柚皮素對高脂與高糖誘導的小鼠非酒精性脂肪肝病的干預作用

葛晶晶，阮征*

（1 南昌大學食品學院 南昌330047 2 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室（南昌大學）南昌 330047）

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種高度流行的肝臟疾病，它與肥胖和代謝性疾病密切相關，其特點是在沒有過度飲酒和其它繼發(fā)性肝脂肪變性的情況下，脂肪在5%以上的肝細胞內積聚。NAFLD 是非酒精性肝炎（NASH）的早期階段，也是肝細胞癌的主要原因，同時增加一系列疾病的發(fā)病風險。近年來，也有人提出代謝性脂肪肝病（metabolic dysfunction-associated fatty liver disease，MAFLD）的術語來替代NAFLD，提供更廣泛的診斷標準，即存在脂肪變性，同時存在以下一種或多種癥狀，包括超重或肥胖、Ⅱ型糖尿病、兩種或兩種以上代謝風險異常[1]。歐洲和亞洲的患病率最高，其次是北美。一項歷時4.6 年，6 873 人參與的隊列研究調查了MAFLD 在中國的流行和發(fā)病率[2]，報告顯示，NAFLD和MAFLD 的患病率分別為40.3%和46.7%。近年來，NAFLD 在我國的發(fā)病率有較明顯的增長趨勢，到2030 年，中國NAFLD 患者總數預計將增至3.1458 億人[3]。

研究證明，腸道菌群紊亂引起的腸道通透性增加，在NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[4]。通過提升腸道通透性，增加循環(huán)中的有毒細菌代謝產物，如乙醇和脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）。這些代謝物將通過門靜脈進入肝臟，引起炎癥和脂肪變性[5]。另外，有研究[6]發(fā)現NAFLD 患者肝臟中存在高水平的菌群來源的LPS 定位，提示菌群來源的LPS 在NAFLD 的進展中發(fā)揮重要作用，同時強調了腸-肝軸的作用。綜上，腸道通透性的降低對解決非酒精脂肪肝病具有潛在影響。

柑橘類黃酮是柑橘中的活性成分，價格便宜，容易獲得，具有廣泛的降脂、抗炎、抗氧化和降血糖的作用。大量研究表明，柑橘類黃酮可以改善NAFLD 的癥狀，如調節(jié)脂質代謝、代謝紊亂[7-9]和在代謝重要組織如肝臟中減輕炎癥反應。柚皮素（Naringenin）是類黃酮的一種。此前的研究表明，柚皮素對脂質積累和肝臟脂肪變性有顯著影響[10]。柚皮素的保肝作用也表現在抗炎生物活力[11]，Tsuhako等[12]發(fā)現柚皮素能抑制短期高脂誘導小鼠脂肪組織的炎性浸潤。此外，柚皮苷（柚皮素的糖苷形式）可以促進腸道屏障，降低腸道通透性[13]。

Asgharpour 等[14]對C57BL/6J 小鼠飼喂高脂肪、高糖飲食后發(fā)生脂肪變性和脂肪性肝炎，小鼠表現出與人類疾病相似的代謝特征、脂質積累和組織學改變。此外，果糖在NAFLD 中有額外的作用，果糖損傷腸道屏障，導致腸道滲漏、內毒素血癥[15-16]。動物模型表明，果糖誘導的NAFLD 與腸道微生物過度生長引起的腸道通透性增加有關[17-18]。本試驗選擇高脂、高糖飲食誘導小鼠NAFLD，研究柚皮素對小鼠NAFLD 的緩解作用，同時通過檢測肝臟菌群衍生LPS 定位，研究柚皮素是否通過腸肝軸效應影響NAFLD。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

6 周齡雄性清潔級小鼠，體質量（20±2）g，由北京斯貝福生物科技有限公司提供。

甘油三酯（TG）試劑盒，南京建成生物工程研究所；白細胞介素-6（IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、脂多糖LPS 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；鼠單克隆大腸桿菌LPS 抗體（ab35654），艾博抗（上海）貿易有限公司；蘇木素-伊紅（H&E）染液（B1002），武漢佰仟度生物試劑有限公司；鼠維持飼料和高脂模型飼料，江蘇協(xié)同生物有限公司；果糖，山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司；柚皮素（＞90%），西安瑞林生物科技有限公司。其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

SMR60047 多功能酶標檢測儀，USCNK；Nikon Eclipse CI 正置光學顯微鏡，日本尼康；Nikon Eclipse E100 倒置熒光顯微鏡，日本尼康；NIKONDS-U3 成像系統(tǒng)Image-Pro Plus 6，日本尼康；AU5800 全自動生化分析儀，Beckman Coulter 公司；3K15 高速冷凍離心機，德國Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 NAFLD 小鼠模型建立 雄性健康的C57BL/6J 小鼠飼喂于SPF 級鼠房，室溫（24±2）℃，相對濕度（45±3）%，光照12 h/d，小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，將18 只小鼠隨機分為3 組，對照組（NCD）喂食普通飼料，模型組（HFFD）及柚皮素（NAR）組飼喂高脂飼料（60%能量來自脂肪）及果糖水（質量濃度為30 g/100 mL），NAR 組每天以0.4 g/（kg·d）劑量灌胃，NCD 組和HFFD 組分別給予等量生理鹽水。所有小鼠自由攝取食物及飲水。連續(xù)喂養(yǎng)9 周后，所有小鼠禁食不禁水12 h，眼球取血后采用脫頸法處死小鼠，取出肝臟，最小葉用4%多聚甲醛固定，HE 染色，切片，進行組織病理學檢查和免疫熒光染色；其余肝臟液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱直到測試。

1.3.2 指標測定 采用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、脂多糖水平及二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）水平。使用商用試劑盒測定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）濃度、肝臟中TG 濃度。采用ELISA 法檢測血清LPS 水平和肝臟促炎細胞因子、白細胞介素（IL）-6 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗按照說明書的方法進行。

1.3.3 肝組織病理形態(tài)與免疫熒光組織化學分析 用蘇木精和曙紅（H&E）染色石蠟切片（4 μm厚），于光學顯微鏡下觀察（200×與400×視野）。免疫熒光步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，BSA 封閉，加一抗4 ℃封閉過夜，脫色后加二抗避光室溫孵育50 min，DAPI 復染細胞核，封片，于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm；FITC 綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510～560，發(fā)射波長590 nm）。在倒置熒光顯微鏡下觀察（100×與200×視野）。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0 軟件將綠色/紅色熒光單色照片轉換為黑白圖片，然后選取相同的黑色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值IOD/AREA（Mean Density）。

1.4 數據處理

所有數據采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行處理，采用一般描述性統(tǒng)計數據進行分析，使用Graphpad8.0 作圖，數據表示為（平均值±標準差），P＜0.05 認為組間存在顯著性差異，P<0.01與P<0.001 認為組間存在極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 NAR 降低誘導的NAFLD 小鼠體質量、肝臟質量及附睪脂肪質量。

如表1 所示，試驗開始前，各組小鼠體質量無顯著差異。9 周后，HFFD 組小鼠相對NCD 組體質量極顯著增長（P<0.001），肝臟質量（P<0.001）、附睪脂肪質量（P<0.01）均極顯著升高；同時，相對HFFD 組，NAR 組小鼠體質量、肝臟質量顯著下降，NAR 組附睪脂肪質量與模型組無顯著差異。表明NAR 干預可顯著抑制高脂、高糖飲食誘導的體質量增長，減輕肝臟腫脹。

表1 NAR 降低高脂、高糖誘導的NAFLD 小鼠體質量、肝臟質量及附睪脂肪質量（n=6）Table 1 Naringenin reduce the body weight，liver weight，epididymis fat in NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

表2 柚皮素緩解高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠肝臟炎癥（ng/mg prot）（n=6）Table 2 Naringenin alleviate the hepatic inflammation on NAFLD mice fed with HFFD（ng/mg prot）（n=6）

2.2 NAR 降低誘導的NAFLD 小鼠血清和肝臟甘油三酯水平

如圖1 所示，與NCD 組相比，HFFD 組血清TC、TG、肝臟TG 水平顯著升高。NAR 灌胃顯著降低了血清TG 和肝臟TG 水平。這些結果表明，NAR 可以減輕NAFLD 小鼠血清與肝臟中的脂質堆積，在一定程度上能減輕NAFLD 的危害。

圖1 NAR 降低高脂、高糖誘導的NAFLD 小鼠血清和肝臟甘油三酯水平（n=6）Fig.1 NAR reduce the TG levels in serum and liver of NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

2.3 NAR 緩解高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠肝臟組織病理學變化

普通維持飼料喂養(yǎng)的NCD 組小鼠：肝組織結構基本正常，視野內肝細胞結構完整、輪廓清晰、胞核圓潤、胞質豐富，未見壞死、變性；肝竇大小均勻，未見擴張，肝索排列整齊緊密。高脂、高糖飼料喂養(yǎng)的HFFD 組小鼠：肝組織結構重度異常，輪廓不清晰，部分肝細胞壞死，視野內大面積肝細胞重度脂肪變性，胞質內可見大小不一的圓形脂滴，如紅色箭頭所示；NAR 灌胃的干預組小鼠：肝組織結構中度異常，視野內部分肝細胞脂肪變性，胞質內可見大小均勻的圓形脂滴，如紅色箭頭所示；肝細胞輪廓清晰，未見壞死；肝竇未見擴張，肝索排列規(guī)則。以上結果表明，柚皮素能緩解高脂、高糖飲食導致的肝臟組織病理損傷，減輕脂質堆積。

2.4 NAR 緩解高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠肝臟損傷

肝酶天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）升高是肝損傷的標志之一，預示著肝臟功能受損。如圖2 所示，與預期一樣，HFFD極顯著提高了小鼠血清中的AST 和ALT，表明小鼠肝臟受到損傷。而NAR 干預極顯著降低了AST（P<0.01）水平，顯著降低了ALT（P<0.05）水平，說明NAR 能在一定程度上緩解高脂、高糖飲食誘導的NAFLD 小鼠肝臟損傷。

圖2 柚皮素緩解高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠肝臟組織病理學變化Fig.2 Naringenin alleviate the changes of liver histopathology on NAFLD mice fed with HFFD

圖3 柚皮素緩解高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠肝臟損傷（n=6）Fig.3 Naringenin alleviate the hepatic injury on NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

2.5 NAR 緩解高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠肝臟炎癥

TNF-α 和IL-6 是LPS 在肝臟與TLR4 受體結合后刺激產生的促炎因子[19]，如圖4 所示，NAFLD 小鼠肝臟中的促炎因子TNF-α、IL-6 顯著升高。而灌胃NAR 使TNF-α 和IL-6 水平極顯著降低（P<0.001），恢復到正常水平，表明NAR 可以減輕NAFLD 小鼠中的炎癥反應，減輕肝臟損傷。

圖4 柚皮素減少高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠肝臟菌群衍生LPS 定位（n=3）Fig.4 NAR suppress bacteria derived LPS location in the liver of NAFLD mice fed with HFFD（n=3）

2.6 NAR 減少肝臟菌群衍生LPS 定位

菌群衍生的LPS 在NAFLD 的發(fā)展中起重要作用。有研究發(fā)現肝臟腸源性LPS 定位與肝損傷嚴重程度相關[6，20]，并且在NAFLD 和非酒精脂肪肝炎（NASH）患者中都發(fā)現了高水平的菌群衍生LPS[6]。LPS 在肝臟 中會結 合TLR4受體，激 活Kupffer 細胞和肝星狀細胞（HSC），導致炎癥反應，造成肝臟炎癥損傷[21]。如圖5 所示，免疫熒光分析顯示HFFD 組肝臟具有顯著的菌群衍生LPS 定位，而灌胃NAR 顯著減少了小鼠肝臟中的菌群衍生LPS。

圖5 柚皮素降低高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠腸道通透性（n=6）Fig.5 NAR reduce intestinal permeability in NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

2.7 柚皮素降低高脂、高糖誘導NAFLD 小鼠腸道通透性

高脂飲食會導致腸道微生物紊亂，導致腸道通透性上升，同時，有報道稱長期高糖飲食與內毒血癥有關。腸道通透性降低會導致菌群衍生的LPS 等物質進入門靜脈循環(huán)，從而觸發(fā)肝臟炎癥，造成肝臟損傷。本試驗檢測了血清LPS 及DAO 水平以確定腸道通透性的變化。如圖5 所示，HFFD組相對NCD 組血清LPS 與DAO 顯著上升，提示該組腸道通透性上升。灌胃NAR 顯著降低了血清LPS 的水平，降低了血清DAO 水平，雖然數據未達到顯著水平。表明NAR 灌胃可以降低NAFLD小鼠的腸道通透性，有助于肝臟菌群衍生LPS 的減少。

3 討論

柚皮素是廣泛存在于柑橘類水果的類黃酮之一，具有良好的抗脂、抗炎作用。在本試驗中，經過柚皮素灌胃后，小鼠體質量與肝質量顯著降低，血清與肝臟TG 顯著減少，AST、ALT 活力顯著降低，組織病理損傷改善，肝臟炎癥因子水平極顯著降低，表明柚皮素NAR 有效緩解了高脂、高糖誘導的小鼠非酒精性脂肪肝病，減輕了小鼠肝臟脂質堆積與炎癥，表明柚皮素對飲食（高脂、高糖）誘導的NAFLD 有良好的干預效果。

同時，柚皮素干預降低了腸道通透性，減少了肝臟菌群衍生的LPS。飲食通過調節(jié)腸道微生物群影響腸道通透性，如高脂和高糖飲食會導致腸道菌群紊亂，腸道通透性增加，促進內毒血癥，增加進入門脈循環(huán)的脂多糖（LPS）的增加，這種腸肝軸效應是目前NAFLD 的治療靶點之一[22]，本試驗確定了柚皮素可以通過這種腸肝軸效應減輕肝臟炎癥損傷。LPS 是革蘭氏陰性菌的產物，過度衍生的產LPS 菌群也會導致進入門靜脈循環(huán)的LPS 增加。同時乳糜微粒生物合成的增強也會導致LPS易位[23]。因此需要進一步試驗確定柚皮素減少肝臟菌群衍生LPS 的原因。