酶解超聲結(jié)合提取虎杖中白藜蘆醇及純化方法研究

付培蕾 邱明恒 馮爽 李陽(yáng)杰

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種從植物中提取的二苯乙烯結(jié)構(gòu)的多酚，最初是從百合科藜蘆屬的毛葉藜蘆中得到的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在虎杖、葡萄、花生中也有其成分，而虎杖中含量最高。白藜蘆醇的化學(xué)名稱為（E）-3，5，4-三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3，相對(duì)分子質(zhì)量為228.4g·mol-1，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯以及氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑。白藜蘆醇在自然條件下以自由態(tài)和糖苷兩種形式存在，白藜蘆醇及其糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)還分別存在順式和反式兩種異構(gòu)體，白藜蘆醇的活性大于其苷，纖維素酶可將白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇。白藜蘆醇對(duì)乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素癌細(xì)胞等均有顯著抑制作用，還具有抗衰老、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗喘、防治心血管疾病等多種生理活性。本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶解結(jié)合超聲法提取虎杖中的白藜蘆醇，從而得到一種低能耗、高產(chǎn)率的提取虎杖中白藜蘆醇的工藝。

一、儀器與材料

1.儀器。超聲波清洗機(jī)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津UV2600；高效液相色譜儀，島津LC-20A；半制備高效液相色譜儀，Waters2535；紅外分光光度計(jì)，熱電iS50。

2.材料。虎杖（產(chǎn)地江西，經(jīng)原河南中醫(yī)藥大學(xué)教授王建剛教授鑒定為虎杖）；白藜蘆醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的對(duì)照品）；纖維素酶，甲醇（GR、AR），無(wú)水乙醇（AR），乙酸乙酯（AR），三氯甲烷（AR），冰醋酸（GR），檸檬酸，檸檬酸三鈉，無(wú)水乙醚（GR），丙酮（AR），乙腈（GR）。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.紫外分光光度法方法學(xué)的建立。（1）白藜蘆醇含量測(cè)定方法的建立。本實(shí)驗(yàn)采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定虎杖提取物中白藜蘆醇類粗提物的含量。

（2）對(duì)照品溶液的配制。稱取白藜蘆醇對(duì)照品1.0mg，加適量甲醇溶解，配制成100?g·mL-1的白藜蘆醇對(duì)照品溶液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別配制濃度為1、2、4、6、8?g·mL-1的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，使用紫外分光光度計(jì)在306nm處測(cè)定白藜蘆醇的吸光度，以濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度絕對(duì)值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

（4）供試品溶液的配制。稱取虎杖粉末（過(guò)60目）2.00g，加入適量纖維素酶，量取適量pH=5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，于一定溫度下酶解一定時(shí)間。取出后加入適量乙醇溶液，超聲提取一定時(shí)間后抽濾，蒸干得浸膏。加入適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移于50mL容量瓶中，稀釋至刻度。精密吸取上述溶液0.1mL，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，稀釋至刻度，于306nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)如下公式計(jì)算提取率：

提取率=C×V×稀釋倍數(shù)/m

C為被測(cè)樣品中白藜蘆醇的濃度（?g·mL-1），V為樣品最終定容體積（mL），m為虎杖的質(zhì)量（mg）。

2.提取單因素考察。酶添加量分別考察0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，酶解時(shí)間分別考察0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，酶解溫度分別考察40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，酶解pH分別考察3.4、4.0、4.4、5.0、5.4，乙醇濃度分別考察50%、60%、70%、80%、90%，液料比分別考察10：1、15：1、20：1、25：1、30：1，超聲時(shí)間分別考察20min、30min、40min、50min、60min，其他條件不變進(jìn)行初步試驗(yàn)。

3.響應(yīng)面設(shè)計(jì)篩選最佳提取工藝。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響較大的因素，以粗提取物的提取率為因變量，使用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，篩選出最佳提取工藝。

4.最佳工藝重復(fù)性試驗(yàn)。根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)得出的最佳提取工藝，重復(fù)進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，以白藜蘆醇含量為參照計(jì)算粗提物的提取率。

5.粗提物的分離與純化。（1）乙酸乙酯初步除雜。將初步提取的溶液抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得浸膏，加入適量甲醇溶解，粗提物用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，除去多糖、苷類等極性較大的雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)初步純化。

（2）薄層鑒定。將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液、萃取前提取液、萃取后提取液分別點(diǎn)樣20μL于硅膠G板上，以氯仿：丙酮：乙醇：水（4：4：0.5：0.2）為展開(kāi)劑，于365nm波長(zhǎng)處紫外燈下觀察，觀察到初步除雜后目標(biāo)單體的存在。

（3）高效液相方法學(xué)建立。①色譜條件。色譜柱為Agilent SB-C18（150mm×4.6，5μm），流動(dòng)相為乙腈：0.2%冰醋酸（64.8：35.2）。②專屬性考察。稱取適量空白溶劑、白藜蘆醇對(duì)照品，加入色譜甲醇配制成一定濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣測(cè)定。③標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。配制濃度為0.2、2、10、20、40、50?g·mL-1的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以RES的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。④回收率、日間日內(nèi)精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。分別取濃度為10、20、50?g·mL-1的低、中、高三個(gè)水平的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)所得峰面積計(jì)算相應(yīng)濃度，并與理論濃度進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算回收率與RSD。1天內(nèi)每個(gè)濃度測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定6天，考察日間日內(nèi)精密度。平行3次，計(jì)算RSD，考察重復(fù)性。

（4）制備型高效液相制備及單體純度測(cè)定。使用Waters2535半制備型高效液相色譜儀，分別進(jìn)白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和乙酸乙酯萃取后樣品液，觀察半制備液相圖譜，取制得樣品測(cè)得單體純度。

6.結(jié)構(gòu)鑒定。通過(guò)紅外光譜圖和核磁共振氫譜圖，對(duì)分離的單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

三、結(jié)果與分析

1.白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知，白藜蘆醇的濃度與吸光度的線性回歸方程為Y=0.1212X-0.0046，相關(guān)系數(shù)為R=0.9997，表明白藜蘆醇在1-8?g·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1：白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.單因素考察試驗(yàn)結(jié)果。由圖2可知，對(duì)白藜蘆醇提取率影響較大的是酶解溫度和酶解pH，因此可選擇進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

3.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)選取酶解溫度和酶解pH作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩個(gè)因素，每個(gè)因素三個(gè)水平，進(jìn)行12組實(shí)驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design Exepert軟件進(jìn)行回歸擬合，得到提取率對(duì)酶解溫度和pH的回歸方程為Y=1.20-0.019A-0.023B+0.033AB-0.14A?-0.10B?（R=0.9952）。

根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得二維等高線圖和三維響應(yīng)曲面圖（圖3），確定最佳提取工藝條件，可知白藜蘆醇提取率的理論最大值為1.20%，所對(duì)應(yīng)的提取條件為：纖維素酶添加量0.2%，纖維素酶解時(shí)間1.5h，纖維素酶解溫度49℃，纖維素酶解pH=3.8，乙醇濃度70%，液料比20：1，超聲時(shí)間40min。

4.最佳工藝重復(fù)性結(jié)果。響應(yīng)面篩選出的最佳工藝重復(fù)性良好，RSD均小于2.0%，說(shuō)明此工藝較穩(wěn)定可靠。

5.粗提物的純化與分離鑒定。（1）薄層鑒定結(jié)果。乙酸乙酯萃取后，與標(biāo)準(zhǔn)品白藜蘆醇的Rf值相近的熒光斑點(diǎn)仍存在，表明白藜蘆醇仍保留在乙酸乙酯層。

（2）專屬性結(jié)果。由圖4可知，溶劑對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響，白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間在7.5min，說(shuō)明專屬性較好，因此可以使用此條件下的檢測(cè)方法測(cè)定白藜蘆醇的含量。

（3）高效液相標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)高效液相色譜儀所得數(shù)據(jù)，白藜蘆醇峰面積與濃度的線性擬合方程為Y=152980X-14767，相關(guān)系數(shù)R=0.9999，說(shuō)明白藜蘆醇在0.2-50?g·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，符合檢測(cè)要求。

（4）回收率、日間日內(nèi)精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表1可知，三個(gè)水平濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回收率均在98%-102%，RSD均小于2.0%，日內(nèi)日間精密度、重復(fù)性的RSD均小于2.0%，說(shuō)明此條件下測(cè)定的方法精密度和重復(fù)性較好，因此可以采用此條件下的測(cè)定方法測(cè)定白藜蘆醇的含量。

（5）半制備高效液相分離結(jié)果。以乙腈：水（40：60）為流動(dòng)相，2mL·min-1流速進(jìn)樣測(cè)定，與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間收集目標(biāo)產(chǎn)物，測(cè)得單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.83%。

由圖5可知，此色譜條件下白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為8.23min，萃取物中有多種成分，其中保留時(shí)間為8.23min的峰為白藜蘆醇，收集此保留時(shí)間的樣品，真空干燥得粉末。

（6）單體的結(jié)構(gòu)鑒定。由紅外表征結(jié)果（圖6）可知，a中3284cm-1和b中3285cm-1是分子間羥基形成氫鍵締合的特征峰，a中3022cm-1和b中3021cm-1是芳?xì)涞纳炜s振動(dòng)峰，1592cm-1-1449cm-1是苯環(huán)骨架振動(dòng)的特征峰。

圖6：紅外光譜圖

注：a.白藜蘆醇對(duì)照品；b.提取物分離單體

圖7：核磁共振氫譜圖

注：A.白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品；B.提取物分離單體

由核磁結(jié)果（圖7）可知，分離單體的核磁共振氫譜與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的核磁共振氫譜基本一致，各峰的化學(xué)位移如下：a處酚羥基峰的化學(xué)位移為9.54ppm（s，1H），b處兩個(gè)化學(xué)環(huán)境相同的酚羥基質(zhì)子的化學(xué)位移為9.22ppm（s，2H），乙烯基上的兩個(gè)質(zhì)子峰分別為d處6.94ppm（d，1H，J=16HZ）和e處6.82ppm（d，1H，J=16HZ），苯環(huán)上的質(zhì)子峰分別為c處7.40ppm（d，1H，J=16HZ）、f處6.76ppm（d，2H，J=16HZ）、g處6.39ppm（s，2H）、h處6.12ppm（s，1H）。所收集樣品經(jīng)與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品核磁共振氫譜對(duì)照，基本確定樣品即為白藜蘆醇。

四、討論與結(jié)論

采用紫外分光光度法測(cè)定白藜蘆醇的含量，白藜蘆醇含量在1-8?g·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)篩選出虎杖中白藜蘆醇的最佳提取工藝為：酶解溫度49℃，pH=3.8，酶添加量0.2%，酶解時(shí)間1.5h，乙醇濃度70%，液料比20：1，超聲時(shí)間40min。此條件下白藜蘆醇提取率達(dá)1.19%，在環(huán)保節(jié)能的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了提取率。

將初步純化的提取物進(jìn)行分離，并與白藜蘆醇對(duì)照品對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間收集目標(biāo)產(chǎn)物，測(cè)得單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.83%。再通過(guò)紅外光譜及核磁共振氫譜對(duì)收集樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，經(jīng)與白藜蘆醇對(duì)照品對(duì)照，基本確定樣品即為分離所得白藜蘆醇單體。

基金項(xiàng)目：教育部產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目“移動(dòng)互聯(lián)網(wǎng)時(shí)代下藥學(xué)專業(yè)教學(xué)改革研究”（20202028026）。

作者簡(jiǎn)介：付培蕾（1995-），女，漢族，河南鄭州人，助教，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幨鹿芾砼c中藥制劑開(kāi)發(fā)。

邱明恒（1995-），女，漢族，河南鄭州人，助教，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镌u(píng)價(jià)與藥事管理。

馮爽（1986-），女，漢族，河南鄭州人，講師，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镌u(píng)價(jià)與藥事管理。

李陽(yáng)杰（1986-），男，漢族，河南鄭州人，副教授，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幨鹿芾砼c藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。