溶血三項(xiàng)試驗(yàn)及碳氧血紅蛋白在胎兒新生兒溶血病診斷中的價值*

趙帆 邵智利 尤小寒 焦建成 范麗莉 孫敏 孟靈芝 馬莉

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省兒童醫(yī)院 新生兒科，河北 石家莊 050031)

胎兒新生兒溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN)是指母嬰血型不合而引起的胎兒和新生兒免疫性溶血病。 目前國際輸血協(xié)會確認(rèn)的人類紅細(xì)胞有378個抗原[1]，ABO 和Rh 血型不合所引發(fā)的HDFN 最常見，其他血型系統(tǒng)不合引起的HDFN 極為少見[2]。 HDFN 的診斷主要依賴于臨床表現(xiàn)及血清學(xué)檢測，包括血型鑒定、溶血三項(xiàng)試驗(yàn)，即直接抗人球蛋白試驗(yàn)(direct antiglobulin test，DAT，直抗試驗(yàn))、血清游離抗體試驗(yàn)(游離試驗(yàn))和紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)(釋放試驗(yàn))。 但溶血試驗(yàn)并不完全可靠，可能出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。 若不參考溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，直接將存在血型不合的高膽紅素血癥患兒診斷為HDFN，可能會導(dǎo)致溶血病的過度診斷[3-4]。 因此其診斷標(biāo)準(zhǔn)始終存在爭議。 曾有學(xué)者指出ABO-HDFN 無論從臨床或?qū)嶒?yàn)室檢測的角度，均無法被充分定義[5]。

在膽紅素的代謝過程中，血紅素分解成膽紅素時會產(chǎn)生膽綠素、鐵，同時產(chǎn)生等當(dāng)量的一氧化碳(carbonic oxide，CO)，因此自上世紀(jì)60 年代起即有研究采用測定內(nèi)源性CO增長率評估溶血程度[6]。 內(nèi)源性CO 生成可通過呼氣末一氧化碳(end-tidal carbon monoxide，ETCO)及碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，COHb)2 種方法測定。 有研究報道[7]在未獲得血清學(xué)結(jié)果的情況下，COHb 對于病因診斷、高膽紅素血癥風(fēng)險評估及治療具有一定意義。 且與ETCO 相比，臨床上通過血?dú)夥治鰞x檢測COHb 水平相對更易獲得，但其應(yīng)用價值尚未被充分研究。 我們通過對臨床可疑溶血病的新生兒進(jìn)行回顧性分析，評估溶血三項(xiàng)、COHb 及聯(lián)合檢測對HDFN 的診斷價值，為臨床規(guī)范診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及分組 選取2019 年1 月1 日—2022 年12月31 日于本院新生兒科收治的疑似新生兒溶血病并送血清學(xué)檢測的患兒，其中臨床診斷為HDFN 的患兒作為溶血組。納入標(biāo)準(zhǔn):1)存在母嬰血型不合，生后出現(xiàn)高膽紅素血癥，溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果判定為陽性；2)存在母嬰血型不合，溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果判定為陰性，但生后出現(xiàn)高膽紅素血癥和(或)溶血性貧血等臨床表現(xiàn)，排除其他原因引起的溶血病或肝膽疾病[8-10]。 選取無母嬰血型不合，但有黃疸表現(xiàn)而未達(dá)高膽紅素血癥光療標(biāo)準(zhǔn)、溶血三項(xiàng)試驗(yàn)判定為陰性、血清不規(guī)則抗體陰性、臨床排除HDFN 的患兒作為對照組。 排除標(biāo)準(zhǔn):1)非出生后首次就診；2)合并紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(G-6-PD 缺乏癥)、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥等特殊類型溶血；3)有宮內(nèi)窘迫、產(chǎn)時窒息史，或異常出血(如顱內(nèi)出血、頭皮血腫、腎上腺出血)等影響血總膽紅素值的因素；4)入院時首次動脈血?dú)夥治龃嬖诿黠@酸堿平衡紊亂。 本研究通過本院倫理審查委員會批準(zhǔn)(醫(yī)研倫審第202222-77 號)。

1.2 方法 回顧性收集研究期間符合納入標(biāo)準(zhǔn)患兒的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料，調(diào)查表內(nèi)容包括:1)一般臨床資料:患兒性別、胎齡、入院日齡、出生體重、喂養(yǎng)方式等；2)實(shí)驗(yàn)室資料:患兒血清總膽紅素(total serum bilirubin，TSB)、血紅蛋白(heamoglobin，Hb)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte，Ret)、COHb 等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(以上均為入院首日采集)、溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，患兒及母親ABO、Rh 血型鑒定、Rh 血型分型、不規(guī)則抗體篩查結(jié)果。 COHb 通過血?dú)夥治鰞x(cobasb 221-6 型，德國羅氏診斷有限公司)檢測獲得。

1.3 研究中所用的定義 新生兒高膽紅素血癥[11]:對于胎齡≥35 周的新生兒，采用美國兒科學(xué)會推薦的小時膽紅素列線圖及光療/換血參考曲線作為診斷或干預(yù)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)膽紅素水平超過第95 百分位時定義為高膽紅素血癥。

溶血三項(xiàng)試驗(yàn)判定HDFN[8]:僅釋放試驗(yàn)陽性或任意2 項(xiàng)以上陽性判為“可確診HDFN”；DAT 或游離試驗(yàn)單項(xiàng)陽性判為“可疑HDFN”；DAT、游離試驗(yàn)和釋放試驗(yàn)3 項(xiàng)都陰性判為“不可證實(shí)為HDFN”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 27.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料符合非正態(tài)分布的以M(P25，P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。 計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。 使用卡方趨勢檢驗(yàn)判斷變量之間是否有線性變化。 使用Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)分析變量之間的相關(guān)性。 采用受試者工作(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析各個及多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷價值，通過控制混雜因素，建立logistic 回歸模型，形成聯(lián)合預(yù)測因子，再繪制ROC曲線，確定曲線下面積(area under the curve，AUC)，分析最佳截斷值的靈敏度、特異度，使用Delong 檢驗(yàn)比較不同指標(biāo)間AUC 差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 本研究溶血組共納入378 例臨床診斷HDFN 患兒，對照組共納入217 例排除HDFN 患兒。 依據(jù)患兒臨床表現(xiàn)及血清學(xué)檢測結(jié)果，溶血組中有354 例(93.7%)確診為ABO-HDFN，24 例(6.3%)確診為Rh-HDFN，非ABOHDFN 不規(guī)則抗體篩查陽性中，均未檢測出Rh 系統(tǒng)以外的特異性抗體。 溶血組及對照組在胎齡、出生體重、入院日齡、入院時TSB、Hb 水平、COHb、Ret 所占百分比方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在男女性別構(gòu)成、順產(chǎn)、母乳喂養(yǎng)所占比例方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具體見表1。

表1 2 組患兒一般臨床資料比較

溶血組以足月兒為主，早產(chǎn)兒僅30 例(7.9%)，無28 周以下早產(chǎn)兒，354 例(93.7%)為母嬰ABO 血型不合，24 例(6.3%)為Rh 血型不合。 溶血組全部接受了藍(lán)光治療，其中23 例(6%)接受了換血治療，47 例(12.4%)接受了靜注人免疫球蛋白治療。

2.2 溶血組溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽性率與日齡的關(guān)系 在378 例臨床診斷HDFN 患兒中，日齡1 d 以內(nèi)的新生兒，溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽性(僅釋放試驗(yàn)陽性或任意2 項(xiàng)以上陽性)檢出率最高，為88.5%(54/61)，隨日齡增大，陽性率也隨之降低，超過7 d時陽性率最低，為44.4%(24/54)。 卡方趨勢檢驗(yàn)結(jié)果顯示日齡與溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽性率之間存在線性相關(guān)性(χ2＝26.921，P＜0.001)。 見表2。

表2 不同日齡與溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽性率

2.3 溶血組日齡與COHb 之間的關(guān)系 溶血組日齡與COHb 之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，Spearman 相關(guān)系數(shù)rs＝－0.434，P＜0.001，表明隨著日齡的增加，COHb 值逐漸下降。 如圖1。

圖1 COHb 值隨日齡變化趨勢

2.4 溶血組患兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，溶血組“確診”、“可疑”及“不能證實(shí)”的病例分別為264例(69.8%)、11 例(2.9%)、103 例(27.2%)。 溶血三項(xiàng)試驗(yàn)判定為可疑及不能證實(shí)的病例由臨床醫(yī)師依據(jù)臨床表現(xiàn)及排除其它潛在溶血因素后最終診斷。 DAT、游離試驗(yàn)、釋放試驗(yàn)單項(xiàng)陽性率分別為36.0%(136/378)、55.6%(210/378)、69.0%(261/378)，見表3。 對照組217 例患兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)及不規(guī)則抗體檢測結(jié)果均陰性，判定為非HDFN。

表3 378 例患兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果判斷

2.5 繪制ROC 曲線評估溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合診斷HDFN 的價值 用SPSS 27.0 軟件繪制溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合診斷HDFN 的ROC 曲線，賦值:臨床診斷為HDFN 以1 表示，非HDFN 以0 表示；溶血三項(xiàng)結(jié)果判定為“確診”用2表示，“可疑”用1 表示，“不能證實(shí)”用0 表示。 分別構(gòu)建溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合的檢測因子模型，在用logostic 回歸構(gòu)造三種聯(lián)合因子時，已把基線分析時有顯著差異的胎齡、出生體重、入院日齡等變量作為混雜因素加以控制，再進(jìn)行繪制ROC 曲線，分別確定溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合檢測的AUC、最佳截斷值對應(yīng)的靈敏度及特異度。 見圖2 及表4。

圖2 溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合診斷HDFN 的ROC 曲線

表4 溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合對HDFN 的診斷效能

取COHb 的ROC 曲線中最靠近左上角的一點(diǎn)(COHb≥1.15%)為最佳截斷值，其靈敏度、特異度均低于溶血三項(xiàng)試驗(yàn)，Delong 檢驗(yàn)比較溶血三項(xiàng)及聯(lián)合檢測的AUC，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z＝－0.727，P＞0.05)，提示COHb 與溶血三項(xiàng)試驗(yàn)聯(lián)合檢測并未顯著增加后者對HDFN 的診斷效能(表4)。

3 討論

HDFN 是早期新生兒發(fā)生重度高膽紅素血癥最常見的因素[12]，如未能早期及時的診斷和治療，可能引起膽紅素腦病，影響患兒遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后。 溶血三項(xiàng)試驗(yàn)是臨床常用的診斷試驗(yàn)，但評估新型溶血指標(biāo)診斷價值的研究仍在不斷開展[13]。 本研究通過對疑似溶血病患兒進(jìn)行回顧性分析，評估溶血三項(xiàng)試驗(yàn)、COHb 及二者聯(lián)合檢測對于HDFN 的診斷價值，以提高診斷準(zhǔn)確性。

溶血診斷試驗(yàn)的送檢時間。 關(guān)于溶血三項(xiàng)試驗(yàn)的檢測時間，文獻(xiàn)中并未做統(tǒng)一推薦，國內(nèi)多數(shù)機(jī)構(gòu)會在新生兒出現(xiàn)黃疸癥狀后才去送檢。 本研究發(fā)現(xiàn)在納入的HDFN 患兒中，送檢日齡越早，溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽性檢出率越高，提示送檢時間晚可能是溶血三項(xiàng)試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性結(jié)果的原因之一。由于隨著生后日齡的延長，致敏的紅細(xì)胞在肝臟和脾臟中逐漸被破壞，游離的IgG 抗體逐漸消失，其他IgG 抗體則以抗原抗體復(fù)合物形式存在，失去反應(yīng)原性而可能出現(xiàn)陰性結(jié)果[14]。 何柏霖等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律，在2 208 例疑似溶血病患兒中2 d 內(nèi)的陽性檢出率達(dá)60%以上，隨著送檢日齡增加，陽性檢出率逐漸下降，在7 d以后降至27.79%。國內(nèi)有學(xué)者[16]通過對800 余例高膽紅素血癥新生兒的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)COHb 值隨日齡增加而逐漸下降，本研究也發(fā)現(xiàn)COHb 與生后日齡呈負(fù)相關(guān)。 提示對于存在溶血風(fēng)險的患兒，無論黃疸程度如何，生后應(yīng)盡早送檢溶血三項(xiàng)試驗(yàn)和/或COHb 檢測，以提高診斷準(zhǔn)確性，及時給予干預(yù)。 在美國兒科學(xué)會2022 年頒布的新生兒高膽紅素血癥管理指南中也推薦對于母親孕期未做抗體篩查和抗體篩查陽性的新生兒生后應(yīng)盡早完善DAT 和血型檢測[11]。

溶血三項(xiàng)試驗(yàn)的檢測意義。 DAT 和釋放試驗(yàn)均是檢測致敏紅細(xì)胞上的血型抗體相關(guān)試驗(yàn)，游離試驗(yàn)則是檢測血漿中的血型抗體。 游離試驗(yàn)陽性說明病情可能會持續(xù)，對溶血病確診和疾病嚴(yán)重程度的判斷有輔助作用[17]。 在國外，DAT被認(rèn)為是識別疑似HDFN 的重要試驗(yàn)，在溶血病的診斷檢查中起著核心作用[18]。 通常來講DAT 陽性程度越強(qiáng)，意味著病情越重。 但文獻(xiàn)[9]提出DAT 陽性不能完全診斷HDFN，釋放試驗(yàn)才是HDFN 診斷的重要依據(jù)，且因使用的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞試劑事先經(jīng)過加酶處理，吸附抗體能力增強(qiáng)，因此靈敏度會更高[19]。 本研究也發(fā)現(xiàn)溶血病例中釋放試驗(yàn)陽性率最高，達(dá)69.0%，顯著高于DAT 陽性率(36.0%)，溶血三項(xiàng)結(jié)果中大多是釋放試驗(yàn)陽性伴DAT 和(或)游離試驗(yàn)陽性，而僅DAT 和(或)游離試驗(yàn)陽性而釋放試驗(yàn)陰性的情況很少。 出現(xiàn)這種情況時臨床醫(yī)師需要和檢驗(yàn)科醫(yī)師溝通，必要時需要重復(fù)檢測，以防止因受實(shí)驗(yàn)室操作因素而出現(xiàn)釋放試驗(yàn)假陰性的情況。

本研究中，有部分溶血三項(xiàng)試驗(yàn)均為陰性患兒臨床醫(yī)生也將其診斷為HDFN。 可能的原因包括:1)送檢時間過于晚，溶血病輕癥患兒可能僅表現(xiàn)輕度黃疸，易被歸為生理性黃疸，有些則僅表現(xiàn)為晚期貧血，錯過最佳檢測時機(jī)；2)采血困難，采血不順利或未采集足量靜脈血；3)與檢測方法有關(guān)，微柱凝膠卡和固相測試分析優(yōu)于常規(guī)試管法，此外人工操作、離心速度、時間控制不佳、標(biāo)本存放環(huán)境影響等也可導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陰性。 因此HDFN 診斷最終應(yīng)綜合臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[9]。 對于有母嬰血型不合且溶血三項(xiàng)試驗(yàn)均陰性的患兒，在出現(xiàn)明顯黃疸時，臨床醫(yī)生需甄別有無同種免疫性溶血病以外的原因，如G-6-PD 缺乏、紅細(xì)胞膜缺陷，或與基因缺陷相關(guān)的Gilbert 綜合征等。 籠統(tǒng)將存在血型不合和黃疸的患兒診斷為HDFN 容易漏掉真正的病因。

根據(jù)人體溶血機(jī)制，衰老的紅細(xì)胞破壞產(chǎn)生血紅素，以等摩爾比轉(zhuǎn)化為膽綠素和CO。 膽綠素在還原酶作用下進(jìn)一步還原為膽紅素。 在此過程中產(chǎn)生的CO 與血紅蛋白結(jié)合形成COHb，經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到肺，隨后通過呼吸排出[20]。 根據(jù)2022 年美國兒科學(xué)會最新指南，推薦通過測量ETCO 來進(jìn)行溶血的識別[11]。 ETCO 檢測既往不易在臨床廣泛使用，近年來美國Capnia 公司研發(fā)出1 種通過鼻導(dǎo)管測量的新型儀器，小巧便捷，可應(yīng)用于臨床[21]，但因耗材價格較昂貴，尚未廣泛普及。 血液COHb 測定方法相對較多，包括CO-血氧分析法、氣相色譜法、分光光度計法等。 血?dú)夥治鰞x測定血液COHb 操作簡單快速，對于住院新生兒，可作為呼出氣CO 含量的替代方法[22]。 本研究中，溶血組COHb 值高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 以COHb≥1.15%為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，診斷靈敏度優(yōu)于單項(xiàng)DAT，但低于溶血三項(xiàng)試驗(yàn)，且聯(lián)合檢測并未顯著增加后者的診斷效能。 說明COHb 對HDFN 有一定診斷價值，但仍應(yīng)以溶血三項(xiàng)試驗(yàn)作為主要診斷方法，僅在醫(yī)療機(jī)構(gòu)不能開展溶血試驗(yàn)或ETCO 檢查情況下，才適于將COHb 作為HDFN 的1 個早期篩查及輔助診斷指標(biāo)。

本研究系回顧性研究，未能收集到母親產(chǎn)前血清抗體效價檢測率及水平，不能分析其與生后溶血發(fā)生風(fēng)險之間的關(guān)系；研究期間送檢血清學(xué)檢測的患兒中，診斷HDFN 者偏多，對照組例數(shù)偏少，本研究中并未觀察到溶血組HGB 水平較對照組減低，可能與此有關(guān)。 可進(jìn)一步擴(kuò)大及匹配2 組標(biāo)本量，提高數(shù)據(jù)代表性。

綜上所述，溶血三項(xiàng)試驗(yàn)對HDFN 的診斷有重要價值，其中釋放試驗(yàn)靈敏度最高。 COHb 對HDFN 有一定診斷價值，診斷靈敏度高于單項(xiàng)DAT，但聯(lián)合檢測并未顯著增加溶血三項(xiàng)試驗(yàn)的診斷效能。 在不能開展溶血三項(xiàng)試驗(yàn)和ETCO的機(jī)構(gòu)，COHb 可作為早期篩查和輔助診斷的1 個指標(biāo)。 無論是溶血三項(xiàng)試驗(yàn)還是COHb，對于有溶血風(fēng)險的新生兒，均應(yīng)早期送檢以提高診斷準(zhǔn)確性。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。