基于膠原異三聚體的成骨不全癥機(jī)理研究

強(qiáng)書敏,呂 成,許 菲

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122）

0 引 言

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì),可以作為結(jié)構(gòu)蛋白為皮膚、骨骼、血管等提供支撐與張力.同時(shí),膠原蛋白具有生物活性,可以與許多細(xì)胞外基質(zhì)相互作用[1-3],人體內(nèi)的膠原蛋白占總蛋白的三分之一[4].膠原蛋白的序列包含大量重復(fù)的(Gly-X-Y)n單元,其中X 位通常是脯氨酸(Pro),而Y 位通常為(2S,4R)-4-羥脯氨酸(Hyp)[5-6].3 條膠原蛋白鏈相互纏繞,折疊形成特有的三螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu).當(dāng)3 條鏈序列相同時(shí),稱為同三聚體,反之則稱為異三聚體.三聚體螺旋結(jié)構(gòu)中的兩條肽鏈之間通過(guò)一個(gè)殘基的錯(cuò)位排列,促使甘氨酸(Gly)亞氨基的氮(N-H)與相鄰肽鏈X 位殘基的羰基氧(C=O)形成氫鍵,按照順序?qū)? 條鏈命名為前鏈、中鏈、尾鏈.從膠原蛋白N 端到C 端形成一系列梯狀排列的氫鍵,這是穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動(dòng)力來(lái)源.

人體中包含28 種類型的天然膠原蛋白,其中占比最大的是Ⅰ型膠原蛋白,是由兩條α1 鏈與一條α2 鏈構(gòu)成的異三聚體.醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Ⅰ型膠原蛋白中發(fā)生單點(diǎn)突變,往往是Gly 被其他殘基替代,會(huì)引起包括成骨不全癥(osteogenesis imperfecta,OI)在內(nèi)的多種結(jié)締組織疾病[1,7-9].OI 患者的癥狀差別很大,有輕度的多發(fā)性骨折,也有重度的圍產(chǎn)期致死[7-10],但突變類型與疾病癥狀之間的聯(lián)系尚不清楚.

天然膠原具有尺寸大、溶解度差和序列重復(fù)等特點(diǎn),因此,很難利用全膠原序列在原子水平上進(jìn)行分析,在生物物理方面主要通過(guò)主客體模型對(duì)OI 致病機(jī)理進(jìn)行研究[11].將OI 突變插入具有高穩(wěn)定性的主體序列中構(gòu)建突變體,利用X 射線衍射,核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)光譜和圓二色譜(circular dichroism,CD)實(shí)驗(yàn)表征突變對(duì)膠原三螺旋結(jié)構(gòu)造成的影響[10-21].這些主體序列稱為類膠原多肽(collagen model peptides,CMP),多包含Gly-Pro-Hyp 重復(fù)序列,在溶液中形成穩(wěn)定的同三聚體螺旋結(jié)構(gòu).研究者在同三聚體序列中引入包含不同類型的OI 突變模體序列,破壞了三螺旋的分子結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熱穩(wěn)定性顯著降低,并且發(fā)現(xiàn)位于不同鏈的突變可引發(fā)不同的破壞效果[10,22-24].最經(jīng)典的研究是在同三聚體(POG)103 條鏈中引入Gly→Ala 突變,結(jié)晶得到突變模型(PDB ID 1CAG),突變后的熔融溫度(Tm)值由初始的60℃降至29℃[25].NMR 的研究集中于Ala 突變對(duì)局部三螺旋結(jié)構(gòu)的影響.比如,尾鏈Ala 突變的氨酰質(zhì)子升溫速率高于未突變的Gly,表明突變破壞了尾鏈上的氫鍵,但是其他兩個(gè)突變位點(diǎn)氨酰質(zhì)子升溫速率保持不變.耦合值(J)可以與氨基酸二面角φ 角對(duì)應(yīng),在正常Gly-X-Y 中Gly 的耦合值為(4.7±0.3)Hz,突變后只有中鏈Ala 的耦合值增大,其他鏈保持不變,表明雖然3 條鏈均引入Ala 突變,但只有一條鏈偏離三螺旋主鏈構(gòu)象[26].由于Ⅰ型膠原是由兩條α1(Ⅰ)鏈和一條α2(Ⅰ)鏈組成的異三聚體,為了更貼近Ⅰ型膠原的成分,近些年隨著異三聚體理性合成技術(shù)的發(fā)展,也開(kāi)始以異三聚體為主體肽來(lái)研究OI 突變[27-30].例如,將Gly→Ala 分別引入AAB 模型A、B 鏈時(shí),A 鏈的突變同時(shí)發(fā)生在前鏈與中鏈,Tm值降低32.0℃,破壞1 個(gè)氫鍵[31],B 鏈突變?cè)谖叉溨幸胍粋€(gè)突變,其熱穩(wěn)定性降低20.5℃,破壞5 個(gè)氫鍵[32].盡管可以從NMR 中獲取大量的定量動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù),但是這些研究集中在突變位點(diǎn),缺乏突變對(duì)整體結(jié)構(gòu)影響的描述.

除了生物物理實(shí)驗(yàn)之外,研究者們還利用了分子動(dòng)力學(xué)(molecular dynamics,MD)模擬表征了主客體模型中OI 突變對(duì)膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的影響.從含有突變的CMP 模擬軌跡中提取主鏈氫鍵的構(gòu)象變化,發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)附近的氫鍵一部分遭到破壞,另一部分重構(gòu)為水介導(dǎo)的氫鍵.同時(shí),與晶體中棒狀的三螺旋分子不同的是,突變后的CMP 模擬軌跡中,分子彎曲度明顯增加[23,33-34].在一個(gè)包含數(shù)個(gè)OI 突變且長(zhǎng)度為1 014 個(gè)殘基的Ⅰ型膠原蛋白模型中進(jìn)行MD 模擬,結(jié)果顯示,突變位點(diǎn)附近結(jié)構(gòu)有些呈現(xiàn)完整的三螺旋結(jié)構(gòu),有些部分解折疊并出現(xiàn)分子彎曲,這表明突變?cè)诓煌膮^(qū)域?qū)Y(jié)構(gòu)的破壞也存在差異[35].盡管這些研究表明膠原序列中的Gly 突變會(huì)影響三螺旋結(jié)構(gòu),但是如何精確地描述突變對(duì)三螺旋分子整體運(yùn)動(dòng)模式的影響仍有待進(jìn)一步研究.

利用三螺旋階梯中相鄰三角形的歐拉旋轉(zhuǎn)參數(shù)和平移參數(shù)對(duì)膠原進(jìn)行建模,并通過(guò)從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取參數(shù)的離散度來(lái)構(gòu)建統(tǒng)計(jì)勢(shì)能,得到了一種可以定量描述膠原形變的彈性函數(shù)[36].該模型將CMP 螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為Cα 三角形之間的移動(dòng).取Gly 與相鄰氨基酸的Cα,構(gòu)建三角形平面并建立坐標(biāo)軸,量化平面之間的移動(dòng),利用該模型可以定量描述膠原自身結(jié)構(gòu)的彎曲與拉伸.

本文利用abc(PDB ID: 5YAN)異三聚體,引入OI 突變位點(diǎn),將第17 位Gly 突變?yōu)锳la,構(gòu)建了7 種突變體.結(jié)合差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)、MD 模擬、梯階模型分析等方法,定量描述了突變對(duì)膠原蛋白三螺旋熱穩(wěn)定性、分子結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)模式的影響,發(fā)現(xiàn)氫鍵的形成與分子形變具有高相關(guān)性,為進(jìn)一步揭示OI 的致病機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 差示掃描量熱

在Nano DSC(TA Instruments)中對(duì)組裝后的三螺旋進(jìn)行DSC,并結(jié)合Nano Analyze 軟件分析數(shù)據(jù).本文所用的類膠原多肽序列購(gòu)于上海吉爾生化有限公司,膠原自組裝方法參照文獻(xiàn)[37].自組裝后的三螺旋濃度為1 mg·mL—1.水與PB 緩沖混合溶液至少掃描3 次作為基線,在 20℃下將樣品溶液裝入池中,并以 1℃·min—1的速率加熱.從相應(yīng)緩沖液的吸熱曲線中減去樣品的吸熱曲線并歸一化濃度.使用數(shù)據(jù)分析軟件Nano Analyze 計(jì)算ΔH和Tm的值.

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

在GROMACS 中的Amber99sb*-ILDN 力場(chǎng)下進(jìn)行模擬[38-39].將不同膠原模型結(jié)構(gòu)分別置于十二面體周期盒中,其中TIP3P[40]模型水分子約39 291 個(gè).從盒子表面到最近的溶質(zhì)原子的距離設(shè)定為10 ?(1 ?=10—10m).模擬的時(shí)間步長(zhǎng)為2 fs.長(zhǎng)程靜電相互作用使用粒子-網(wǎng)格Ewald 方法[41]進(jìn)行評(píng)估,其中,FFT 網(wǎng)格的最大間距為12 ?,并且通過(guò)六階多項(xiàng)式進(jìn)行插值.靜電和范德華相互作用的最小截止距離設(shè)定為12 ?.使用最速下降法將系統(tǒng)降至局部能量最小值.隨后,通過(guò)速度重新縮放算法(0.1 ps 弛豫時(shí)間)保持297 K 的溫度,并且使用Berendsen 的弱耦合方法[42]控制壓力P=1 × 105Pa,進(jìn)行10 ns NPT 和100 ns NVT 模擬.

1.3 Cα 三角形

將膠原蛋白的運(yùn)動(dòng)看作一系列三角形的相互位移,三角形的頂點(diǎn)為Gly 與相鄰非Gly(A1,A2)的Cα[43].按照右手原則建立坐標(biāo)系,A2指向A1的方向?yàn)閥軸.A1與A2之間的中點(diǎn)定義為坐標(biāo)軸原點(diǎn).x軸垂直于y軸,并且與原點(diǎn)到Gly 的向量呈銳角.z軸是在三股螺旋的N 端到C 端的軸方向上具有正值的x軸和y軸的叉積.通過(guò)最小二乘擬合將標(biāo)準(zhǔn)坐標(biāo)系疊加到給定的Cα 構(gòu)成三角形上,從而得到Cα 三角形的參照系.

1.4 梯階參數(shù)與形變分?jǐn)?shù)

兩個(gè)成功構(gòu)建的三角形之間按照運(yùn)動(dòng)模式可分為6 種不同的相對(duì)關(guān)系,分別為在x-,y-,z-軸的3 個(gè)位移: Rise,Shift,Slide;3 個(gè)旋轉(zhuǎn): Roll,Tilt,Twist[36].利用已知彈性函數(shù)[44]來(lái)估算膠原在形變時(shí)的程度,形變分?jǐn)?shù)(deformation score E,記為EDS)取自6 個(gè)梯階參數(shù)中兩兩成對(duì)的彈性貢獻(xiàn)之和:

式(1)中:E0為基準(zhǔn)線,本文中取E0=0. Δθiθi-是第i步梯階參數(shù)與平衡態(tài)之間的差值.平衡態(tài)和力場(chǎng)參數(shù)fij取自40 個(gè)結(jié)晶良好的膠原蛋白的梯階參數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù).i,j分別代表梯階的6 個(gè)參數(shù).具體參數(shù)計(jì)算方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[26].

1.5 氫鍵參數(shù)

膠原三螺旋結(jié)構(gòu)中甘氨酸亞氨基(N-H)與相鄰肽鏈X 位置的氨基酸的羰基氧(C=O)能夠形成氫鍵,模擬中氫鍵的定義為氫供體和受體重原子之間的原子間距離R小于3.5 ?,同時(shí)氫-供體-受體構(gòu)成的α 角小于30°[45].氫鍵能量(EHB)的計(jì)算采取以下公式:

式(2)中:R0為穩(wěn)定時(shí)氫鍵的平均距離,本文取2.95 ?,R為某時(shí)刻的氫鍵距離,D0為對(duì)應(yīng)原子在該力場(chǎng)下的井深.F(θ)cos2(θ)cos2(φ),氫鍵中N-O 原子成鍵按照sp3-sp2 軌道雜化[46],θ角是NGly-HGly-OXaa,φ角為CXaa-OXaa-HGly,N 和H 原子來(lái)自Gly,而C 和O 原子來(lái)自X 位置的氨基酸.

2 結(jié)果

2.1 DSC 表征

為了描述OI 突變對(duì)膠原結(jié)構(gòu)的影響,使用先前設(shè)計(jì)的異三聚體膠原abc作為宿主模型并引入Gly→Ala 突變,其中a為前鏈,b為中鏈,c為尾鏈,突變后的鏈分別為a′、b′、c′.本文所用abc序列如圖1(a)所示,避免首尾端擺動(dòng)影響,選取中間區(qū)域Gly,將每條鏈第17 位突變?yōu)锳la.分別將突變模型命名為單點(diǎn)突變a′bc、ab′c、abc′,雙點(diǎn)突變a′b′c、ab′c′、a′bc′,三點(diǎn)突變a′b′c′.

圖1 abc (PDB ID 5YAN)的序列和整體結(jié)構(gòu)Fig.1 Sequence and overall structure of abc(PDB ID 5YAN)

為了檢測(cè)Gly 突變對(duì)膠原熱穩(wěn)定性的影響,使用DSC 表征abc與突變體的焓變(ΔH)及焓變發(fā)生溫度(Tm).DSC 結(jié)果顯示,與abc相比,突變導(dǎo)致Tm值降低約15℃,ΔH減少10～ 20 kcal·mol—1(表1).相對(duì)于單點(diǎn)突變體,雙點(diǎn)突變未測(cè)量到明顯的放熱峰,即ΔH,這表明雙點(diǎn)突變導(dǎo)致了大部分三螺旋結(jié)構(gòu)解折疊.結(jié)果表明,在引入Gly→Ala 突變后,膠原模型熱穩(wěn)定性降低,突變點(diǎn)越多,下降越明顯.

表1 膠原參數(shù)平均值的變化Tab.1 Average of parameters changes in collagen

2.2 結(jié)構(gòu)變化

為了分析突變對(duì)于膠原分子全局的結(jié)構(gòu)變化,提取系統(tǒng)平衡后模擬軌跡,將N 端第1—10 位氨基酸進(jìn)行重疊,定義側(cè)視圖中軌跡邊緣構(gòu)成的角度為三螺旋擺動(dòng)角度,仰視圖中軌跡構(gòu)成的形狀為三螺旋擺動(dòng)方向.結(jié)果顯示,所有模型在溶液中均存在一定的擺動(dòng)角度,abc中擺動(dòng)角度約為 30°,而擺動(dòng)方向的集合近似圓形(圖2(a)).與abc相比,Ala 突變后擺動(dòng)更加明顯.a′bc擺動(dòng)方向的集合呈橢圓形,擺動(dòng)角度增加至40°(圖2(b)).與a′bc相似,ab′c和abc′的擺動(dòng)角度約為40°(圖2(c—d)),但擺動(dòng)方向也近似圓形.在多點(diǎn)突變體中發(fā)現(xiàn)了更大的擺動(dòng),與單點(diǎn)突變相比,擺動(dòng)的角度增加了10°,約為50°(表1).同時(shí),擺動(dòng)的形狀仍然大致呈圓形.結(jié)果表明,突變后主鏈整體結(jié)構(gòu)受到破壞,擺動(dòng)角度均有增加;突變引入的越多,擺動(dòng)角度增加越多.而擺動(dòng)方向的集合則出現(xiàn)不規(guī)則變化,有時(shí)與abc一致保持圓形,有時(shí)則變?yōu)闄E圓形.雖然晶體中三螺旋往往呈棒狀結(jié)構(gòu),但是在水溶液中會(huì)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)形變,導(dǎo)致分子在各個(gè)方向上的擺動(dòng)[47].引入突變后,發(fā)生較大的擺動(dòng)角度與方向的變化,可能與突變引發(fā)的局部結(jié)構(gòu)形變有關(guān).

圖2 從abc 和突變體的MD 軌跡中提取主鏈結(jié)構(gòu)Fig.2 Main chain movement extract from MD trajectory of abc and single chain mutants

2.3 Cα 三角形

在膠原蛋白中,由于G-X-Y 序列的重復(fù),可以將其運(yùn)動(dòng)軌跡視為一系列三角形的位移[36],而每一個(gè)三角形的面積可以表示為該區(qū)域的解旋程度.為了描述Gly-Ala 突變后局部區(qū)域結(jié)構(gòu)的變化,排除N-與C-端的擺動(dòng)影響,提取軌跡5 000 幀軌跡,計(jì)算第13—18 個(gè)三角形的平均邊長(zhǎng)與面積(圖3(a)).以Cα 為頂點(diǎn),三角形在膠原中的結(jié)構(gòu)如圖3(a)所示,Gly 以紫色表示,按照右手螺旋選取A1、A2,表示的氨基酸在圖中標(biāo)出.

圖3 Cα 構(gòu)成的三角形以及突變后邊長(zhǎng)與面積變化Fig.3 The change of side length and area after mutation in Cα triangle

abc中三角形的邊長(zhǎng)為(4.81±0.09)?,同時(shí)三角形的平均面積為(10.28±0.10)?2,每個(gè)區(qū)域表現(xiàn)為一個(gè)邊長(zhǎng)為4.8 ? 的等邊三角形,表明在未突變時(shí)3 條鏈的距離相近且變化較小,結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定(圖3(b—d)).在突變體中,Gly-A1邊長(zhǎng)增加(a′bc的第15 個(gè)、ab′c的第16 個(gè)、abc′的第17 個(gè)三角形),增量為1.03～ 1.33 ?.同時(shí)A1-A2邊長(zhǎng)也出現(xiàn)增加(a′bc的第16 個(gè)、ab′c的第17 個(gè)、abc′的第18 個(gè)三角形),最大增量為1.58 ?.由于邊長(zhǎng)增加,相對(duì)應(yīng)的三角形面積也出現(xiàn)增加,這些三角形分別為a′bc的第14—16 個(gè)、ab′c的第15—16 個(gè)、abc′的第16—17 個(gè)三角形(圖3(e)),增量最大依次為(1.52 ±0.97)?2、(1.79±1.28)?2、(1.40±0.95)?2.結(jié)果表明,由于Gly 變?yōu)閭?cè)鏈更大的Ala,雖然在整體上依舊保持三螺旋的膠原結(jié)構(gòu),但是突變所在三角形的Gly-A1邊長(zhǎng),以及相鄰且位于C 端的三角形的A1-A2邊長(zhǎng)增加,同時(shí)伴隨對(duì)應(yīng)面積的增大.為了觀察多點(diǎn)突變對(duì)局部結(jié)構(gòu)的影響,在雙鏈突變中計(jì)算三角形的邊長(zhǎng)與面積.在a′b′c突變體中,突變的引入會(huì)增加第15—16 個(gè)三角形的Gly-A1邊長(zhǎng),以及第16—17 個(gè)三角形的A1-A2邊長(zhǎng).面積的增加出現(xiàn)在第14—17 個(gè)三角形,而突變區(qū)域第14—18 個(gè)三角形的平均面積為(11.57±0.75)?2.與單鏈相比,影響的區(qū)域具有一定的疊加性,包含a,b鏈單點(diǎn)突變時(shí)的區(qū)域(第14—17 個(gè)三角形).其中b鏈突變所在的三角形面積變化最大,增大(2.60±1.18)?2.在ab′c′突變體中,與a、b鏈組合突變類似,當(dāng)組合b、c鏈突變后,邊長(zhǎng)與面積的增加區(qū)域?yàn)閱捂溚蛔兊寞B加: 第16—17 個(gè)三角形的Gly-A1邊長(zhǎng),以及第17—18 個(gè)三角形的A1-A2邊長(zhǎng)增加;第16—18 個(gè)三角形的面積增大,最大的一個(gè)增加了(3.34±1.53)?2.與其他兩個(gè)雙點(diǎn)突變體不同,a′bc′突變體雖然導(dǎo)致了整體面積的增大((10.69±0.73)?2),但影響的區(qū)域(第15—18 個(gè)三角形)小于兩個(gè)單鏈突變區(qū)域(第14—18 個(gè)三角形)的疊加,三角形面積增大(1.77±0.15)?2.同時(shí)引入3 個(gè)點(diǎn)的突變,a′b′c′突變體,也僅僅是影響到了4 個(gè)三角形的面積.結(jié)果顯示,當(dāng)突變發(fā)生在相鄰兩個(gè)三角形區(qū)域時(shí),變化的區(qū)域包含單點(diǎn)突變所在的區(qū)域,而當(dāng)突變出現(xiàn)在相隔三角形時(shí)(a′bc′),變化的區(qū)域大于單點(diǎn)突變,小于兩個(gè)單點(diǎn)突變的和.三點(diǎn)突變則表現(xiàn)為大于單點(diǎn)突變、小于3 個(gè)突變的數(shù)值之和.

2.4 梯階參數(shù)

為了解析膠原蛋白突變前后運(yùn)動(dòng)模式的變化,利用6 種梯階參數(shù),將膠原的結(jié)構(gòu)形變分解為一系列Cα 三角形的旋轉(zhuǎn)與位移,計(jì)算突變前后參數(shù)的變化,第14—18 個(gè)梯階參數(shù)變化平均值如表1 所示.在3 個(gè)單點(diǎn)突變體中,突變所在的及相鄰N 端梯階Tilt 值增加(a′bc的第14—15 個(gè)梯階,ab′c的第15—16 個(gè)梯階,abc′的第16—17 個(gè)梯階),增加分別為6.67°(a′bc)、5.77°(ab′c)、7.82°(abc′)(圖4(a)).在相同區(qū)域中Twist 的絕對(duì)值變大(圖4(b)),最大變化量分別為 —8.34°(a′bc)、—12.96°(ab′c)、—14.28°(abc′).雙點(diǎn)突變體中,a′b′c中Tilt 值在第15—16 步變大(8.32°、6.21°),而Twist 值在第14—17 步均有增大,最大增量—13.77°,包括了兩個(gè)單鏈突變位點(diǎn).與之類似地,ab′c′、a′bc′中Tilt 與Twist 變化區(qū)域包含組合的兩個(gè)突變.三點(diǎn)突變體a′b′c′雖然在最大變化量上大于雙點(diǎn)突變,但是在變化的區(qū)域上沒(méi)有影響更多的梯階.這一結(jié)果與面積參數(shù)變化相似,在相鄰與相隔三角形發(fā)生的突變會(huì)影響其變化區(qū)域的疊加程度.

圖4 類膠原多肽結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化Fig.4 Changes of structural parameters of CMP

膠原構(gòu)象與參數(shù)之間的耦合程度可以通過(guò)梯階參數(shù)兩兩關(guān)聯(lián)得到的散點(diǎn)圖展現(xiàn),擬合橢圓區(qū)域進(jìn)行可視化.采用2D 置信區(qū)間擬合,取值95%擬合變化程度最大的Tilt 與Twist 參數(shù),如果構(gòu)成的橢圓與x軸形成的角度在(45±25)°,同時(shí)長(zhǎng)短軸之比大于1.2 則認(rèn)為這兩個(gè)參數(shù)具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性.abc及單點(diǎn)突變所在三角形的Twist-Tilt 的橢圓值如表1 所示.結(jié)果顯示,在abc中Twist-Tilt 參數(shù)之間顯示了良好的相關(guān)性(表1),表現(xiàn)為狹長(zhǎng)的橢圓,長(zhǎng)軸與x軸的夾角為38°,長(zhǎng)短軸之比為3.06,這表明Tilt 與Twist 之間有較高的耦合度.引入突變后,Twist-Tilt 的分布更廣泛(圖5(a—c)),橢圓區(qū)域面積變大,并且往圖形右下角偏移,即Tilt 由負(fù)變正,Twist 絕對(duì)值增大.同時(shí)皮爾森相關(guān)系數(shù)分別為—0.80(abc)、—0.67(a′bc)、—0.45(ab′c)、—0.31(abc′),在大于100 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)時(shí),相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.3就表現(xiàn)為良好的相關(guān)性.Ala 突變側(cè)鏈增加一個(gè) -CH3,膠原內(nèi)部空間位阻增加(圖5(d—f)),Tilt 值由負(fù)轉(zhuǎn)正,耦合Twist 絕對(duì)值增大,導(dǎo)致三螺旋局部結(jié)構(gòu)彎曲,與前文中發(fā)現(xiàn)的擺動(dòng)幅度增大相一致.

圖5 單點(diǎn)突變體與abc 相應(yīng)步驟Twist-Tilt 的散點(diǎn)圖Fig.5 Scatter plot of abc and corresponding Twist-Tilt step in single mutants

2.5 氫鍵與形變分?jǐn)?shù)相關(guān)

為了描述膠原結(jié)構(gòu)的整體變化,在第7—22 個(gè)梯階中利用公式(1),結(jié)合6 個(gè)梯階參數(shù),計(jì)算不同突變體的形變分?jǐn)?shù)(deformation score).結(jié)果顯示,與abc相比,突變會(huì)增大附近區(qū)域中各梯階的形變分?jǐn)?shù)(圖4(c)).在單點(diǎn)突變中c鏈影響4 個(gè)梯階,其余兩個(gè)均只影響3 步梯階,形變分?jǐn)?shù)平均值排序?yàn)閍bc′(69.88)＞ab′c(59.44)＞a′bc(47.24),表明在不同的鏈中引入的突變導(dǎo)致不同程度的結(jié)構(gòu)形變.

Gly 作為膠原蛋白主鏈氫鍵氫供體,同時(shí)作為梯階參數(shù)三角形的頂點(diǎn),氫鍵變化可能與梯階參數(shù)的變化有關(guān).為了探索氫鍵能量變化(ΔEHB)和形變分?jǐn)?shù)變化(ΔEDS)之間的相關(guān)性,選取第7—22個(gè)三角形內(nèi)包含的氫鍵,計(jì)算膠原在模擬時(shí)間內(nèi)的氫鍵平均能量與結(jié)構(gòu)的平均形變分?jǐn)?shù),去除包含鹽橋變化的結(jié)構(gòu)區(qū)間與相關(guān)氫鍵,整合7 種突變體的數(shù)據(jù),擬合了每一個(gè)氫鍵ΔEHB和與之對(duì)應(yīng)梯階ΔEDS之間的相關(guān)性(圖6).當(dāng)ΔEHB為0 時(shí),ΔEDS的數(shù)值也在0 附近,表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.隨著突變位點(diǎn)的引入,氫鍵被破壞,ΔEHB的值增加.同時(shí),膠原蛋白的整體結(jié)構(gòu)被破壞,ΔEDS的值增加.在0.01 顯著性水平上,在數(shù)據(jù)點(diǎn)大于80 時(shí)當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于0.5 就表現(xiàn)為較好的相關(guān)性[48],擬合得到R2為0.76.結(jié)果表明,突變不僅破壞了局部的氫鍵,而且導(dǎo)致了膠原三螺旋的形變.

圖6 突變體氫鍵能量變化與對(duì)應(yīng)區(qū)域形變分?jǐn)?shù)的相關(guān)性Fig.6 The correlation between the hydrogen bond energy change of the mutant and the deformation score of the corresponding region

3 討 論

本文通過(guò)在abc異三聚體3 條鏈中引入Gly-Ala 突變,利用DSC 實(shí)驗(yàn)測(cè)定了突變體熱穩(wěn)定性,采集了分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡中的結(jié)構(gòu)信息,表征突變前后的變化.結(jié)果顯示,突變引入后熱穩(wěn)定性降低,單點(diǎn)突變降低15℃,雙點(diǎn)及三點(diǎn)突變體無(wú)明顯焓變.分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果表明,Gly-Ala 突變的鄰近區(qū)域發(fā)生了結(jié)構(gòu)的變化,包括突變所在Cα 三角形的Gly-A1邊長(zhǎng)與相鄰C 端Cα 三角形的A1-A2邊長(zhǎng)顯著增加;隨著突變個(gè)數(shù)的增加,Cα 三角形的最大面積增量呈上升趨勢(shì),增量排序?yàn)槿c(diǎn)突變(4.82 ?2)＞雙點(diǎn)突變(3.67 ?2)＞單點(diǎn)突變(1.99 ?2),這表明面積的變化具有一定的疊加性;同時(shí)在梯階參數(shù)中,突變所在區(qū)域彎曲度增加,Twist-Tilt 分布范圍變大,Tilt 值增量范圍為2.01°～9.11°,Twist 值減量范圍為8.33°～15.61°;突變位點(diǎn)附近1—3 個(gè)氫鍵受到破壞.Ala 突變不僅破壞了膠原的局部結(jié)構(gòu),而且影響了膠原分子的整體運(yùn)動(dòng)模式,擺動(dòng)角度隨著突變的引入增加10°以上.擺動(dòng)方向在不同的突變中呈現(xiàn)不同的趨勢(shì),例如:ab′c突變體擺動(dòng)方向呈現(xiàn)出與原序列類似的隨機(jī)分布,而a′bc突變體則出現(xiàn)了特定方向的傾向性;突變體形變分?jǐn)?shù)和氫鍵能量與原序列相比有著顯著增加,兩者的變化具有高相關(guān)性.表明突變導(dǎo)致三螺旋局部解折疊,熱穩(wěn)定性下降及焓變降低,同時(shí)局部結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致膠原分子整體形狀與運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的改變.

膠原蛋白G-X-Y 重復(fù)序列中的Gly 被更大的氨基酸替代會(huì)導(dǎo)致各種表型的成骨不全癥,大多數(shù)Gly→Ala 的突變是溫和且不致命的[7,9].天然膠原中OI 突變的不穩(wěn)定性在短肽模型中會(huì)被放大,這可能是由于類膠原短肽中更短的序列和更高的亞氨基含量.在之前的研究中,將Gly-Ala 突變引入(GPO)10同源三聚體后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,結(jié)果顯示,突變后整體結(jié)構(gòu)擺動(dòng)幅度增加,平均增量為2°[47].盡管該模型可以模擬膠原蛋白中Gly 突變,但它們不能準(zhǔn)確地解釋在天然異源三聚體突變中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)破壞.本研究中使用的abc異三聚體模型相較于傳統(tǒng)的高脯氨酸含量膠原序列柔性更高,模擬中原序列的擺動(dòng)角度為30°,突變體的擺動(dòng)角度的增量均在10°以上.原纖維中的研究發(fā)現(xiàn),Gly 位置的突變會(huì)使分子彎曲,突變分子與正常分子共聚時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致原纖維的形成延遲,影響纖維形貌[49-50],成骨不全動(dòng)物模型中常出現(xiàn)形貌異常的原纖維[51-52].由此推測(cè),點(diǎn)突變導(dǎo)致的三螺旋曲度變化,除了可以降低膠原蛋白的熱穩(wěn)定性,還可能影響膠原纖維的形成,從而影響其力學(xué)性質(zhì)、纖維礦化、骨骼形成等與成骨不全癥相關(guān)的生理病理過(guò)程.

本文將突變引入不同的3 條鏈,結(jié)果表明不同鏈上Ala 突變對(duì)結(jié)構(gòu)破壞存在如下差異: 在b鏈與c鏈中出現(xiàn)更嚴(yán)重的氫鍵破壞,最大ΔEHB為1.15 kcal·mol—1;3 種單點(diǎn)突變體呈現(xiàn)不同的擺動(dòng)方向,a′bc突變體擺動(dòng)方向相較于ab′c、abc′傾向性更為明顯;Cα 三角形面積變化中,a′bc突變體只有1 個(gè)三角形的增量超過(guò)1 ?2,而ab′c與abc′突變體中均有2 個(gè).在不同的膠原主體序列中也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(shì),肖建喜等[53-54]在包含天然膠原序列的同源三聚體中引入Ala 突變,NMR 結(jié)果顯示在不同鏈上的Ala 對(duì)鏈間氫鍵的破壞出現(xiàn)區(qū)別,Hartgerink 等利用異三聚體模型AAB 也觀察到了相似的現(xiàn)象[31-32].這可能是因?yàn)槟z原3 條鏈中突變位點(diǎn)所處化學(xué)環(huán)境存在差異,相同突變會(huì)有著不同的影響效果.本文結(jié)合實(shí)驗(yàn)與計(jì)算方法,解析了Gly→Ala 突變對(duì)臨近區(qū)域和整體運(yùn)動(dòng)模式的影響,研究了OI 對(duì)膠原結(jié)構(gòu)在生物物理方面的作用,為進(jìn)一步揭示成骨不全癥等相關(guān)膠原疾病的致病機(jī)理打下了理論基礎(chǔ).