奶牛胚胎移植技術(shù)要點及應(yīng)用前景

操禮軍，汪 暉，杜婷婷，劉 莉*，胡永青*

1 新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，新疆烏魯木齊 830000

2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830000

0 引言

在畜牧業(yè)中，胚胎移植技術(shù)已成為動物學(xué)家和育種學(xué)家改善畜群遺傳，并迅速增加優(yōu)良畜種的有力工具，目前已廣泛應(yīng)用在遺傳改良、種畜繁育和保種、疾病控制、基因工程研究等方面。具體到牛上，胚胎移植技術(shù)是指將一頭良種母牛配種后的早期胚胎取出，移植到另外一頭或數(shù)頭同種的、生理狀況相同或相似的母牛生殖道的適當(dāng)部位，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體的過程。該方法提升了遺傳改良并縮短了世代間隔，是一種提高繁殖力的有效方法[1]。

牛胚胎移植技術(shù)涉及供體和受體動物的選擇和管理，以及胚胎的收集和移植。在牛中使用胚胎移植的主要目標(biāo)是提高有價值的雌性的繁殖率。因此，有價值的雌性的后代數(shù)量增加到至少比正常情況下高出5 倍的水平。胚胎移植被描述為將從供體動物的生殖道中獲得的胚胎或在實驗室條件下在體外產(chǎn)生的胚胎移植給一個或多個同步受體。體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的階段包括供體動物和受體動物的選擇，所選供體和受體的發(fā)情周期的同步，誘導(dǎo)超排卵和隨后的供體授精，收集，胚胎的評估和移植。

1 胚胎移植技術(shù)的發(fā)展

歷史上第一次哺乳動物胚胎移植的案例發(fā)生在1890年，Walter Heape將安哥拉兔胚胎移植到比利時兔輸卵管中，并順利產(chǎn)下了6 只幼兔[2]。1934年Warwick等[3]又報道了第一例山羊胚胎移植。后來學(xué)者又在牛等動物上進行了相關(guān)研究。

現(xiàn)代的胚胎移植技術(shù)是在20 世紀(jì)70 年代發(fā)展起來的，Wilmut 和Rowsond 等[4]成 功 地 實現(xiàn)了牛胚胎的低溫保存。在過去的3 0 年里，胚胎移植技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了3 個階段的變化：第一代是通過超數(shù)排卵、非手術(shù)恢復(fù)和移植從供體獲得胚胎。第二代是通過卵子的體外受精獲得體外胚胎。第三代是進一步發(fā)展了體外受精技術(shù)，創(chuàng)新了胚胎微操作技術(shù)，涉及體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的克隆、著床前遺傳學(xué)診斷、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)等內(nèi)容。

2 胚胎移植技術(shù)的原理及過程

胚胎移植技術(shù)的原理是通過收集基因優(yōu)良的雌性的胚胎，并將收獲的胚胎移植到受體動物體內(nèi)，從而增加優(yōu)良雌性動物的子代數(shù)量和遺傳基因優(yōu)勢。利用胚胎移植技術(shù)可以提高奶牛的繁殖率，通過更高的選擇強度、更短的世代間隔和更多的雌性后代來傳遞理想性狀。

目前的牛胚胎移植技術(shù)通常包括供受體的選擇、供體動物的發(fā)情同步和超數(shù)排卵、供體動物的授精、從供體收集胚胎、轉(zhuǎn)移到受體（新鮮）或冷凍保存、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎分割、胚胎檢查和性別鑒定、胚胎移植等步驟。

2.1 供體選擇

胚胎的數(shù)量與質(zhì)量由供體的選擇決定，囊胚期前的胚胎發(fā)育主要靠母系遺傳物質(zhì)來維持，只有當(dāng)受精卵運用自己的基因組而不再是母系遺傳物質(zhì)時才能夠進入囊胚發(fā)育期階段。胚胎移植的第一步是選擇供體牛，選擇遺傳或表型優(yōu)良的動物是供體選擇的基礎(chǔ)，供體奶牛必須具備遺傳優(yōu)勢，能夠產(chǎn)生大量可用胚胎的特性[5]；具有規(guī)律的發(fā)情期，每次受孕不超過2 次，沒有分娩困難，沒有可檢測到的遺傳缺陷[6]；同時供體的營養(yǎng)水平應(yīng)與體型和產(chǎn)奶量相適應(yīng)，體況評分良好。此外良好的公?；蛘邇鼍侵陵P(guān)重要的，在后裔測定中應(yīng)具有優(yōu)異的性狀表現(xiàn)，并且營養(yǎng)狀況良好。

2.2 超數(shù)排卵

超數(shù)排卵是指在一個發(fā)情期釋放許多卵母細(xì)胞的方法。在牛中，有兩種普遍接受的超數(shù)排卵方法。一種方法是在發(fā)情周期的第10天肌內(nèi)注射（IM）1 次2 000～2 500 IU的馬絨毛膜促性腺激素（eCG），然后在2 天或3 天后間隔12～24 h注射2 次前列腺素。另一種方法是使用促卵泡激素（FSH）。在正常的發(fā)情周期中期或接近尾聲時，在卵巢上會出現(xiàn)功能性黃體（CL），每天注射2 次FSH，連續(xù)4 天；在胚胎移植計劃的第3天注射PG，這將導(dǎo)致CL消退，48～60 h后出現(xiàn)發(fā)熱或發(fā)情；在這時，牛通常會產(chǎn)生7～20 個或更多的存活卵子[7]。由于卵子數(shù)量增加，因此比正常情況下更需要確定存活的精子細(xì)胞來授精，所以至少相隔12 h用2 支精液，7 天后沖洗子宮以收集胚胎。

2.3 胚胎收集

目前比較普遍的是非手術(shù)方法采集牛胚胎，該方法通常要使用雙向流動導(dǎo)管，用大量的商品化的沖洗液（500～2 000 mL）來沖洗子宮，然后將液體從子宮返回，經(jīng)不銹鋼或尼龍篩將胚胎封入塑料杯中。當(dāng)胚胎被識別后，要立即被轉(zhuǎn)移到含有新鮮無菌培養(yǎng)基中。通常使用含有青霉素和10%～20%熱滅活血清的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）作為保存介質(zhì)。然后通過至少3 個不同的裝有新鮮無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿連續(xù)沖洗，每一步都需要新的無菌移液管。最后將它們收集后，利用立體顯微鏡評估胚胎形狀、顏色、質(zhì)地和大小等因素，篩選出質(zhì)量良好的胚胎待轉(zhuǎn)移或冷凍保存[8]。

2.4 胚胎凍存

胚胎凍存通常采用甘油作為低溫保護劑。甘油在冷凍過程中保護了胚胎，但如果在移植前不移除，對胚胎是致命的。一旦胚胎被冷凍，解凍程序需要3～4個步驟的沖洗，以去除甘油，然后再轉(zhuǎn)移。這個過程可能需要15～20 min。在乙二醇中冷凍胚胎用于解凍后直接移植的方法已被廣泛采用[9]，這使得在野外條件下解凍胚胎的移植更加實用。冷凍胚胎的解凍方式與冷凍精液非常相似，應(yīng)在嚴(yán)格控制時間和溫度的條件下處理。

2.5 同期發(fā)情

胚胎移植的妊娠率部分取決于受者與胚胎供者在24 h內(nèi)發(fā)情時間的同步性。通過檢測未處理動物的自然發(fā)情或通過藥物誘導(dǎo)的同步發(fā)情后，可以選擇受體動物進行胚胎移植計劃。因為前列腺素（PGF）誘導(dǎo)的受者發(fā)情會在60～72 h發(fā)生，而超數(shù)排卵的受者發(fā)情會在3 6 ～4 8 h 發(fā)生，受體牛只必須在供體牛只前12～24 h接受治療，以保證其發(fā)情周期趨于一致，特別是鮮胚移植，其差異不得超過12 h[10]。目前牛的同期發(fā)情主要采用一次PG法、二次PG法與陰道孕酮栓（CIDR）+PG法，不同處理方法效果差異不大，且技術(shù)路線十分成熟。

2.6 胚胎移植

胚胎移植分為手術(shù)和非手術(shù)兩種方法。在大多數(shù)情況下，非手術(shù)轉(zhuǎn)移是首選方式。目前使用的非手術(shù)胚胎移植包括人工授精移液管和胚胎移植移液管的使用。發(fā)情同步確認(rèn)后，移植前，進行第二尾間隙硬膜外腔麻醉，去除直腸的糞便，消毒外陰部。移植過程是將凍存胚胎在水浴中解凍，然后用蔗糖將胚胎復(fù)蘇，并重新裝入0.25 mL吸管，胚胎間至少間隔2 個氣泡，然后將吸管裝入胚胎移植移液管中。全程必須小心確保吸管與移植槍外套緊密接合，以避免泄漏。胚胎通過移液器穿過子宮頸，被放置在毗鄰CL的卵巢的子宮角中，非常類似于人工授精[12]。

3 胚胎移植技術(shù)在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用

如今胚胎移植技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成較成熟的產(chǎn)業(yè)，利用胚胎移植技術(shù)可以加強遺傳選擇、診斷和治療不孕不育的、控制疾病傳播、篩選基因缺陷的牛只、繁殖稀有和瀕危物種，以及進行發(fā)育生物學(xué)等方面的研究。

3.1 遺傳改良

胚胎移植技術(shù)現(xiàn)在被用于遺傳改良，特別是在奶牛養(yǎng)殖業(yè)，今天使用的大多數(shù)精液來自通過胚胎移植生產(chǎn)的公牛。超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)被用來增加遺傳優(yōu)秀的雌性和優(yōu)秀的父系后代的數(shù)量。并且隨著選擇強度的增加和世代間隔的縮短，選擇為胚胎移植的雌性，可以在群體內(nèi)獲得遺傳增益。此外，新的基因組技術(shù)正越來越多的應(yīng)用于選擇胚胎供體，基因組分析也已成為選擇胚胎移植的牛只的必要條件。

3.2 疾病控制

胚胎移植技術(shù)可用于控制基因疾病的大規(guī)模傳播。首先胚胎移植技術(shù)通過有效的篩選供體雌性和雄性牛只，就可以在初步階段篩選掉一些具有疾病的牛只。并且胚胎可以進行活檢和染色體組型分析，進一步對染色體組型異常的個體進行鑒別和淘汰。此外通過檢查透明帶、胰蛋白酶處理，以及清洗等程序，使體內(nèi)衍生的胚胎可以去除特定的病原體。因此，一些研究者建議在疾病暴發(fā)時可以利用胚胎移植技術(shù)挽救遺傳群體[13]，同時也可以作為建立無病畜群的有效替代方法。

3.3 種畜保護

對于單胎動物而言，要獲得純種的后代，至少需要7～8 個世代的繁殖，要經(jīng)歷15～20 年的時間。而采用胚胎移植技術(shù)以純種母畜為供體，通過超數(shù)排卵和人工授精技術(shù)，經(jīng)過一代就可獲得純種后代[14]，可以大大縮短繁殖時間。因此在保護動物遺傳資源、繁衍瀕臨滅絕的野生動物等方面，胚胎移植技術(shù)也發(fā)揮了重要的作用。

3.4 發(fā)展生物技術(shù)

當(dāng)前許多生物工程研究必須借助胚胎移植技術(shù)的基礎(chǔ)來實現(xiàn)，因此也催生了結(jié)合胚胎移植等生物技術(shù)的相關(guān)研究。比如通過胚胎移植技術(shù)檢測奶牛和公牛中不良隱性性狀的攜帶者；對于某些特征，如并指畸形和侏儒癥，缺乏純合子的、可生育的雌性作為疑似攜帶者公牛的配偶，通過胚胎移植技術(shù)擴大生產(chǎn)，從而測試公牛是否為攜帶者。有了超排卵和胚胎移植，1～2 個療程的超排卵將提供足夠的胚胎來測試大多數(shù)奶牛；此外，接受者可以是雙胞胎，在懷孕2 個月左右對胎兒進行檢查，以診斷出許多這些缺陷。因此，通過胚胎移植，可以快速解決原本難以解決的問題[15]。

4 胚胎移植電子數(shù)據(jù)的建立

胚胎移植電子數(shù)據(jù)的建立對奶牛場開展胚胎移植管理具有重要意義，目前，粗放式管理對奶牛的生產(chǎn)性能、繁殖性能、譜系及后裔信息等記錄不全，不利于奶牛胚胎移植數(shù)據(jù)系統(tǒng)管理，造成奶牛場生產(chǎn)水平低下。而奶牛胚胎移植電子數(shù)據(jù)的建立可基于受體母牛電子耳標(biāo)，配備自動識讀器，通過無線網(wǎng)絡(luò)、智能化技術(shù)裝備、可視裝備、信息編碼、電子數(shù)據(jù)交換等技術(shù)對受體母牛的基本信息、移植胚胎來源基本信息及移植過程信息進行系統(tǒng)采集和管理。

對實施胚胎移植的奶牛場奶牛存欄量、品種、受體母牛及胚胎移植相關(guān)材料信息通過大數(shù)據(jù)實現(xiàn)自動獲取，用以支持胚胎移植過程管理。通過數(shù)據(jù)模塊對奶牛胚胎移植、奶牛群體檔案進行記錄和存儲，包括基本檔案，所有奶牛的血統(tǒng)資料，以及奶牛的繁殖性能測定、體形外貌評分、繁殖遺傳力評估結(jié)果等方面的資料，這些資料對于奶牛繁殖、生產(chǎn)管理與飼養(yǎng)等方面的工作具有重要的價值。另外，制定出一個與新疆奶牛場自身相適應(yīng)的繁殖循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)，在奶牛繁殖過程中，預(yù)先提醒繁殖過程中奶牛要發(fā)生的繁殖事件，在繁殖過程中出現(xiàn)意外狀況，就要重新進行運算和提醒。奶牛繁殖評價先要統(tǒng)計所有奶牛的資料，只有資料完整時，才能做出完整、準(zhǔn)確的評價，可根據(jù)奶牛場的現(xiàn)有實際情況，還有奶牛場的發(fā)展需要，分析牛群特征，然后在奶牛繁殖評價模塊中根據(jù)繁殖指標(biāo)，作出全面的繁殖評價結(jié)論，確定牛群繁殖現(xiàn)有狀況和發(fā)展方向，改進奶牛胚胎移植的方法。

5 胚胎移植技術(shù)前景

通過胚胎移植技術(shù)可以提高良種公畜的配種效率，充分挖掘優(yōu)良母畜的繁殖能力。胚胎移植技術(shù)還被應(yīng)用在肉牛雙胎的生產(chǎn)中[16]，提高生產(chǎn)效率。加快優(yōu)良品種繁育，品種資源保存等優(yōu)點，使得胚胎移植技術(shù)在國內(nèi)外的科研和商業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。

胚胎移植技術(shù)在家畜育種上可充分發(fā)揮優(yōu)良母畜在品種改良和育種中的作用，尤其是對于牛、羊等單胎家畜來說，可以通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)使得供體繁殖后代增加7～8 倍。并從更多的頭數(shù)中加大選擇強度，利用更多的親緣個體群的記錄從而提高選擇準(zhǔn)確性；可以增加后代的數(shù)量，縮短世代間隔。在特定品種擴繁上，對于牛、羊等單胎動物，通常獲得某一品種的純種一般需要經(jīng)過7～8 個世代，要15～20年的時間。而采用胚胎移植的方法，可以選擇純種母畜為供體，通過超數(shù)排卵和人工授精技術(shù)，一次就可獲得純種后代。20世紀(jì)80年代后期，隨著我國牛羊胚胎移植技術(shù)水平的提高，一些省市先后在中國荷斯坦牛、西門塔爾牛、安哥拉山羊、優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊的擴繁上應(yīng)用該項技術(shù)，使這些優(yōu)良品種的后代數(shù)量大大增加，為提高我國牛羊品種的整體水平起到了積極的作用。

在保護動物遺傳資源、提高家畜生產(chǎn)性能、挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術(shù)已經(jīng)越來越發(fā)揮出重要的作用。在偶蹄目和靈長目等動物上，國外通過手術(shù)方法和經(jīng)子宮頸的非手術(shù)方法移植胚胎獲得了后代。當(dāng)前國外已開始建立生殖細(xì)胞保存中心，即冷凍動物園。通過體外受精技術(shù)、冷凍精液的人工授精技術(shù)，將冷凍胚胎移植給亞種等來獲得后代的胚胎移植技術(shù)，不僅大量保存了珍貴的遺傳資源，而且也為珍稀動物的繁衍和國際交流創(chuàng)造了新的機遇。

目前我國胚胎移植技術(shù)正在快速發(fā)展，更多地應(yīng)用到畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域中，同時也促進了其他需要在體外操縱卵母細(xì)胞或胚胎的技術(shù)的開發(fā)，如試管受精、胚胎分割、性別鑒定[17]、基因動物的生產(chǎn)、基因編輯[18]以及核移植克隆[19]等技術(shù)。相信隨著與之相關(guān)的一些研究進一步加深，胚胎移植將發(fā)揮出更加廣闊的前景。