果,右側(cè)為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異倍數(shù)。*. P<0.05,**. P<0.01, ***. P<0.001。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖A. The resistance analysis of circRNAs to RNase R digestion. Upper and lower gel images show the RNA detection results before and after RNase R treatment, respectively. GAPDH mRNA was used as a linear RNA control; B. The adjacent sequence of back-spliced junction regions of the selected circRNAs examined by Sanger sequencing; C. Relative expression levels of circRNAs before and after IAV infection detected by RT-qPCR, using GAPDH as the internal reference. The left three bars represent the RT-qPCR results, and the right three bars represent RNA-seq results. *. P<0.05, **. P<0.01 and ***. P<0.001. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖5 差異環(huán)狀RNA驗(yàn)證Fig.5 Validation of differentially expressed circRNAs

研究表明,環(huán)狀RNA可以通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)病毒感染,如作為microRNA的海綿、與RNA結(jié)合蛋白相互作用、作為線性RNA的競(jìng)爭(zhēng)者,以及調(diào)控親本基因的表達(dá)等[17,33]。然而,關(guān)于環(huán)狀RNA在流感病毒感染中的作用還需深入研究。目前,只有環(huán)狀RNA Circ-GATAD2A被報(bào)道能夠通過(guò)抑制細(xì)胞自噬來(lái)促進(jìn)H1N1亞型病毒復(fù)制[22]。本研究中,通過(guò)RNase R去除線性RNA,PCR擴(kuò)增、Sanger測(cè)序和RT-qPCR驗(yàn)證了環(huán)狀RNA SNUPN(has_circ_0104558)、DCBLD1(hsa_circ_0077717)和EIF4G3(hsa_circ_0000025)在IAV感染前后的差異表達(dá)。SNUPN蛋白能夠作為snRNP的特異性核輸入受體而發(fā)揮作用[34];DCBLD1蛋白能夠通過(guò)與酪氨酸激酶受體EGFR、VEGFR2、PDGFRβ和INSR結(jié)合,從而影響下游MAPKs或Akt的激活,導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移速率的變化[35];真核翻譯起始因子4G(EIF4G3)是翻譯起始復(fù)合物中重要的支架蛋白[36]。本研究中鑒定出來(lái)的環(huán)狀RNA是否識(shí)別這幾種親本基因,調(diào)控這些宿主細(xì)胞蛋白的表達(dá)和功能還有待深入研究。

通過(guò)對(duì)H1N1亞型流感病毒感染后差異表達(dá)環(huán)狀RNA的親本基因進(jìn)行GO和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA主要富集到生物進(jìn)程中的RNA定位、超分子纖維組織的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的響應(yīng)以及膽固醇合成過(guò)程等條目;分子功能中的單鏈DNA結(jié)合、RNA帽子結(jié)合和Tau蛋白激酶活性等條目;細(xì)胞組分中的細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞基底等條目。此外,富集到的KEGG通路包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路,FoxO信號(hào)通路,脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等。這些差異表達(dá)的環(huán)狀RNA是否參與IAV感染過(guò)程的調(diào)控及其調(diào)控機(jī)制,還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得了在H1N1亞型流感病毒感染的A549細(xì)胞中的環(huán)狀RNA表達(dá)譜。在感染組和未感染組中分別檢測(cè)到了1 101和676個(gè)環(huán)狀RNA表達(dá)。H1N1亞型流感病毒感染后,環(huán)狀RNA豐度整體上調(diào),表明環(huán)狀RNA與病毒感染之間存在某種關(guān)聯(lián)。通過(guò)差異分析,篩選出72個(gè)顯著差異表達(dá)的環(huán)狀RNA。GO和KEGG分析預(yù)測(cè),這些環(huán)狀RNA可能與RNA定位、氨基酸代謝等相關(guān)。這些數(shù)據(jù)可以為進(jìn)一步探索環(huán)狀RNA在流感病毒-宿主中的功能及病毒感染標(biāo)志物的篩選提供參考。