甜瓜自交系BPC-4雙單倍體的創(chuàng)制、鑒定及基因組變化

畢研勝,鄭莉娜,張璐,王瑜暉,錢(qián)春桃

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

甜瓜(CucumismeloL.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)黃瓜屬(Cucumis)一年生蔓性草本植物,其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,是一種色、香、味俱佳的重要世界性水果［1］。由于甜瓜的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄,抗病蟲(chóng)害和抗逆性較差,嚴(yán)重限制了甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。雜種優(yōu)勢(shì)是提高產(chǎn)量、改進(jìn)品質(zhì)、增強(qiáng)抗性的重要途徑［2］,在甜瓜上已經(jīng)利用雜種優(yōu)勢(shì)培育出了優(yōu)良的品種［3-4］。雜種優(yōu)勢(shì)育種的關(guān)鍵是獲得雙親純系,常見(jiàn)的純化方法是自交,傳統(tǒng)育種需要自交8代以上才可獲得較純合的自交系。對(duì)于自交4代的甜瓜材料,其純合率理論上為93.75%,還需自交4～5代才可進(jìn)一步純合;按照一年種植兩季計(jì)算,需要2年以上才能純合,這就減緩了育種進(jìn)程。而將育種材料培育成雙單倍體只需2代［5］,因此雙單倍體可以大大縮短育種材料純合進(jìn)程,可以明顯提高育種效率。

作物通常無(wú)法直接獲取雙單倍體,需要先獲得單倍體,再通過(guò)染色體加倍獲得雙單倍體［6］。目前獲得單倍體的方法主要是自然突變和人工誘導(dǎo)。自然突變是指植物發(fā)育異常導(dǎo)致孤雄或孤雌生殖的發(fā)生,進(jìn)而產(chǎn)生單倍體,這一方法突變概率很低且具有隨機(jī)性［7］。人工誘導(dǎo)主要有體外誘導(dǎo)和體內(nèi)誘導(dǎo)2種方法。體外誘導(dǎo)可分為雄配子體誘導(dǎo)(花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng))和雌配子體誘導(dǎo)(未受精子房或胚珠離體培養(yǎng))。體內(nèi)誘導(dǎo)分為輻射花粉誘導(dǎo)、誘導(dǎo)系誘導(dǎo)、CRISPR/Cas9基因編輯誘導(dǎo)和遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)［8］。雄配子誘導(dǎo)途徑中,通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得甜瓜單倍體比較困難,Dryanovska 等［9］曾嘗試甜瓜花藥的培養(yǎng),結(jié)果以失敗告終。小孢子培養(yǎng)獲得甜瓜單倍體還未見(jiàn)有成功報(bào)道。雌配子誘導(dǎo)途徑中,未受精子房和未受精胚珠離體培養(yǎng)可以獲得甜瓜單倍體［10-11］,但存在成苗率差,技術(shù)不成熟等問(wèn)題。輻射花粉獲得甜瓜單倍體也已有成功報(bào)道［12-13］,但是存在需要昂貴輻射設(shè)備、基因型依賴性高等限制。而誘導(dǎo)系和CRISPR/Cas9基因編輯誘導(dǎo)單倍體的方法目前還未在甜瓜上獲得成功。上述方法獲得甜瓜單倍體已屬不易,要想獲得甜瓜雙單倍體還需要經(jīng)過(guò)染色體加倍［14］,更增加了育種的難度。

小麥與玉米、栽培大麥與球莖大麥遠(yuǎn)緣雜交可以利用父本染色體的消除產(chǎn)生單倍體［15-16］,然后經(jīng)過(guò)染色體自然加倍形成雙單倍體［17-18］。利用重測(cè)序技術(shù)可以對(duì)基因組變化進(jìn)行檢測(cè)［19］,如玉米上利用重測(cè)序?qū)ψ越幌导白越缓蟠鶶NP位點(diǎn)的純合度進(jìn)行檢測(cè),分析了純合度和性狀一致性的關(guān)系,在分子水平上為自交系建立保種圃提供了依據(jù)［20］。孫博文等［21］和黃耀等［22］利用甜瓜和野生種非洲角(C.africanus)、西印度瓜(C.anguria)遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)獲得了雙單倍體,并且創(chuàng)制的甜瓜雙單倍體葉片、節(jié)間長(zhǎng)等多個(gè)性狀變小,整體表現(xiàn)為矮化。但是,甜瓜與同屬近緣種黃瓜之間的種間雜交是否也能誘導(dǎo)染色體消除獲得甜瓜雙單倍體,以及獲得的甜瓜雙單倍體在性狀和基因組水平上的變化特征,這些研究都未見(jiàn)報(bào)道。因此,本文在成功地利用甜瓜與黃瓜遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)出甜瓜自交系BPC-4(S4)的雙單倍體基礎(chǔ)上,系統(tǒng)比較分析其植物特性特征,并利用SSR標(biāo)記分析雙單倍體的基因位點(diǎn)純合性,同時(shí)進(jìn)一步分析全基因組SNP位點(diǎn)純合性變化情況,為探明甜瓜與黃瓜遠(yuǎn)緣雜交獲得甜瓜雙單倍化的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于遠(yuǎn)緣雜交的母本材料甜瓜品種‘白皮脆’由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,經(jīng)過(guò)4代自交得到自交系,將其編號(hào)為BPC-4(2n=2x=24)。遠(yuǎn)緣雜交的父本材料為甜瓜屬8種不同基因型材料自交系(表1)。

表1 父本材料基因型信息Table 1 Genotype information of paternal material

以上材料種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供,其中,新種自交16代材料為本實(shí)驗(yàn)室自主培育材料［23］。試驗(yàn)材料于2020年秋季種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地。其中母本材料種植50株,父本材料各種植10株。

1.2 方法

1.2.1 遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交試驗(yàn)參考錢(qián)春桃等［24］的方法。授粉后立刻在雌花果梗處噴施25 mg·L-1氯吡脲溶液(又稱坐果靈),4～5 h后用10 mg·L-1TDZ(噻苯隆)噴施子房,24 h后再次對(duì)子房噴施10 mg·L-1的TDZ。

1.2.2 雜交后代自交留種2021年春季對(duì)F1自交留種,獲得的F2于2021年秋季再次自交得到F3,F3于2022年春季種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地。

1.2.3 遠(yuǎn)緣雜交后代的雙單倍體特性鑒定1)染色體數(shù)目觀察 由于F1較少,以F2的幼嫩根尖為材料進(jìn)行制片觀察。制片方法參考胡靜軒等［25］的方法。染色體制片采用酶解去壁低滲火焰法,經(jīng)4′,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)熒光染料染色后,使用蔡司熒光顯微鏡(Image Z2)在100×油鏡下觀察并照相。

2)基因位點(diǎn)的SSR鑒定分析 利用SSR標(biāo)記的共顯性特征對(duì)雜交后代基因位點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析。選用葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的852對(duì)SSR引物,與黃瓜參考基因組Cucumber(Chinese Long)genome v2和甜瓜參考基因組(DHL92)v3.6.1進(jìn)行BLAST比對(duì),得到235對(duì)SSR引物,進(jìn)一步篩選得到分布在12條染色體上的27對(duì)父母本具有多態(tài)性的標(biāo)記(表2)。篩選后的引物由南京擎科生物有限公司合成。利用CTAB法提取待測(cè)F2、F3和父母本葉片樣品的DNA,擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積20 μL:1 μL模板DNA(50～100 ng·μL-1),2×Taq Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1),ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,28個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min,最后4 ℃保存。產(chǎn)物(50～100 ng·μL-1)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

表2 多態(tài)性SSR引物名稱及對(duì)應(yīng)序列Table 2 Polymorphic SSR primer names and corresponding sequences

3)植物學(xué)性狀的統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)F2與F3性狀無(wú)明顯變化,因此選用F2與BPC-4進(jìn)行植物學(xué)性狀的比較。植物學(xué)性狀統(tǒng)計(jì)參照賈媛媛等［26］的方法,在盛花期測(cè)量植株13、14、15節(jié)位的葉長(zhǎng)、葉寬、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)、葉柄與主蔓的夾角;每株分別取3朵當(dāng)天開(kāi)放的雄花測(cè)量花瓣長(zhǎng);測(cè)量植株總節(jié)間數(shù);待果實(shí)成熟時(shí)隨機(jī)取3個(gè)果實(shí)測(cè)量橫縱徑、單果重,并計(jì)算果形指數(shù)。利用手持糖度計(jì)測(cè)定可溶性糖含量。

1.2.4 雙單倍體育性評(píng)價(jià)遠(yuǎn)緣雜交后代F1、F2、F3經(jīng)過(guò)鑒定為雙單倍體,將其依次命名為DH0、DH1、DH2。為了評(píng)價(jià)雙單倍體的育性,統(tǒng)計(jì)BPC-4和DH0、DH1、DH2自交的種子數(shù)、結(jié)籽率等。結(jié)籽率=飽滿種子數(shù)/種子數(shù)×100%。

1.2.5 重測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析重測(cè)序分2次進(jìn)行,第1次測(cè)定BPC-4和DH1,第2次測(cè)定DH1和DH2,分2次采集植株幼嫩葉片樣品后送交深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)定,采用的重測(cè)序方法為第二代測(cè)序技術(shù)的納米球測(cè)序技術(shù)。具體重測(cè)序方法如下:采用CTAB法提取葉片基因組DNA,用Covaris儀超聲波隨機(jī)打斷成特定大小的片段;打斷后的樣品用Agencourt AMPure XP-Medium kit進(jìn)行片段選擇,使得樣品條帶集中在200～300 bp;末端修復(fù)、加“A”、接頭連接;采用BGISEQ-500/MGISEQ-2000 上機(jī)測(cè)序。對(duì)儀器測(cè)序得到的序列(raw reads)進(jìn)行過(guò)濾,將過(guò)濾后的序列(clean reads)使用BWA比對(duì)軟件與甜瓜參考基因組(DHL92)v3.6.1進(jìn)行比對(duì),對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序、質(zhì)量過(guò)濾和標(biāo)記duplicate后進(jìn)行后續(xù)變異類型的檢測(cè)。使用GATK軟件的HaplotypeCaller功能來(lái)檢測(cè)樣品相對(duì)于參考基因組之間的SNP位點(diǎn)。使用變異位點(diǎn)注釋軟件Annovar將變異位點(diǎn)在基因組上的位置區(qū)域注釋。

參照陸珊珊等［21］的方法計(jì)算SNP位點(diǎn)純化率,相同的堿基對(duì)記作純合基因型(Hom),不同的堿基對(duì)記作雜合基因型(Het)。將兩者SNP位點(diǎn)進(jìn)行比較,過(guò)濾相同的SNP位點(diǎn)基因型,統(tǒng)計(jì)2種變化類型數(shù)量:A,雜合基因型變?yōu)榧兒匣蛐?B,純合基因型變?yōu)殡s合基因型。計(jì)算SNP位點(diǎn)純化率并統(tǒng)計(jì)SNP純化位點(diǎn)在染色體上的分布。SNP純化位點(diǎn)數(shù)=A-B。SNP位點(diǎn)純化率計(jì)算公式:SNP位點(diǎn)純化率=SNP純化位點(diǎn)數(shù)/SNP位點(diǎn)數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上數(shù)據(jù)均使用Excel 2016軟件計(jì)算均值與標(biāo)準(zhǔn)差,并進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同父本基因型對(duì)遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)的影響

將BPC-4人工去雄后,與8種父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交。前期研究表明甜瓜遠(yuǎn)緣授粉后不進(jìn)行處理的子房會(huì)發(fā)生敗育［26］,因此本研究在遠(yuǎn)緣雜交授粉后噴施了坐果靈。由表3可見(jiàn):噴施坐果靈后8種雜交組合都可以收到自交果,坐果率為67.67%～84.00%。但是只有雜交組合BPC-4×YPJ-6的雜交果收獲3粒相對(duì)飽滿種子(F1),其他基因型作為父本的雜交組合均沒(méi)有飽滿種子,表明甜瓜遠(yuǎn)緣雜交有嚴(yán)重的雜交不親和的現(xiàn)象,且和父本基因型有關(guān);雜交組合BPC-4×YPJ-6不親和現(xiàn)象可能較弱,因此雜交成功。

表3 8種遠(yuǎn)緣雜交組合的誘導(dǎo)結(jié)果Table 3 Induction results of 8 distant cross combinations

2.2 遠(yuǎn)緣雜交后代的雙單倍體特性鑒定

將獲得的3粒F1種子于2021年春季進(jìn)行播種,其中有1粒種子發(fā)芽,自交收獲50粒種子(F2);2021年秋季F2自交獲得F3。將F3種子于2022年春季進(jìn)行播種,用于進(jìn)一步的染色體數(shù)目觀察、SSR鑒定、植物學(xué)性狀統(tǒng)計(jì)、育性評(píng)價(jià)和重測(cè)序分析。

2.2.1 染色體數(shù)目觀察前人利用遠(yuǎn)緣雜交組合C.maximta×C.moschata曾獲得了南瓜的單倍體［27］。本研究利用甜瓜和黃瓜進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交,為確定獲得后代是否也為單倍體,需要進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)鑒定。由于F1材料較少,選用F2的根尖進(jìn)行觀察,結(jié)果(圖1)顯示染色體數(shù)為24條,與甜瓜二倍體的染色體數(shù)目一致,可以證明本次遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)獲得的材料為二倍體(2n=2x=24)。

圖1 F2根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體(2n=2x=24)Fig.1 Mitotic metaphase chromosome of F2 root tip cell(2n=2x=24)

2.2.2 基因位點(diǎn)的SSR鑒定分析利用27對(duì)引物(表2)對(duì)F2進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果(表4)顯示,有22對(duì)標(biāo)記檢測(cè)到了母本的特異性條帶,并且母本的特異性條帶在F2的單株之間是一致的,這表明F2在這些位點(diǎn)上是純合的。3-1、4-1、4-2、8-1和8-4這5對(duì)標(biāo)記檢測(cè)到少量可能來(lái)自父本的特異性條帶(圖2),但是這些條帶在F2單株之間的位置是一致的,說(shuō)明這5對(duì)標(biāo)記上的位點(diǎn)可能為異質(zhì)性純合位點(diǎn)。為進(jìn)一步檢測(cè)這5對(duì)異質(zhì)性純合位點(diǎn)的真實(shí)性,對(duì)F2和F3再次進(jìn)行擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)F3中擴(kuò)增出的條帶位置與F2一致并未發(fā)生分離,在F2、F3中未再次擴(kuò)增出可能來(lái)自父本的特異性條帶(圖3)。對(duì)這5對(duì)標(biāo)記所在基因組區(qū)間進(jìn)行F2重測(cè)序的堿基突變信息分析,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)插入或缺失的堿基突變現(xiàn)象(表5),因此5對(duì)引物在F2中檢測(cè)到的疑似異質(zhì)性純合位點(diǎn)是同質(zhì)性純合。

圖2 SSR引物在親本及F2中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of SSR primers in the parent and F2M:標(biāo)準(zhǔn)品;♀:母本BPC-4;♂:父本YPJ-6;1～10:F2單株。M:Marker;♀:Maternal parent BPC-4;♂:Paternal parent YPJ-6;1-10:F2 single plant.

圖3 SSR引物在BCP-4、YPJ-6及F2、F3中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of SSR primers in BCP-4,YPJ-6 and F2 and F3M:標(biāo)準(zhǔn)品;♀:母本BPC-4;♂:父本YPJ-6;A和B:F2單株;1～8:F3單株。M:Marker;♀:Maternal parent BPC-4;♂:Paternal parent YPJ-6;A and B:F2 single plant;1-8:F3 single plant.

表4 SSR多態(tài)性標(biāo)記帶型分析Table 4 Analysis of SSR polymorphism marker banding

表5 F2基因組中5對(duì)SSR標(biāo)記的序列變異統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of sequence variation profiles for 5 pairs of SSR markers in the F2 genome

2.2.3 植物學(xué)性狀的統(tǒng)計(jì)分析本研究中,與BPC-4 相比,F2植株整體表現(xiàn)為緊湊和矮化,葉長(zhǎng)、葉寬、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)、雄花長(zhǎng)、節(jié)間數(shù)、葉柄與主莖夾角和果實(shí)大小均小于BPC-4,且差異顯著。葉片與果皮的顏色都更深(圖4)。由表6和表7可見(jiàn):除果形指數(shù)外,F2的其他性狀指標(biāo)均顯著小于 BPC-4(P<0.05),但其可溶性糖含量極顯著高于BPC-4(P<0.01)。表明相比于 BPC-4,雙單倍體個(gè)體之間的性狀變異程度較小更加整齊,符合雙單倍體純合穩(wěn)定的特性,再次證明遠(yuǎn)緣雜交的后代為雙單倍體。因此,將F1、F2、F3命名為DH0、DH1、DH2。

圖4 雙單倍體(DH)與BPC-4植物學(xué)性狀比較Fig.4 Comparison of botanical characters between dihaploid(DH)and BPC-4 A. BPC-4與DH葉柄與主蔓夾角比較(以紅色虛線代表葉柄和主蔓,白色曲線表示夾角);B. BPC-4與DH花期的葉片比較;C. BPC-4與DH盛花期的雄花比較;D. BPC-4與DH成熟期的果實(shí)。A. Comparison of the angle between petiole and main vine in BPC-4 and DH(red dashed line represents petiole and main vine,white curve indicates the angle);B. Comparison of leaves between BPC-4 and DH at flowering stage;C. Comparison of male flowers between BPC-4 and DH at bloom stage;D. BPC-4 and DH fruits at maturity stage.

表6 F2與BPC-4部分植物學(xué)性狀比較Table 6 Comparison of some botanical characters between F2 and BPC-4

表7 F2與BPC-4果實(shí)性狀比較Table 7 Comparison of some fruit characters between F2 and BPC-4

2.3 雙單倍體育性評(píng)價(jià)

由表8可見(jiàn):DH0飽滿種子數(shù)、結(jié)籽率分別為50、23.81%,與BPC-4相比有顯著差異。DH1、DH2自交后的飽滿種子數(shù)分別恢復(fù)到278、297,結(jié)籽率恢復(fù)到75.34%、78.78%,表明雙單倍體經(jīng)過(guò)自交育性恢復(fù)可以通過(guò)種子進(jìn)行擴(kuò)繁保存。

表8 DH0、DH1、DH2和BPC-4的種子數(shù)和結(jié)籽率比較Table 8 Comparison of seed number and seed setting rate of DH0,DH1,DH2 and BPC-4

2.4 BPC-4與雙單倍體的重測(cè)序

2.4.1 重測(cè)序數(shù)據(jù)重測(cè)序共產(chǎn)生了13.19 G原始測(cè)序數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)SOAPnuke軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭過(guò)濾、低質(zhì)量過(guò)濾和去N過(guò)濾后,最終得到12.83 G高質(zhì)量的可用數(shù)據(jù)。BPC-4和DH1這2個(gè)樣本原始數(shù)據(jù)的reads數(shù)分別為45 373 388和42 526 730,原始數(shù)據(jù)的堿基數(shù)分別為6 806 008 200 和6 379 009 500 bp。過(guò)濾后數(shù)據(jù)的reads數(shù)分別為44 411 746和41 145 684,過(guò)濾后數(shù)據(jù)的堿基數(shù)分別為6 661 761 900 和6 171 852 600 bp。可利用數(shù)據(jù)占送測(cè)樣品原始數(shù)據(jù)的97.88%和96.75%。質(zhì)量值大于Q20的堿基分別占96.28%和95.86%,質(zhì)量值大于Q30的堿基分別占89.92%和88.81%。GC含量分別為37.50%和37.16%。綜上,樣本數(shù)據(jù)量充足,GC分布正常,測(cè)序質(zhì)量合格,可用于進(jìn)一步的分析。

2.4.2 數(shù)據(jù)比對(duì)使用BWA比對(duì)軟件,將 clean reads 比對(duì)到參考基因組上,然后使用Qualimap軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。BPC-4和雙單倍體樣本的比對(duì)率分別為96.00%和97.96%,平均測(cè)序深度分別為17.35X和16.42X。綜上,比對(duì)結(jié)果正常,可用于后續(xù)相關(guān)分析。

2.4.3 BPC-4與雙單倍體的SNP位點(diǎn)分析經(jīng)過(guò)SNP注釋分析,雙單倍體共注釋到 2 132 915個(gè) SNP,BPC-4 共注釋到 2 123 670 個(gè) SNP。其中雙單倍體有111 026個(gè)SNP位于基因上游,333 104個(gè)SNP位于編碼區(qū)。BPC-4中有111 114個(gè)SNP位于基因上游,334 681個(gè)SNP位于編碼區(qū)?；蛏嫌魏途幋a區(qū)的變異都可以直接或間接影響基因表達(dá),進(jìn)而影響基因功能和表型變化。

過(guò)濾相同的位點(diǎn)后,由BPC-4的雜合位點(diǎn)變?yōu)殡p單倍體的純合位點(diǎn)數(shù)為68 972個(gè),由BPC-4的純合位點(diǎn)變?yōu)殡p單倍體的雜合位點(diǎn)數(shù)為63 480個(gè),SNP純化位點(diǎn)數(shù)為5 492個(gè),SNP位點(diǎn)純化率為0.26%,這證明BPC-4在經(jīng)歷4代自交后基因組的確仍存在雜合位點(diǎn),可以進(jìn)一步純化,也證明經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)所獲得的雙單倍體相比與BPC-4更加純合。純化位點(diǎn)在12條染色體上均有分布,其中1號(hào)染色體數(shù)量最多,6號(hào)染色體分布最少(圖5)。

圖5 雙單倍體SNP純化位點(diǎn)在染色體上的分布Fig.5 Distribution of purification sites of double haploid SNP on chromosomes

2.5 雙單倍體自交后代的重測(cè)序

2.5.1 重測(cè)序數(shù)據(jù)DH1和DH2這2個(gè)樣本原始數(shù)據(jù)的reads數(shù)分別為39 680 000和38 720 000,原始數(shù)據(jù)的堿基數(shù)分別為5 952 000 000和5 808 000 000 bp。過(guò)濾后數(shù)據(jù)的reads數(shù)為38 955 026和38 190 110,過(guò)濾后的數(shù)據(jù)的堿基數(shù)分別為5 843 253 900和5 728 516 500 bp?？衫脭?shù)據(jù)占送測(cè)樣品原始數(shù)據(jù)的98.17%和98.63%。質(zhì)量值大于Q20的堿基分別占97.41%和97.00%,質(zhì)量值大于Q30的堿基分別占93.05%和92.06%。GC含量分別為38.39%和37.54%。綜上,樣本數(shù)據(jù)量充足,GC分布正常,測(cè)序質(zhì)量合格,可用于進(jìn)一步分析。

2.5.2 數(shù)據(jù)比對(duì)使用BWA比對(duì)軟件,將 clean reads 比對(duì)到參考基因組上,然后使用Qualimap軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。DH1和DH2樣本的比對(duì)率分別為97.81%和97.99%。平均測(cè)序深度分別為13.260 5X和13.087 9X。綜上,比對(duì)結(jié)果正常,可用于后續(xù)相關(guān)分析。

2.5.3 雙單倍體自交后代的基因組穩(wěn)定性經(jīng)過(guò)SNP 注釋分析,DH1共注釋到2 147 266個(gè)SNP,DH2共注釋到 2 166 719個(gè)SNP。將DH1、DH2相同的SNP位點(diǎn)過(guò)濾,結(jié)果顯示由DH1的雜合位點(diǎn)變?yōu)镈H2的純合位點(diǎn)數(shù)為104 920,由DH1的純合位點(diǎn)變?yōu)镈H2的雜合位點(diǎn)數(shù)為105 936,與純合位點(diǎn)變?yōu)殡s合位點(diǎn)的差值為1 016,占比僅為0.05%,遠(yuǎn)小于孟德?tīng)栠z傳學(xué)理論上S4純合度(93.75%)與S5純合度(96.88%)的差值(3.13%),因此表明在自交到DH2時(shí)基因組水平上已經(jīng)比較穩(wěn)定。

3 討論

本研究通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)的方法獲得甜瓜BPC-4的雙單倍體,其表型發(fā)生了顯著變化,與孫博文等［21］在培育的甜瓜雙單倍體中觀察到的現(xiàn)象一致。通常認(rèn)為一種材料在經(jīng)歷4代自交后性狀應(yīng)當(dāng)比較穩(wěn)定,我們對(duì)BPC-4(S4)進(jìn)行自交,獲得的S5、S6也未觀察到性狀分離情況(數(shù)據(jù)未列出)?？赡苁且?yàn)橹参飳W(xué)性狀大多是多基因控制的復(fù)雜性狀,通過(guò)傳統(tǒng)自交的方法很難進(jìn)一步純化。本研究獲得的雙單倍體純系性狀出現(xiàn)明顯變化,表明自交系的性狀經(jīng)過(guò)雙單倍體化可以進(jìn)一步純化。因此,有必要將甜瓜自交系(S4)創(chuàng)制為雙單倍體。

馬紅梅等［28］利用秈稻蠟質(zhì)基因5′上游區(qū)與GUS基因編碼區(qū)構(gòu)建融合基因,并采用基因槍法導(dǎo)入未成熟種子幼胚和糊粉層細(xì)胞中,結(jié)果證明基因上游區(qū)域可以調(diào)節(jié)基因編碼區(qū)的表達(dá)。在本研究的雙單倍體中注釋到位于基因上游和編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)變化,并觀察到自交系(S4)變化為雙單倍體時(shí)出現(xiàn)的多個(gè)性狀變化,這可能與馬紅梅等［28］的研究類似。此外,BPC-4在經(jīng)雙單倍體化后基因組進(jìn)一步純化,且這種純化在12條染色體上都有分布,而且甜瓜1號(hào)染色體上的位點(diǎn)純化最多。研究表明,甜瓜1號(hào)染色體與黃瓜7號(hào)染色體幾乎完全一樣,具有很高的同源性［29］,因此,推測(cè)它們之間在種間雜交時(shí)發(fā)生同源重組的頻率可能較高,這可能是甜瓜1號(hào)染色體上純化位點(diǎn)分布最多的原因。

由于遺傳的差異,不同基因型之間種間雜交的親和性不同,篩選雜交親和性高的配組應(yīng)當(dāng)是可能的［30］。本研究設(shè)置了8個(gè)不同的遠(yuǎn)緣雜交組合,以尋找親和性較好的親本組合。在噴施坐果靈后雖然都可以收到雜交果實(shí),但只有甜瓜和栽培黃瓜的1個(gè)雜交組合成功獲得3粒飽滿的種子。這可能與該雜交組合的雜交親和性較好有關(guān)。此外在8個(gè)雜交組合中有7個(gè)父本材料為二倍體,而新種(Cucumis×hytivusChen &Kirkbride,2n=38)是本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制的人工異源四倍體,其作為父本與栽培甜瓜雜交也未能獲得種子,這可能與不同倍性間的雜交更困難有關(guān)。因此,雖然新種作為橋梁種可以將原始親本野生種(酸黃瓜C.hystrix,2n=2x=24)的一些優(yōu)良基因?qū)氲皆耘帱S瓜(C.sativus,2n=2x=14)中［31］,但是本研究因遠(yuǎn)緣雜交未收到種子,從而未能實(shí)現(xiàn)新種作為橋梁種轉(zhuǎn)導(dǎo)酸黃瓜的有用基因至栽培甜瓜中。

在禾本科植物中遠(yuǎn)緣雜交常用來(lái)獲得作物的單倍體,而這種遠(yuǎn)緣雜交的方法之所以可以產(chǎn)生單倍體是因?yàn)榻?jīng)過(guò)雜交產(chǎn)生的核型不穩(wěn)定,從而導(dǎo)致父本的染色體被全部消除,因此利用遠(yuǎn)緣雜交有望獲得母本來(lái)源的單倍體［32］。利用SSR分子標(biāo)記可以檢測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代的基因位點(diǎn)純合性,也可以檢測(cè)父本遺傳物質(zhì)是否導(dǎo)入［33］。本研究利用雙親具有多態(tài)性的SSR引物檢測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代F2,發(fā)現(xiàn)在F2中都只檢測(cè)到母本的特異性條帶,并未發(fā)現(xiàn)父本的特異性條帶。因此,我們推測(cè)本研究所獲得的雙單倍體也是在遠(yuǎn)緣雜交后發(fā)生了父本外源染色體整體消除的結(jié)果。

遠(yuǎn)緣雜交獲得的DH0經(jīng)過(guò)自交僅有1個(gè)果實(shí)收到了少量種子(DH1),這表明最初的雙單倍體育性很低。謝冰等［34］培育的雙單倍體也發(fā)現(xiàn)育性降低的現(xiàn)象,并且認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與胚狀體發(fā)育過(guò)程中發(fā)生變異有關(guān)。此外陳英等［35］發(fā)現(xiàn)秈粳雜交獲得的DH中,部分DH結(jié)實(shí)率雖然很低,但隨著世代的增進(jìn)可以恢復(fù)。本研究中,DH1、DH2自交后的種子數(shù)、結(jié)籽率也得以恢復(fù),這與陳英等［35］的研究結(jié)果類似。因此,本研究獲得的育性恢復(fù)的雙單倍體可以直接自交留種,這就為雙單倍體在甜瓜育種實(shí)踐和理論研究創(chuàng)造了有利條件。

前期我們利用甜瓜野生種與栽培甜瓜進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交培育出了甜瓜雙單倍體,所利用的野生種包括西印度瓜［21］和非洲角［22］。本研究首次以栽培黃瓜與甜瓜遠(yuǎn)緣雜交培育出甜瓜雙單倍體,這就拓寬了甜瓜遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)雙單倍體途徑。同時(shí),相比野生種父本攜帶較多的野生不利性狀,如非洲角的苦味等,栽培黃瓜作父本則可以避免一些不利性狀的導(dǎo)入。在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交獲得的DH群體上,一些玉米特異DNA可以被檢測(cè)到［36］,并觀察到染色體橋、微核等染色體異?，F(xiàn)象［37-38］。由于本研究通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交最終只獲得了1個(gè)DH0,利用SSR標(biāo)記未發(fā)現(xiàn)父本的遺傳物質(zhì)。而禾本科遠(yuǎn)緣雜交后代可以檢測(cè)到父本的遺傳物質(zhì),可能是因?yàn)檫x取的雜交組合數(shù)量多,獲得了較多的雜交后代單倍體(雙單倍體)。因此,如果擴(kuò)大甜瓜與黃瓜的遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)雙單倍體試驗(yàn)規(guī)模,或許就可以確定有無(wú)外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到栽培甜瓜雙單倍體中。