秦巴山區(qū)羊肚菌穩(wěn)產(chǎn)菌株的選育

霍文嚴(yán) 喬 婷 賀雪蓮 戴 璐 劉 愚 祁 鵬 張黎光 路鵬鵬 江 鑫 李峻志

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

羊肚菌，隸屬于子囊菌門，盤菌亞門，又名草笠竹，羊肚菜，因其菌蓋表面凹凸不平，形似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌的味道鮮美，香味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，保健功效齊全，是一種享譽(yù)世界的高檔食材，素有“食用菌皇后”之美名。我國自2012年實(shí)現(xiàn)羊肚菌商業(yè)化栽培以來，其人工栽培面積不斷擴(kuò)大，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2021—2022 年生產(chǎn)周期，全國羊肚菌栽培面積近20 000 hm2。

羊肚菌同有些食用菌品種一樣，種性經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)“退化”現(xiàn)象，表現(xiàn)為菌絲生長變慢，分支減少，活力衰退，產(chǎn)量降低甚至絕產(chǎn)等，最終造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[3-8]。

近年來，陜西省秦巴山區(qū)的食用菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，特別是羊肚菌栽培規(guī)模已近4 000 hm2；但在發(fā)展羊肚菌生產(chǎn)的過程中，當(dāng)?shù)匾灿龅街T如菌種質(zhì)量不穩(wěn)定、種性易退化等問題。因此，選育獲得適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境特點(diǎn)且不易退化的穩(wěn)產(chǎn)羊肚菌菌株成為促進(jìn)當(dāng)?shù)厥秤镁a(chǎn)業(yè)健康有序發(fā)展的關(guān)鍵。在廣泛收集羊肚菌菌株的基礎(chǔ)上，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中的菌株穩(wěn)定性與生產(chǎn)穩(wěn)定性的相關(guān)性研究，選育獲得能夠適應(yīng)秦巴山區(qū)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境的穩(wěn)產(chǎn)羊肚菌菌株，為實(shí)現(xiàn)秦巴山區(qū)羊肚菌高效穩(wěn)定的商業(yè)化栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株

供試菌株均由陜西省微生物研究所真菌研究中心從各地區(qū)采集并經(jīng)分離、純化獲得，具體編號(hào)、采集地及子實(shí)體形態(tài)見表1。

表1 供試羊肚菌菌株基本情況

（2）培養(yǎng)基及外源營養(yǎng)袋配方

PDA 培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 自然。栽培種培養(yǎng)基：小麥粒50%，雜木屑30%，麩皮9%，生石灰1%，自然土10%。料含水量≥60%，裝入聚乙烯袋（15 cm×22 cm）中，121 ℃高壓滅菌3 h。外源營養(yǎng)袋：小麥粒52%，玉米芯40%，生石灰1%，石膏1%，磷酸二氫鉀0.15%，自然土6%。料含水量≥55%，裝入聚乙烯袋（15 cm×22 cm），121 ℃高壓滅菌3 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離、純化、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

1.2.1.1 菌株的分離、純化

采用組織分離法分離、純化菌株。將采集新鮮羊肚菌子實(shí)體清洗干凈后，于超凈工作臺(tái)中用75%的酒精消毒表面，隨后切取菌柄與菌蓋連接處的組織塊（指甲蓋狀）接種于PDA培養(yǎng)基上，于23 ℃培養(yǎng)2～3 d。待長出新的菌絲后，鏟取菌落邊緣的菌絲塊接種至空白PDA 培養(yǎng)基上，23 ℃培養(yǎng)2～3 d，同樣鏟取菌落的菌絲塊接種至空白PDA 上培養(yǎng)。如此反復(fù)以上操作，直至獲得無雜菌污染的純菌株，于-80 ℃冰箱中保藏備用。

1.2.1.2 分離菌株鑒定

將純化的羊肚菌菌株接種至PDA 培養(yǎng)基，于23 ℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板后，刮取部分菌絲用于提取DNA。使用真菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物科技有限公司）提取基因組DNA。用通用引物ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴(kuò)增ITS 序列，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。50 μL 反應(yīng)體系：2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各 2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 70 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物直接交由北京擎科生物科技股份有限公司測序。所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析，并結(jié)合形態(tài)學(xué)進(jìn)化分離純化菌株種屬的鑒定。

1.2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從NCBI 網(wǎng)站下載六妹羊肚菌M.sextelata及梯棱羊肚菌M.importuna的ITS 序列（GeneBank 號(hào)分別為KX809733、MG121861）。用MEGA 7.0 對(duì)所獲得的ITS 序列進(jìn)行組裝、校對(duì)、編輯以及多序列比對(duì)。以Morchella rufobrunnea（JX292973）作為外類群，用MEGA7 軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.2.2 菌株穩(wěn)定性檢測

采用連續(xù)傳代培養(yǎng)的方法檢測羊肚菌菌株的遺傳穩(wěn)定性及其是否容易發(fā)生退化。以16株分離、純化的羊肚菌菌株作為出發(fā)菌株，用無菌的打孔器制備直徑為5 mm 的接種塊，接種于PDA 固體培養(yǎng)基平板（直徑15 cm）的邊緣，置23 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)8～10 d。將以上培養(yǎng)獲得的菌絲體作為第一代菌株，于菌絲尖端打孔制備接種塊，接種于PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。重復(fù)以上操作使羊肚菌菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)6～7 代，并測定記錄每一代菌株的菌絲生長速度及其菌落的形態(tài)特征。

1.2.3 初篩

生產(chǎn)菌種的制備：將前期儲(chǔ)藏于-80 ℃冰箱的16 株羊肚菌菌株活化后，接種于PDA 培養(yǎng)基，置23 ℃培養(yǎng)3～6 d。將以上復(fù)活后菌株接種于栽培種培養(yǎng)料中，20 ℃暗光培養(yǎng)25～30 d，待菌絲長滿料袋后繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d作為生產(chǎn)菌種。

選址和建棚：選擇土質(zhì)疏松潮濕、排水良好的地塊（試驗(yàn)大棚位于陜西省商洛市柞水縣下梁鎮(zhèn)西川村），搭建6 m×35 m×3 m 規(guī)格的拱棚，棚上覆蓋遮陽網(wǎng)，避免強(qiáng)光直射。

播種及菌絲生長期管理：11 月上旬至下旬播種。于棚內(nèi)作栽培畦，畦高15 cm，將栽培畦分割為面積5 m2的小區(qū)（寬1.5 m，長3.3 m，小區(qū)間的距離為0.3 m）。每株供試菌株播種3 個(gè)小區(qū)。在栽培畦上挖深20～25 cm 播種溝，然后將掰成核桃狀的菌種塊均勻撒在溝內(nèi)，播種量為0.5 袋/m2，播種后覆蓋10～15 cm 的自然土并適當(dāng)噴水。菌絲生長期間，主要是土壤含水量的管理，控制土壤含水量 20%～25%即可。

放置營養(yǎng)袋：播種后約10 d，開始放置外源營養(yǎng)袋，在營養(yǎng)袋的一面劃一道10 cm 長口，營養(yǎng)袋劃口的一面朝向畦面平放，稍壓一下袋，使羊肚菌菌絲可以直接接觸營養(yǎng)袋中的培養(yǎng)料。羊肚菌菌絲將慢慢長入營養(yǎng)袋中吸收營養(yǎng)，并向土層內(nèi)的菌絲傳送。每個(gè)小區(qū)均勻放置20～30袋營養(yǎng)袋。

出菇管理：羊肚菌出菇管理期間，應(yīng)保持大棚溫度10～18 ℃、空間相對(duì)濕度80%～90%、土壤含水量15%～25%；每天早、晚各通風(fēng)1 h，保證菌絲生長期間有足夠的新鮮空氣。隨著氣溫的下降，在12 月中旬最低氣溫大約5 ℃時(shí)，在拱棚上加蓋薄膜保溫。

采摘及記錄：子實(shí)體出土7～10 d 后便可生長成熟，一般菌蓋顏色變淺、表面蜂窩狀凹陷充分伸展即可采收。管理及采收期間觀察記錄出菇時(shí)間、子實(shí)體形態(tài)等信息，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析小區(qū)產(chǎn)量。

1.2.4 復(fù)篩

根據(jù)初篩試驗(yàn)結(jié)果，選擇出菇狀況良好的菌株作為出發(fā)菌株，于PDA 培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)5 代（約40 d）后，用于復(fù)篩試驗(yàn)。于2021—2022 年在陜西省商洛市柞水縣進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。根據(jù)初篩試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整營養(yǎng)袋放置方式，即將劃口數(shù)量由1 道變?yōu)?道，以使菌絲能充分利用營養(yǎng)袋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)。每株供試菌株的栽培面積為30 m2/小區(qū)（寬1.5 m，長20 m，小區(qū)間的距離為0.3 m），3次重復(fù)。記錄羊肚菌出菇情況，選擇具有穩(wěn)定結(jié)實(shí)能力的菌株進(jìn)入中試。

1.2.5 中試試驗(yàn)

將復(fù)篩所得的菌株于PDA 培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)5 代（約40 d）后，用于中試試驗(yàn)。于2022—2023 年在陜西省商洛市柞水縣進(jìn)行中試試驗(yàn)。根據(jù)復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化播種方式，即將覆土層厚度調(diào)整為6～9 cm，既可保證土壤含水量和保溫效果，又利于通氣。每株供試菌株的栽培面積為50 m2/小區(qū)（寬1.5 m，長33 m，小區(qū)間的距離為0.3 m），3次重復(fù)。試驗(yàn)記錄羊肚菌出菇情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

由圖1 可知，羊肚菌菌株SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 與梯棱羊肚菌M.importuna聚為一支，支持率達(dá)100%，其他菌株與六妹羊肚菌M.sextelata聚為一支，支持率達(dá)92%。根據(jù)16株菌株ITS 序列在NCBI 中的比對(duì)分析結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析可知，菌株SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 均為梯棱羊肚菌M.importuna，其他菌株為六妹羊肚菌M.sextelata。

2.2 菌株穩(wěn)定性

將16株菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上，每隔8～10 d取菌落頂端的菌絲塊傳代一次，并記錄每代菌株的菌絲生長速度及菌落的形態(tài)特征，結(jié)果見圖2、圖3，表2。

圖2 羊肚菌菌絲菌落形態(tài)（初始菌株，于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 d）

圖3 羊肚菌菌絲菌落形態(tài)（連續(xù)繼代培養(yǎng)56 d）

表2 繼代培養(yǎng)過程中羊肚菌菌絲生長速率變化 單位：cm/d

由表2 可知，當(dāng)羊肚菌菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)至第56 天，SMM-01、SMM-03、SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13菌株的菌絲生長速度（平均長速，下同）未發(fā)生明顯的變化，其他菌株的菌絲生長速度都顯著變慢。

由圖2 可知，16 株初始羊肚菌菌株菌絲生長速度都較快，菌落邊緣都較為整齊，未出現(xiàn)棉絮狀的菌落，也未產(chǎn)生明顯色素。

由圖3 可知，當(dāng)羊肚菌菌株連續(xù)繼代培養(yǎng)至第56 天，菌株SMM-04、SMM-16 菌絲生長完全停滯；菌株SMM-02、SMM-05、SMM-10、SMM-14 的菌落呈棉絮狀，邊緣不整齊，且色素明顯；菌株SMM-01、SMM-03、SMM-08、SMM-09、SMM-15 的菌落邊緣不整齊，且色素明顯；菌株SMM-13的色素明顯。

2.3 初篩試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，初篩試驗(yàn)，羊肚菌SMM-04、SMM-05、SMM-08、SMM-09、SMM-10、SMM-15 菌株都未出菇；SMM-01、SMM-02、SMM-03、SMM-14 菌株雖正常出菇，但產(chǎn)量普遍較低（均低于900 kg/hm2），且出菇時(shí)間明顯長于其他菌株；SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 菌株出菇表現(xiàn)良好，產(chǎn)量均高于1 350 kg/hm2，且出菇時(shí)間較短。羊肚菌菌株SMM-06、SMM-07用于后續(xù)的復(fù)篩試驗(yàn)。

表3 初篩試驗(yàn)結(jié)果

2.4 復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，復(fù)篩試驗(yàn)，羊肚菌SMM-06、SMM-07 菌株都能正常出菇，且產(chǎn)量及出菇時(shí)間同初篩試驗(yàn)結(jié)果相比，未發(fā)生顯著的變化。

表4 復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果

表5 中試試驗(yàn)結(jié)果

2.5 中試試驗(yàn)結(jié)果

中試自2022 年11 月24 日開始，至2023 年4 月17 日結(jié)束，進(jìn)入中試階段的羊肚菌菌株（同初篩試驗(yàn)所用菌株相比，所用菌株均已傳代培養(yǎng)10代以上且-80 ℃冷凍保藏了20個(gè)月以上）均出菇穩(wěn)定，且子實(shí)體形態(tài)較好（圖4—5）。中試進(jìn)一步優(yōu)化栽培技術(shù)，羊肚菌產(chǎn)量與復(fù)篩試驗(yàn)相比，有了小幅度地提高。由此可見，羊肚菌SMM-06、SMM-07 菌株是較為適宜秦巴山區(qū)氣候環(huán)境特點(diǎn)的羊肚菌穩(wěn)產(chǎn)菌株。

圖4 人工栽培的羊肚菌SMM-06菌株子實(shí)體

圖5 人工栽培的羊肚菌SMM-07菌株子實(shí)體

3 小結(jié)

初篩試驗(yàn)結(jié)果與菌株穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凡是在初篩試驗(yàn)中出菇表現(xiàn)良好的羊肚菌菌株（產(chǎn)量高于1 350 kg/hm2），在連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中都具有較好的穩(wěn)定性，即菌株連續(xù)傳代6～7 代（培養(yǎng)50～60 d）后，其菌絲的生長速度及菌落形態(tài)（主要包括菌落邊緣整齊度、菌落是否呈現(xiàn)棉絮狀及產(chǎn)生色素狀況等）與初始菌株相比，未發(fā)生明顯的變化。

基于以上發(fā)現(xiàn)，復(fù)篩試驗(yàn)以連續(xù)傳代5代（培養(yǎng)約40 d）的羊肚菌菌株作為試驗(yàn)菌株，考察羊肚菌菌株的穩(wěn)產(chǎn)性，再經(jīng)中試試驗(yàn)（所用菌株已傳代培養(yǎng)10 代，培養(yǎng)約80 d 以上）驗(yàn)證，成功選育出較為適宜秦巴山區(qū)氣候環(huán)境特點(diǎn)的羊肚菌穩(wěn)產(chǎn)菌株SMM-06、SMM-07。