護(hù)肝抗病毒方對(duì)小鼠2種實(shí)驗(yàn)性肝炎的保肝作用 *

章猛高 喻宏偉 黃鵬飛 劉國(guó)泰

（撫州市臨川區(qū)第二人民醫(yī)院中醫(yī)科，江西 撫州 344000）

護(hù)肝抗病毒方系本課題組治療肝炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由葉下珠、柴胡、當(dāng)歸、丹參、白芍、白術(shù)、茯苓、五味子、豬苓、薏苡仁、土茯苓、矮地茶、板藍(lán)根組成，該方經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐應(yīng)用，對(duì)急、慢性病毒性肝炎均有較好療效。本課題旨在通過實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證評(píng)價(jià)該方的保肝作用。為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄兼用。由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 受試藥物護(hù)肝抗病毒方組成：葉下珠15 g，柴胡6 g，當(dāng)歸10 g，丹參10 g，白芍12 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，五味子10 g，豬苓10 g，薏苡仁10 g，土茯苓15 g，矮地茶15 g，板藍(lán)根10 g。藥物由撫州市臨川區(qū)第二人民醫(yī)院中藥房提供，應(yīng)用劑型為傳統(tǒng)湯劑，用煎煮法制取湯液，濃縮成1 g/mL（按生藥計(jì)）濃度的藥液，放冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)以生理鹽水稀釋后灌胃給藥。對(duì)照藥物：聯(lián)苯雙酯滴丸（萬邦德制藥集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021305）。

1.3 試劑刀豆蛋白A（ConA）、D-氨基半乳糖，購自Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 護(hù)肝抗病毒方對(duì)D-氨基半乳糖致小鼠肝損傷模型的作用取昆明種小鼠60 只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、護(hù)肝抗病毒方高、中、低劑量組、聯(lián)苯雙酯組，共6組。護(hù)肝抗病毒方高、中、低劑量組分別給予護(hù)肝抗病毒方煎劑12.0 g/kg、6.0 g/kg、3.0 g/kg（按生藥計(jì)）灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯滴丸4.5 mg/kg 灌胃，正常對(duì)照組和模型組等體積生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)5 d。末次給藥后2 h，腹腔注射給予8%的D-氨基半乳糖0.1 mL/10 g，注射后2 h 再給予食物，于注射40 h 后禁食12 h，全部小鼠眼眶取血，離心分離血清，測(cè)定ALT、AST。解剖小鼠，稱取肝臟組織0.4 g，加9 倍冷生理鹽水，勻漿，離心后取上清液，按試劑盒說明書測(cè)定SOD、MDA。

1.4.2 護(hù)肝抗病毒方對(duì)ConA 誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的影響取昆明種小鼠60 只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄兼用。分組同1.4.1。除正常對(duì)照組外，其余各組采用ConA 誘導(dǎo)免疫性肝損傷法，將小鼠四肢固定后，碘伏消毒小鼠尾部，于尾靜脈注射ConA，劑量為18 mg/kg。從注射ConA 當(dāng)天開始，護(hù)肝抗病毒方高、中、低劑量組分別給予護(hù)肝抗病毒方煎劑12.0 g/kg、6.0 g/kg、3.0 g/kg（按生藥計(jì)）灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯滴丸4.5 mg/kg 灌胃，空白對(duì)照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)21 d。于末次給藥后的4 h 再次尾靜脈注射ConA（劑量18 mg/kg），注射12 h 后全部小鼠眼眶取血，常規(guī)分離血清，測(cè)定ALT、AST。解剖小鼠，稱取肝臟組織0.4 g，加9 倍冷生理鹽水，勻漿，離心后取上清液，按試劑盒說明書測(cè)定SOD、MDA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以（±s）表示，行x2分析、t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 護(hù)肝抗病毒方對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清ALT、AST、SOD、MDA 含量的影響與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 均明顯升高，表明D-氨基半乳糖造成了小鼠肝損傷。與模型組比較，護(hù)肝抗病毒方各劑量組小鼠ALT、AST 均有顯著降低（P＜0.01），說明護(hù)肝抗病毒方對(duì)D-氨基半乳糖造成的小鼠肝損傷有保護(hù)作用。見表1。

表1 護(hù)肝抗病毒方對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清ALT、AST、含量的影響（±s，U/L）

表1 護(hù)肝抗病毒方對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清ALT、AST、含量的影響（±s，U/L）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組護(hù)肝抗病毒方組劑量/（g/kg）聯(lián)苯雙酯組AST 35.26±3.43 87.34±9.721）48.23±5.142）46.78±4.922）52.43±5.372）42.76±4.532）12.0 6.0 3.0 0.0045鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 ALT 37.28±3.86 124.36±13.521）70.45±7.232）65.61±6.562）72.16±7.322）64.79±6.542）

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織MDA明顯升高、SOD 明顯下降。與模型組比較，護(hù)肝抗病毒方各劑量組小鼠肝組織MDA 水平均顯著降低（P＜0.01），肝組織SOD水平均顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 護(hù)肝抗病毒方對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD含量的影響（±s）

表2 護(hù)肝抗病毒方對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD含量的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組護(hù)肝抗病毒方組SOD/（U/mg prot）162.39±15.81 95.28±10.241）139.45±15.422）148.23±15.722）138.54±14.332）137.28±15.522）劑量/（g/kg）聯(lián)苯雙酯組12.0 6.0 3.0 0.0045鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 MDA/（nmol/mg prot）24.76±2.98 42.65±5.391）28.62±3.482）26.35±2.912）29.64±3.152）26.51±2.872）

2.2 護(hù)肝抗病毒方對(duì)ConA 致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST、SOD、MDA 含量的影響與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 均明顯升高，說明模型組小鼠有明顯肝損傷。與模型組比較，護(hù)肝抗病毒方各劑量組小鼠ALT、AST 均有顯著降低（P＜0.01），說明護(hù)肝抗病毒方對(duì)ConA 誘導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠有明顯的保肝作用。見表3。

表3 護(hù)肝抗病毒方對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST含量的影響（±s，U/L）

表3 護(hù)肝抗病毒方對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST含量的影響（±s，U/L）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組護(hù)肝抗病毒方組劑量/（g/kg）聯(lián)苯雙酯組AST 30.59±3.16 82.37±8.121）47.24±5.532）43.76±4.122）49.28±4.342）42.35±4.272）12.0 6.0 3.0 0.0045鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 ALT 31.72±3.49 112.36±12.541）69.43±7.232）63.48±6.592）70.56±7.812）62.14±6.322）

與正常對(duì)照組比較，免疫性肝損傷模型組小鼠肝組織MDA 明顯升高、SOD 明顯下降。與模型組比較，護(hù)肝抗病毒方各劑量組小鼠肝組織MDA 水平均顯著降低（P＜0.01），肝組織SOD 水平均顯著升高（P＜0.01）。見表4。

表4 護(hù)肝抗病毒方對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD含量的影響（±s）

表4 護(hù)肝抗病毒方對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD含量的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組護(hù)肝抗病毒方組劑量/（g/kg）聯(lián)苯雙酯組SOD/（U/mg prot）158.72±16.54 94.35±9.681）143.32±15.432）148.29±14.922）139.56±14.332）136.24±13.522）12.0 6.0 3.0 0.0045鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 MDA/（nmol/mg prot）24.13±2.86 42.92±5.641）28.78±3.532）25.74±2.752）29.32±3.612）26.57±3.292）

3 討論

護(hù)肝抗病毒方由葉下珠、柴胡、當(dāng)歸、丹參、白芍、白術(shù)、茯苓、五味子、豬苓、薏苡仁、土茯苓、矮地茶、板藍(lán)根組成。方中柴胡疏肝解郁；當(dāng)歸、丹參、白芍養(yǎng)血活血、養(yǎng)陰柔肝；白術(shù)、茯苓、五味子健脾扶正；豬苓、薏苡仁滲利肝膽濕熱；葉下珠、土茯苓、矮地茶、板藍(lán)根清熱利濕抗病毒。現(xiàn)代藥理研究［1，2］表明，柴胡主要活性成分柴胡皂苷有抗炎、抗病毒、保護(hù)肝臟、抑制肝纖維化進(jìn)展的作用；當(dāng)歸具有保肝和調(diào)節(jié)免疫作用［3］；丹參具有保肝和抗肝纖維化作用［4，5］；白芍及其主要成分白芍總苷有顯著的保肝作用［6，7］；五味子具有良好的保肝降酶作用［8，9］；茯苓能抑制乙肝病毒并且有保護(hù)肝臟的作用［10，11］；矮地茶又名平地木，有抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)肝臟、清利濕熱等藥理作用［12，13］；土茯苓中的類黃酮組分有保肝作用［14］；板藍(lán)根有抗肝炎病毒作用［15，16］。方中諸藥合用，對(duì)病毒性肝炎能夠發(fā)揮中醫(yī)藥的綜合性整體治療作用優(yōu)勢(shì)。

以D-氨基半乳糖造成的肝損傷模型是常用的實(shí)驗(yàn)性肝炎模型，能較準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞的功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化。用ConA 誘導(dǎo)的免疫性肝損傷模型與人類病毒性肝炎的病理生理過程類似［17，18］。本研究結(jié)果顯示護(hù)肝抗病毒方對(duì)上述2 種實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型小鼠均有顯著的保肝作用，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了護(hù)肝抗病毒方的保肝藥效，說明此方具有較高的應(yīng)用價(jià)值。