藍(lán)斑NE能神經(jīng)元在束縛應(yīng)激致小鼠咬肌緊張度升高中的作用

劉楊 李強(qiáng) 陳永進(jìn) 趙雅娟

口頜肌肌肉痛是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders,TMD)最常見的臨床分類,在TMD患者中的發(fā)生率約為80%,嚴(yán)重影響患者的正常生活[1-2]。據(jù)報道,存在口頜肌肌肉痛的TMD患者往往比正常人群有更高的焦慮或抑郁水平[3-4];受到慢性心理應(yīng)激的人群更易出現(xiàn)口頜肌的緊張與疲勞,引發(fā)或加重肌肉與顳下頜關(guān)節(jié)的疼痛[5-6]。因此,應(yīng)激導(dǎo)致的口頜肌緊張度升高與肌疲勞被認(rèn)為是TMD口頜肌肌肉痛表現(xiàn)的重要誘發(fā)因素。

肌電活動變化是評價口頜肌功能狀態(tài)、評估TMD的發(fā)展與治療效果中重要檢測指標(biāo)[7-8]。臨床研究顯示,TMD患者咬肌肌電水平明顯高于正常人群[9-10];動物實驗研究亦證實,心理應(yīng)激狀態(tài)下的實驗動物會出現(xiàn)焦慮樣行為,并且其咬肌會出現(xiàn)緊張度升高以及能量代謝異常[11-12]。

位于腦干的藍(lán)斑(locus coeruleus,LC) 與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[13]。LC內(nèi)神經(jīng)元類型主要為去甲腎上腺素(noradrenaline,NE)能神經(jīng)元,其合成并分泌的神經(jīng)遞質(zhì)NE在應(yīng)激相關(guān)的行為變化、情緒、以及認(rèn)知等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[14-15]。在解剖結(jié)構(gòu)上,LC與調(diào)節(jié)口頜肌運動的重要核團(tuán)三叉神經(jīng)中腦核(Mesencephalic trigeminal nucleus,Vme)不僅位置相臨近,同時LC還發(fā)出神經(jīng)投射至Vme,調(diào)控Vme神經(jīng)元的興奮性[16]。研究證實,應(yīng)激可導(dǎo)致Vme神經(jīng)元興奮性升高,并與應(yīng)激后咬肌緊張度升高密切相關(guān)[17],然而,肌緊張度升高是否是由于LC神經(jīng)元被激活,進(jìn)而通過神經(jīng)通路投射至Vme所致,仍需進(jìn)一步探究。

本研究擬采用經(jīng)典的束縛應(yīng)激建立動物模型,觀察小鼠應(yīng)激狀態(tài)下的行為學(xué)改變與清醒狀態(tài)下咬肌肌電水平的變化,同時檢測LC神經(jīng)元的激活情況,采用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)特異性地抑制LC內(nèi)NE能神經(jīng)元的激活,探究LC在心理應(yīng)激誘發(fā)口頜肌緊張度升高中的調(diào)控作用,為深入研究“應(yīng)激-中樞神經(jīng)-外周神經(jīng)-口頜肌的全傳遞調(diào)控通路”在TMD發(fā)病中的作用和機(jī)理提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究共使用SPF級雄性C57BL/6小鼠40 只(6～8 周齡),由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(陜)2019-001]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1) ℃,濕度(50±5)%,12 h光/暗循環(huán),隨意進(jìn)食飲水。所有動物實驗經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:K9-2022-020)。

1.2 主要實驗設(shè)備與試劑

自制束縛器;高架十字迷宮系統(tǒng)(RD1208-EP,上海移數(shù)公司);定制肌電采集電極(蘇州科斗腦機(jī)科技有限公司);MP46型生理記錄儀(BIOPAC,美國);立體定位注射儀(68025,深圳瑞沃德),微量進(jìn)樣器(平頭1 μL,上海滬鴿);冰凍切片機(jī)(Leica CM1800,Leica,德國);FV1000激光共聚焦顯微鏡(Olympus,日本);病毒載體rAAV-TH-hM4D(Gi)-mCherry-WPRE-hGH pA(武漢樞密);疊氮平-n-氧化物(clozapine-n-oxide,CNO)(Sigma,美國);小鼠抗Fos(Abcam,英國);兔抗-TH(Millipore,美國);A594 驢抗小鼠IgG、A647 驢抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific,美國)。

1.3 小鼠束縛應(yīng)激動物模型的建立

本研究采用的束縛應(yīng)激動物模型參照相關(guān)文獻(xiàn)[17],將應(yīng)激組小鼠置于管壁帶有數(shù)個通氣孔的50 mL離心管中;每日早上8:00開始連續(xù)束縛4 h,1 次/d,共束縛14 d。在給予束縛應(yīng)激的過程中,小鼠禁食禁水。對照組小鼠正常飼養(yǎng)。

本研究共分兩部分實驗。第一部分:將16 只小鼠隨機(jī)分為對照組與應(yīng)激組(n=8),研究束縛應(yīng)激是否能夠?qū)е滦∈蟪霈F(xiàn)行為學(xué)改變、咬肌緊張度升高,同時觀察LC內(nèi)神經(jīng)元的激活情況。第二部分:將24 只小鼠隨機(jī)分為對照+溶劑組、應(yīng)激+溶劑組和應(yīng)激+CNO組(n=8),采用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)抑制LC內(nèi)NE能神經(jīng)元的激活,再次觀察束縛應(yīng)激后小鼠的行為學(xué)變化與咬肌的緊張度。

1.4 行為學(xué)測試

采用高架十字迷宮(elevated plus maze text,EPM)實驗檢測動物的焦慮水平[18]。EPM距離地面50 cm,由2 個相對的開放臂、2 個相對的閉合臂以及中央活動區(qū)域組成。實驗開始時,將小鼠放置在中央?yún)^(qū)域,任其自由活動5 min,通過攝像頭記錄其活動情況。通過自動分析系統(tǒng),得出各組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比,作為評估焦慮水平的參數(shù)。

1.5 咬肌肌電水平檢測

采用定制電極采集小鼠咬肌肌電位(electromyography,EMG)水平。使用絕緣軟導(dǎo)線(長2.5 cm,直徑0.5 mm),一端焊接一根2 mm長的不銹鋼金屬微針(直徑0.15 mm),另一端焊接于2×3的圓孔排母接口,排母上焊接一根銀絲做地線。實驗開始前,參照文獻(xiàn)[19]將電極提前置于小鼠左側(cè)咬肌。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后(35 mg/kg),在小鼠左側(cè)面頰及顱頂部備皮、消毒。切開左側(cè)下頜與顱頂皮膚,將電極微針插入左側(cè)咬肌肌腹并縫合固定,縫合面頰皮膚。將絕緣導(dǎo)線經(jīng)耳后及顱頂皮下走行,于顱頂切口處穿出,將排母接口端用牙科自凝塑料固定于顱頂骨上,再次對術(shù)區(qū)進(jìn)行消毒。

術(shù)后恢復(fù)1 周后開始進(jìn)行實驗。束縛應(yīng)激結(jié)束后,采集各組小鼠在清醒狀態(tài)下的咬肌肌電活動水平。采集方法:采用連接線將小鼠顱頂排母接口與MP46型2導(dǎo)生理記錄儀相連,置于飼養(yǎng)籠內(nèi)適應(yīng)30 min,使用AcqKnowledge軟件(Biopac公司,美國)采集小鼠清醒狀態(tài)下咬肌肌電信號(每只小鼠采集30 min),并對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,得到每只小鼠咬肌的累積肌電(integral EMG,iEMG)及振幅均方根(root mean square,RMS)。

1.6 免疫組織熒光染色

采用NE能神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物——酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)來標(biāo)記LC神經(jīng)元;采用即刻早期基因fos的表達(dá)產(chǎn)物——Fos蛋白標(biāo)記被激活的神經(jīng)元;通過免疫熒光雙重染色觀察LC內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量,評估應(yīng)激后LC神經(jīng)元激活情況。

戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉后(60 mg/kg),小鼠經(jīng)心臟灌流100 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4),以及200 mL 4%多聚甲醛進(jìn)行灌注固定,取出腦組織進(jìn)行后固定及蔗糖脫水。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜[20],修整腦組織塊至LC(Bregma尾側(cè)5.34～5.68 mm)部位,冰凍切片(厚30 μm),0.01 mol/L PBS漂洗,10%驢血清室溫孵育30 min,加入一抗(小鼠抗Fos,1∶500;兔抗-TH,1∶500)孵育過夜,0.01 mol/L PBS漂洗,加入二抗(A594 驢抗小鼠IgG,1∶500;A647 驢抗兔IgG,1∶500),避光孵育4 h,0.01 mol/L PBS漂洗,裱片,室溫晾干,熒光封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照,采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)計算各組LC核團(tuán)內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量。

1.7 化學(xué)遺傳學(xué)實驗

小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉,頭部備皮并采用碘伏消毒后,固定于立體定位儀上,沿頭部正中矢狀位剪開皮膚1～2 cm,充分暴露顱骨。根據(jù)小鼠腦圖譜[20]定位LC(前囟尾端5.50 mm,中線外側(cè)0.90 mm,腦表面向下3.90 mm),按上述坐標(biāo)在顱骨鉆孔,將攜帶有TH啟動子以及抑制性G蛋白受體基因hM4D(Gi)的腺病毒載體rAAV-TH-hM4D(Gi)-mCherry-WPRE-hGH pA(2.0E+12 vg/mL)置于微量注射器內(nèi),定位注射于LC區(qū)域(注射量0.05 μL)。術(shù)后1 周,將肌電電極埋置于左側(cè)咬肌,再恢復(fù)1 周后進(jìn)行分組與實驗。待應(yīng)激結(jié)束后,各組小鼠腹腔注射藥物CNO或溶劑,給藥30～40 min之后進(jìn)行行為學(xué)與咬肌肌電水平的檢測。之后對小鼠進(jìn)行灌注取材,切片驗證病毒轉(zhuǎn)染效果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 束縛應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠焦慮樣行為與咬肌肌電活動水平增強(qiáng)

小鼠行為學(xué)結(jié)果如圖1。應(yīng)激組小鼠在高架十字迷宮的活動中,其進(jìn)入開臂次數(shù)百分比、滯留開臂時間的百分比顯著低于對照組(P=0.0083,P=0.0010),提示束縛應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠焦慮樣行為。

圖1 小鼠慢性束縛應(yīng)激后行為學(xué)檢測結(jié)果

小鼠咬肌肌電水平結(jié)果如圖2。在受到14 d束縛應(yīng)激后,應(yīng)激組小鼠咬肌肌電的iEMG與RMS水平均顯著高于對照組(P=0.0002,P=0.0002),提示束縛應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠咬肌緊張度升高。

圖2 小鼠慢性束縛應(yīng)激后咬肌肌電水平檢測結(jié)果

2.2 束縛應(yīng)激后藍(lán)斑神經(jīng)元顯著激活

兩組小鼠Fos表達(dá)結(jié)果如圖3。藍(lán)色熒光顯示為TH陽性神經(jīng)元,作為LC的位置標(biāo)記。紅色熒光顯示為Fos陽性神經(jīng)元細(xì)胞核。在LC核團(tuán)范圍內(nèi)進(jìn)行Fos陽性神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果顯示,應(yīng)激組LC部位的Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著高于對照組(P=0.0003),提示束縛應(yīng)激可致LC神經(jīng)元顯著激活。

圖3 慢性束縛應(yīng)激后小鼠LC內(nèi)Fos染色結(jié)果

2.3 特異性抑制藍(lán)斑內(nèi)NE能神經(jīng)元活動可緩解束縛應(yīng)激導(dǎo)致的焦慮行為與咬肌肌電水平

為了進(jìn)一步驗證LC在束縛應(yīng)激致咬肌肌電水平增高過程中的作用,采用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)特異性抑制LC內(nèi)NE能神經(jīng)元的激活(圖4)。實驗結(jié)束后組織切片結(jié)果顯示,帶有紅色熒光的病毒載體成功轉(zhuǎn)染至LC神經(jīng)元胞體內(nèi)(圖4B～C),確保了給予CNO后能夠有效抑制LC內(nèi)NE能神經(jīng)元的激活。

圖4 用于化學(xué)遺傳學(xué)的病毒載體轉(zhuǎn)染結(jié)果

行為學(xué)結(jié)果顯示(圖5),應(yīng)激+溶劑組小鼠在高架十字迷宮中進(jìn)入開臂次數(shù)百分比、滯留開臂時間的百分比低于對照+溶劑組(P=0.0007,P=0.0008),應(yīng)激+CNO組小鼠高架十字迷宮中進(jìn)入開臂次數(shù)百分比、滯留開臂時間的百分比高于應(yīng)激+溶劑組(P=0.0218,P=0.0131)。肌電結(jié)果顯示(圖6),應(yīng)激+溶劑組小鼠咬肌肌電的iEMG與RMS水平高于對照+溶劑組(P=0.0003,P=0.0002),應(yīng)激+CNO組小鼠咬肌肌電的iEMG與RMS水平低于應(yīng)激+溶劑組(P=0.0078,P=0.0248)。表明抑制藍(lán)斑內(nèi)NE能神經(jīng)元的激活可緩解束縛應(yīng)激導(dǎo)致的焦慮行為與咬肌緊張度升高。

圖6 化學(xué)遺傳學(xué)給藥后各組小鼠咬肌肌電水平檢測結(jié)果

3 討 論

越來越多的研究認(rèn)為,心理應(yīng)激是TMD發(fā)生與發(fā)展的重要危險因素[3-6,21]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的重要部分,探究心理應(yīng)激如何通過中樞神經(jīng)通路的調(diào)控,影響TMD的發(fā)生發(fā)展,對深入理解二者密切相關(guān)的中樞層面原因、并尋求更有針對性的治療具有重要的意義。通過動物應(yīng)激模型是研究心理因素與TMD的關(guān)系,探討其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的常用方法。本研究采用小鼠建立心理應(yīng)激動物模型,實驗中采用的束縛應(yīng)激方式因其操作方便、重復(fù)性好等優(yōu)點,在有關(guān)心理應(yīng)激相關(guān)的研究中被廣泛采用[17,22]。連續(xù)14 d、4 h/d的慢性束縛應(yīng)激構(gòu)建心理應(yīng)激動物模型,觀察到小鼠在高架十字迷宮中進(jìn)入開放臂的次數(shù)與時間顯著降低,表明慢性束縛應(yīng)激可成功誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)焦慮樣情緒,與以往的研究結(jié)果相一致[18,22]。

臨床研究表明,焦慮情緒與口頜肌的緊張度的關(guān)系可能是加重TMD癥狀的重要原因[5-6]。本研究進(jìn)一步檢測了小鼠受到應(yīng)激后咬肌的肌電活動水平。以往研究中,實驗動物由于難以配合,多采用麻醉狀態(tài)下記錄肌電活動,限制了實驗結(jié)果的參考價值。本課題組根據(jù)小鼠口頜部解剖特點,參照相關(guān)文獻(xiàn)[17],定制了植入式針式電極,將其植入小鼠的咬肌內(nèi),并在顱骨部位進(jìn)行固定,可在小鼠清醒并自由活動的狀態(tài)下,進(jìn)行長時間咬肌肌電的采集。結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性束縛應(yīng)激可引起咬肌肌電水平的顯著升高。咬肌是頜面部最重要的一對口頜肌,其運動由中樞內(nèi)三叉神經(jīng)運動核(trigeminal motor nucleus,Vmo)支配,Vme調(diào)控咬肌的本體覺傳入,并向Vmo發(fā)出谷氨酸能投射。本課題組前期的研究證實,慢性束縛應(yīng)激可導(dǎo)致Vme神經(jīng)元興奮性升高,Vme-Vmo谷氨酸能投射增強(qiáng),并與應(yīng)激導(dǎo)致的肌緊張度升高有關(guān)[17]。然而,應(yīng)激后Vme神經(jīng)元的興奮性增加是否是由于受到了中樞內(nèi)應(yīng)激相關(guān)核團(tuán)的投射影響所致,仍需進(jìn)一步探究。

緊鄰Vme內(nèi)側(cè)的LC作為大腦的應(yīng)激相關(guān)中樞之一,被認(rèn)為與注意、喚醒、記憶等生理功能密切相關(guān),并介導(dǎo)了壓力性應(yīng)激反應(yīng)[13-15]。LC中的NE能神經(jīng)元是大腦內(nèi)合成NE的主要部位,與應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān),許多精神疾病諸如焦慮癥、抑郁癥都存在LC內(nèi)NE能系統(tǒng)的失調(diào)[23-24]。本研究為證實束縛應(yīng)激是否能夠引起LC神經(jīng)元的直接激活,檢測了LC內(nèi)即刻早期基因c-fos的表達(dá)產(chǎn)物Fos蛋白的表達(dá)水平[25]。TH是細(xì)胞合成NE過程中的關(guān)鍵酶,用TH來標(biāo)記藍(lán)斑神經(jīng)元[26],結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠受到14 d應(yīng)激后,可觀察到應(yīng)激組在TH陽性神經(jīng)元的范圍內(nèi),Fos陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對照組,說明束縛應(yīng)激可導(dǎo)致LC神經(jīng)元的顯著激活。由于LC緊鄰Vme,且已有文獻(xiàn)證實,LC直接向Vme發(fā)出神經(jīng)投射,調(diào)控Vme神經(jīng)元的興奮性變化[16]。因此推測,應(yīng)激后LC神經(jīng)元激活,并通過向Vme的神經(jīng)投射使得Vme神經(jīng)元興奮性升高,從而導(dǎo)致咬肌的緊張度升高。為驗證以上假說,進(jìn)一步采用了化學(xué)遺傳學(xué)的方法,探究應(yīng)激后LC神經(jīng)元的激活是否與咬肌緊張度的升高有關(guān)。

化學(xué)遺傳學(xué)的核心技術(shù)是使用可被特定藥物來激活的特定人工設(shè)計的受體(designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs),從而對神經(jīng)細(xì)胞群或神經(jīng)環(huán)路的活性進(jìn)行特異性的控制[27]。在神經(jīng)科學(xué)研究中,最常用的兩種DREADDs包括可激活神經(jīng)元放電的hM3Dq和可抑制神經(jīng)元放電的hM4D(Gi)。DREADDs可被生物惰性配體CNO高選擇性地激活,且對其余中樞靶點缺乏親和力[28]。以DREADDs加上CNO定向激活的化學(xué)遺傳學(xué)方法為最小侵入性、特異性調(diào)控神經(jīng)元活性的研究提供了有力的技術(shù)支撐。本研究由于應(yīng)激后LC神經(jīng)元出現(xiàn)激活,故選用了抑制性DREADDs hM4D(Gi)。為了使其能夠特異性的抑制LC神經(jīng)元,又添加了TH啟動子,并使用腺病毒載體輔助將構(gòu)建的DREADDs定位注射入LC。在應(yīng)激結(jié)束后,給予每組動物腹腔注射CNO或溶劑,結(jié)果顯示,應(yīng)激+溶劑組小鼠相比對照+溶劑組出現(xiàn)了顯著的焦慮樣改變,而給予CNO后,其焦慮水平又顯著降低;另一方面,應(yīng)激+溶劑組小鼠的咬肌肌電水平顯著高于對照+溶劑組,而給予CNO后,咬肌肌電水平又顯著下降。這進(jìn)一步證明,LC內(nèi)NE能神經(jīng)元的激活是束縛應(yīng)激導(dǎo)致的焦慮行為以及咬肌緊張度升高的重要原因。有文獻(xiàn)報道,Vme神經(jīng)元細(xì)胞膜含有α2A-腎上腺素能受體,并可被來自LC的NE能神經(jīng)投射所激活,繼而導(dǎo)致其神經(jīng)元電生理特性發(fā)生改變[29]。因此,通過LC-Vme神經(jīng)通路的作用,LC將神經(jīng)元激活信息傳遞至Vme,繼而影響口頜肌的運動狀態(tài),很可能是LC內(nèi)NE能神經(jīng)元參與調(diào)控應(yīng)激導(dǎo)致咬肌緊張度升高的中樞機(jī)制之一。

綜上所述,慢性束縛應(yīng)激能夠造成小鼠的焦慮樣情緒改變,且咬肌的肌緊張度升高;而應(yīng)激后LC內(nèi)NE能神經(jīng)元的激活可能是應(yīng)激導(dǎo)致焦慮樣行為與咬肌緊張度升高的中樞調(diào)控機(jī)制之一。