引進大白菜種質(zhì)資源表型多樣性分析

魏書洞，孫曉雪，孟 川，趙建軍，馬 衛(wèi)，盧 銀

（1.華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室·河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室·河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院河北保定 071000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所 石家莊 050057）

大白菜（Brassica rapaL.ssp.）原產(chǎn)于我國，是蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種的2 年生草本植物，是我國第二大蔬菜作物[1-2]。我國大白菜種質(zhì)資源十分豐富，截止到2000 年國家種質(zhì)庫保存的大白菜種質(zhì)達1680 份，且仍舊有新的種質(zhì)資源不斷被搜集、引進和保存[3]。然而，我國大白菜種子市場上卻存在嚴(yán)重的同質(zhì)化問題，不同公司的許多品種無論在商品性、產(chǎn)量、生育期還是在抗逆性等方面都存在相同或相似現(xiàn)象。面對當(dāng)前蔬菜市場上激烈的競爭形勢和人們?nèi)找娑鄻踊南M需求，大白菜種質(zhì)創(chuàng)新迫在眉睫。有效利用已保存的多樣化種質(zhì)資源既是種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑，也可為大白菜基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供更多有價值的材料。

種質(zhì)資源又稱遺傳資源，是某一生物種內(nèi)遺傳多樣性的全部，主要包括農(nóng)家種、野生種以及育成品種等[4]。種質(zhì)資源在自然進化和人工馴化的長期選擇中形成，攜帶豐富多樣的表型變異，是育種和生物學(xué)基礎(chǔ)研究不可或缺的重要材料。實踐證明，育種的許多突破性進展往往取決于特殊種質(zhì)資源關(guān)鍵基因或性狀的開發(fā)利用[5]。隨著科技的迅猛發(fā)展，多學(xué)科、多領(lǐng)域的先進知識和技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于作物育種和生物學(xué)研究中，表型性狀始終是作物育種和生物學(xué)研究的起點和最終落腳點，開展表型性狀調(diào)查并利用表型數(shù)據(jù)進行遺傳多樣性分析是大白菜種質(zhì)資源高效利用的有效途徑，該方法在玉米、蘿卜、青花椒、甜瓜、茄子等多種作物上均有報道[6-10]。大白菜中也有相關(guān)研究，孟淑春等[11]、范偉強等[2]、韓睿等[12]分別對65、33 和47 份大白菜種質(zhì)進行了表型性狀調(diào)查和多樣性分析。趙美華等[13]利用表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記的方法分析了41份大白菜種質(zhì)的遺傳多樣性。李國強等[14]對國家蔬菜種質(zhì)資源庫中收集保存的1651 份大白菜種質(zhì)進行表型數(shù)據(jù)分析，并篩選獲得了248 份核心種質(zhì)。這些研究報道為大白菜種質(zhì)資源的表型鑒定提供了參考，但表型性狀的調(diào)查方法多為傳統(tǒng)的觀察和測量，調(diào)查效率較低，部分重要性狀如面積相關(guān)性狀無法獲得。隨著科技的發(fā)展，表型數(shù)據(jù)分析軟件、圖像提取和處理軟件、拍照掃描儀器、無人機和機器人等智能化、自動化的軟、硬件設(shè)施設(shè)備被逐步開發(fā)并應(yīng)用于表型性狀調(diào)查中，大大提高了調(diào)查的效率和準(zhǔn)確性[15-16]。其中，通過表型圖像汲取性狀數(shù)據(jù)的應(yīng)用較為廣泛，馬曉丹等[17]利用高通量表型平臺獲取大豆冠層發(fā)育的3D 圖像，Merchuk 等[18]開發(fā)的Coverage Tool 軟件可用于從已獲得的植物圖像中提取和分析表型數(shù)據(jù)，但該技術(shù)在大白菜表型性狀研究中的應(yīng)用較少，作為重要的葉用蔬菜，大白菜葉片面積、葉片綠葉占比等重要農(nóng)藝性狀尚無研究報道。

在當(dāng)前國內(nèi)大白菜種業(yè)市場同質(zhì)化情況日趨嚴(yán)重的情況下，筆者引進了138 份非主栽大白菜種質(zhì)資源，以傳統(tǒng)的調(diào)查測定結(jié)合創(chuàng)新的圖片分析技術(shù)汲取了32 個表型性狀數(shù)據(jù)并進行分析，豐富了大白菜的表型調(diào)查方法和可調(diào)查性狀，為大白菜新品種選育、種質(zhì)改良與創(chuàng)新提供新的材料和表型數(shù)據(jù)參考，也為大白菜的基礎(chǔ)生物學(xué)研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

138 份材料為引自中國北京、河北和荷蘭三地的農(nóng)家種、原始種、野生種等非主栽種質(zhì)資源，經(jīng)多代自交純化后獲得的純合自交系，其中源自北京的種質(zhì)資源73 份，材料編號W1-W73；源自荷蘭的種質(zhì)資源11 份，材料編號W74-W84；源自河北的種質(zhì)資源54 份，材料編號W85-W138。

1.2 方法

試驗材料分別于2018 年種植于河北省保定市徐水區(qū)崔莊鎮(zhèn)農(nóng)家田，2021 年種植于石家莊辛集市的華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室馬蘭試驗基地，2022 年種植于河北省保定市的河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科教學(xué)實習(xí)基地，試驗數(shù)據(jù)源自三地的調(diào)查結(jié)果。

試驗材料播種于32 孔穴盤內(nèi)進行育苗，長至4～5 片真葉時定植于露地，每份材料定植30 株，每10 株一組，分為3 組，每組均采取完全隨機排列，株距60 cm、行距50 cm，隨機選取3 個長勢一致的單株為生物學(xué)重復(fù)，進行表型性狀調(diào)查。共調(diào)查32個表型性狀，包括12 個間斷性性狀和20 個連續(xù)性性狀，以賦值的形式將間斷性性狀的調(diào)查結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)。具體的調(diào)查時期、部位、方法及賦值標(biāo)準(zhǔn)參考國家標(biāo)準(zhǔn)和已有研究報道并進行補充修改（表1）[19-21]。

表1 大白菜表型性狀調(diào)查部位、賦值標(biāo)準(zhǔn)及調(diào)查方法Table 1 Location,assignment standards,and investigation methods for phenotypic traits of Chinese cabbage

連續(xù)性性狀中，13 個性狀以先拍照再通過圖像處理軟件分析照片的方式獲得數(shù)據(jù)，拍照在設(shè)有標(biāo)尺的平整黑色背景下以支架固定微單相機（索尼ICLE-6000L）垂直向下拍攝（圖1），以ImageJ（1.46 r）軟件分析照片汲取相關(guān)性狀的表型數(shù)據(jù)；其余7 個性狀采用直接測量和人工計數(shù)法測定，測定工具包括直尺、游標(biāo)卡尺和臺秤。

圖1 不同部位拍攝照片F(xiàn)ig.1 Photos of different parts

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel（2019）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并計算變幅、平均值、變異系數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)；采用系統(tǒng)聚類法以O(shè)rigin（2022）進行聚類和典型材料的提取分析；利用IBM SPSS Statistics（26.0）進行主成分分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜引進種質(zhì)資源的表型多樣性分析

由表2 和表3 可以看出，32 個表型性狀的變異系數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為3.64%～52.82%、0.69～2.09、0.68～1.00，可見供試的138 份大白菜種質(zhì)資源具有豐富的表型變異。通過比較分析，發(fā)現(xiàn)連續(xù)性性狀較間斷性性狀變異系數(shù)低、多樣性指數(shù)高。

表2 20 個連續(xù)性性狀的多樣性分析Table 2 Diversity analysis of 20 continuous traits

表3 12 個間斷性性狀的多樣性分析Table 3 Diversity analysis of 12 intermittent traits

根據(jù)20 個連續(xù)性性狀多樣性分析結(jié)果（表2），可知變異系數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為3.64%～46.98%、1.98～2.09 和0.86～0.91，均值分別為29.33%、2.05 和0.89，其中葉球截面面積的變異系數(shù)最高，外葉綠葉面積占比的變異系數(shù)最低；外葉主葉脈長和株高的多樣性指數(shù)最高，外葉綠葉面積占比和葉球截面面積的多樣性指數(shù)最低；20 個性狀各表型均勻度指數(shù)變化幅度較小。

12 個間斷性性狀多樣性結(jié)果如表3 所示，變異系數(shù)、多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)分別為31.24%～52.82%、0.69～1.54、0.68～1.00，均值分別為41.07%、1.10、0.86，其中葉色變異系數(shù)最高，葉球頂部形狀的變異系數(shù)最低；葉球形狀的多樣性指數(shù)最高，葉面茸毛和葉面光澤的多樣性指數(shù)最低。138 份材料的7 個性狀均勻度指數(shù)大于0.85，均勻度較高，5 個性狀均勻度指數(shù)介于0.68～0.81 之間，具有一定偏好性。偏好性分析發(fā)現(xiàn)葉球形狀有6 種類型，僅有1 份種質(zhì)為炮彈形，編號W13；葉球內(nèi)葉顏色的4 種類型中，僅1 份種質(zhì)為橘黃色，編號W26；抱合方式的4 種類型，僅1 份種質(zhì)為擰抱，編號W34，占比僅為0.72%；葉球頂部形狀的3 種類型中，89 份種質(zhì)為圓頭形，占比高達64.49%；葉球顏色的4 種類型中87 份種質(zhì)為淺綠色，占比高達63.04%。

2.2 不同來源大白菜種質(zhì)資源的表型多樣性比較

對中國北京、河北和荷蘭三地大白菜種質(zhì)資源的表型多樣性進行比較，由圖2 可知，三地種質(zhì)的32 個性狀變異系數(shù)各有不同，除外葉綠葉占比外，其他性狀的變異系數(shù)均高于11.27%，說明三地種質(zhì)各性狀均表現(xiàn)為一定的表型多樣性。其中荷蘭種質(zhì)葉緣波狀、外葉綠葉占比、葉球顏色和葉球頂部形狀4 個性狀的變異系數(shù)高于其他兩地種質(zhì)；葉片數(shù)、葉緣鋸齒、外葉主葉脈厚度、株型及凈菜率5 個性狀介于其他兩地種質(zhì)之間；其余23 個性狀均低于其他兩地種質(zhì)。三地種質(zhì)各性狀多樣性指數(shù)均較高，其中荷蘭種質(zhì)球葉寬、葉緣波狀和葉球顏色3個性狀多樣性指數(shù)高于其他兩地種質(zhì)；葉緣鋸齒、株型、葉球內(nèi)葉顏色3 個性狀介于其他兩地種質(zhì)之間；外葉主葉脈面積、株高和球葉面積3 個性狀與河北種質(zhì)相同但低于北京種質(zhì)；葉面茸毛多樣性指數(shù)與其他兩地種質(zhì)相同；其余22 個性狀均表現(xiàn)為多樣性指數(shù)低于其他兩地（圖3）。

圖3 不同來源種質(zhì)性狀的多樣性指數(shù)比較Fig.3 Comparison of diversity index of germplasm traits of different sources

連續(xù)性性狀的均值和變幅比較結(jié)果如圖4 所示，3 地種質(zhì)僅葉片數(shù)和凈菜率2 個性狀無顯著差異，其余18 個性狀均存在不同程度的差異。其中荷蘭種質(zhì)的外葉長、外葉主葉脈長、外葉主葉脈面積、株高、株展、毛質(zhì)量、球質(zhì)量、球葉長、球葉寬、球葉面積10 個性狀顯著大于河北和北京兩地種質(zhì)；外葉主葉脈厚度、葉球高度、葉球?qū)挾?、球截面面積4 個性狀顯著大于河北種質(zhì)；外葉寬、外葉面積和外葉主葉脈寬3 個性狀顯著大于北京種質(zhì)；僅外葉綠葉占比1 個性狀表現(xiàn)為顯著小于北京種質(zhì)，與河北種質(zhì)無顯著差異。荷蘭種質(zhì)雖多數(shù)性狀的均值較大但變幅普遍較小，20 個性狀變幅均小于北京種質(zhì)；與河北種質(zhì)相比，17 個性狀的變幅較小，僅外葉綠葉占比、毛質(zhì)量和球質(zhì)量3 個性狀變幅偏大。間斷性性狀分級頻次比較結(jié)果表明（圖5），中國北京和河北兩地種質(zhì)不具有明顯的偏好性，而荷蘭種質(zhì)以葉色淺綠，葉球筒形合抱為主。各表型中，3 個具有特殊表型的種質(zhì)（葉球炮彈形、橘黃色球內(nèi)葉和葉球擰抱）均源自中國北京。

圖5 不同來源種質(zhì)間斷性性狀分布頻次比較Fig.5 Comparison of distribution frequency of discontinaous traits of different sources

2.3 大白菜引進種質(zhì)資源的主成分分析

主成分分析結(jié)果表明（表4），32 個性狀可歸為10 個主成分，累計方差貢獻率為72.70%，可代表這些性狀的絕大部分信息。其中，第1 主成分貢獻率最高，為20.68%，包括葉球的6 個連續(xù)性性狀；第2主成分貢獻率為12.71%，包括結(jié)球期最大外葉的6個連續(xù)性性狀；第3 主成分包括株高、株型、抱合方式、葉球形狀、葉球頂部形狀6 個與株型和球形相關(guān)的性狀；毛質(zhì)量、球質(zhì)量等產(chǎn)量相關(guān)性狀居于第4主成分，其余11 個性狀分別居于第5 至第10 主成分。

表4 主成分貢獻率Table 4 Contribution rate of principal component

2.4 大白菜引進種質(zhì)資源的聚類分析和典型種質(zhì)特征分析

聚類分析結(jié)果見圖6-A，138 份材料分為5 類，分別包括27、37、23、16 和35 份材料，未發(fā)現(xiàn)分類與種質(zhì)來源地相關(guān)。經(jīng)軟件分析分別提取了5 個分類的典型種質(zhì)，I～V類典型種質(zhì)的編號分別為W67、W49、W113、W105 和W21，表型特征差異明顯（圖6-B）。

圖6 聚類分析（A）與典型特征材料（B）Fig.6 Cluster analysis（A）and typical characteristic materials（B）

各類材料表型數(shù)據(jù)的差異顯著性分析結(jié)果見表5，類別I的葉片數(shù)、株高、毛質(zhì)量、球質(zhì)量、葉球高度、葉球?qū)挾?、葉球截面面積、球葉長、球葉寬和球葉面積10 個植株大小相關(guān)性狀除株高與類別Ⅱ差異不顯著外，其他性狀均表現(xiàn)為顯著變小，可歸納為小株型；類別Ⅱ的外葉長、外葉寬、外葉面積、外葉主葉脈長、外葉主葉脈寬、外葉主葉脈面積、株高和株展8 個外葉相關(guān)性狀，除外葉寬與類別Ⅳ、株高與類別I差異不顯著外，其他性狀均表現(xiàn)為顯著變小，可歸納為小外葉型；類別Ⅲ外葉寬、外葉面積、外葉主葉脈寬、毛質(zhì)量、球質(zhì)量和凈菜率6 個性狀均表現(xiàn)為最大，可歸納為高產(chǎn)型；類別Ⅳ葉片數(shù)、株展、球葉寬、球葉面積較大但外葉寬和凈菜率卻表現(xiàn)為最小，可歸納為葉球松散型；類別V的外葉長、外葉面積、外葉主葉脈長、外葉主葉脈寬、外葉主葉脈面積、外葉主葉脈厚度、株高、株展、葉球高、葉球?qū)?、葉球截面面積、球葉長和球葉寬13 個性狀均表現(xiàn)為較大，可歸納為大株型。數(shù)據(jù)分析結(jié)果與典型特征材料表型一致。

表5 各類材料表型數(shù)據(jù)的差異顯著性分析Table 5 Difference significance analysis of phenotypic data of various materials

3 討論與結(jié)論

變異系數(shù)體現(xiàn)性狀的變異幅度，多樣性指數(shù)則體現(xiàn)性狀類型的豐富程度，二者均是評價作物表型多樣性的重要指標(biāo)。研究表明變異系數(shù)大于10.00%、多樣性指數(shù)大于1.00，可說明不同樣本的多樣性豐富[22]。在筆者的研究中變異系數(shù)除外葉綠葉面積占比較小外（3.64%），其他性狀均大于10.00%；多樣性指數(shù)除葉面茸毛、葉光澤和葉球頂部形狀這3 個間斷性性狀外，其他性狀多樣性指數(shù)均大于1.00，可見引進的138 份大白菜種質(zhì)資源具有較豐富的表型多樣性。在筆者的研究中，連續(xù)性性狀和間斷性性狀相比，連續(xù)性性狀的變異系數(shù)低而多樣性指較高，與何偉鋒等[23]、趙玉靖等[24]、羅雙霞等[25]研究結(jié)果一致。分析發(fā)現(xiàn)這與性狀本身的數(shù)值類型有關(guān)，連續(xù)性性狀為實際測定值，不同材料的測定數(shù)值各異且數(shù)值間差異小，而間斷性性狀僅有通過賦值獲得的幾個有限且跨度較大的數(shù)值，類型少，不同種質(zhì)可能具有相同的數(shù)值，從而表現(xiàn)為連續(xù)性性狀多樣性指數(shù)高，間斷性性狀變異系數(shù)高，因此兩類性狀表型數(shù)據(jù)需要分開比較分析，相互之間比較意義不大。均勻度指數(shù)可解析性狀各類型的分布是否均一，在筆者研究的32 個性狀中，27 個性狀分布均一，僅5 個間斷性性狀表現(xiàn)為一定的偏好性，即葉球顏色、葉球內(nèi)葉顏色、抱合方式、葉球形狀和葉球頂部形狀，其中葉球炮彈形、球內(nèi)葉橘黃色和擰抱3 種表型的種質(zhì)僅各有1 份，葉球淺綠色和圓頭2 個性狀均占比60%以上，這可能與大白菜的自然進化和人工選育有關(guān)。筆者所選試材并非各地主栽品種而是源自野生種、農(nóng)家種等，推測3 個較少出現(xiàn)的性狀類型非自然演化而來，而是經(jīng)人工選育獲得，在原始種質(zhì)中這些類型較少，如橘黃色球心大白菜是當(dāng)前市場上的熱銷類型，多個育種單位進行了有目的的選育；而大白菜球葉因包裹在外葉中見光少多為淺綠色，抱合緊實的葉球多呈現(xiàn)圓頭形，較散葉、舒心等類型更耐低溫，進而更容易度過冬天進入生殖生長階段從而繁衍后代，這2 個性狀是大白菜自然進化繁衍的結(jié)果，因此占比較大。在主成分分析中，第1 主成分為葉球相關(guān)的連續(xù)性性狀，可見葉球在大白菜生產(chǎn)和生長發(fā)育中均為最重要的特征性狀之一；第2 主成分為最大外葉相關(guān)連續(xù)性性狀，外葉為大白菜營養(yǎng)生長發(fā)育階段進行光合作用的主要功能葉片，與大白菜葉球發(fā)育和產(chǎn)量息息相關(guān)，聚類分析結(jié)果也可證實這一論點，類別Ⅱ的小外葉型材料即表現(xiàn)為株高、株展、毛質(zhì)量、球質(zhì)量偏小，而類別Ⅲ的高產(chǎn)型則表現(xiàn)為外葉寬、外葉面積、外葉綠葉占比大。

筆者引入了圖片數(shù)據(jù)提取技術(shù)，在葉片及葉球部分的13 個數(shù)量性狀的測定中摒棄了傳統(tǒng)測量方法，大大提高了測定的精準(zhǔn)性和高效性，增加了外葉面積、外葉主葉脈面積、球葉面積、葉球截面面積和綠葉占比5 個傳統(tǒng)調(diào)查方法無法測定的重要性狀。此外，筆者拍照所選標(biāo)尺為具有幾個標(biāo)準(zhǔn)色號的色卡，并以此為基礎(chǔ)，利用MATLAB 軟件分析圖片，成功提取了葉色、葉球顏色和球內(nèi)葉顏色3 個性狀的RGB、HSV、LAB 值，已有研究將葉片RGB參數(shù)用于預(yù)測葉綠素含量，但是如何將這些成組的數(shù)據(jù)應(yīng)用于評價大白菜葉色性狀中，仍有待深入研究[26]。隨著后基因組時代的快速發(fā)展，“表型組”成為生物學(xué)研究的下一個戰(zhàn)略高點，“表型組+基因組”、“表型組+大數(shù)據(jù)”、“表型組+人工智能”成為未來的發(fā)展趨勢，更多能解決表型調(diào)查中實際問題的硬件設(shè)備和軟件技術(shù)將不斷得到研發(fā)和應(yīng)用。

綜上所述，筆者引進的138 份國內(nèi)外的大白菜種質(zhì)具有豐富的表型多樣性，對不同來源地的種質(zhì)表型進行比較，發(fā)現(xiàn)荷蘭引進種質(zhì)特色鮮明，以葉色淺綠、葉球筒形合抱為主，北京和河北兩地種質(zhì)表型呈現(xiàn)多樣化，引進種質(zhì)和本試驗表型數(shù)據(jù)可進一步應(yīng)用于大白菜種質(zhì)創(chuàng)新和基礎(chǔ)生物學(xué)研究中。在大白菜的32 個表型性狀中，葉球相關(guān)性狀是可用于評價、區(qū)分描述不同類型大白菜的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀，而外葉（非產(chǎn)品葉片）相關(guān)性狀可影響大白菜的葉球發(fā)育和產(chǎn)量，是大白菜育種中的重要性狀因子。