基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究藥膳“枸杞-桑椹-覆盆子湯”治療糖尿病腎病的分子機(jī)制

任晨汐，卞燦鋒，李 寧，高 雅，張玉霞，胡 欽，肖麗霞，關(guān)天竺,*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130062）

糖尿病腎病是以持續(xù)性蛋白尿、血壓升高以及腎功能下降為主要特征的疾病，是糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一，在我國的發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì)，已成為終末期腎臟病的主要原因[1-2]。眾多研究表明，糖尿病腎病發(fā)病原因極為復(fù)雜，至今仍未完全闡明，機(jī)體在糖尿病腎病的特殊環(huán)境下，免疫細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄因子、促炎細(xì)胞因子、趨化因子和自身抗體等免疫因素相互影響，造成腎功能的損害，而其中氧化應(yīng)激反應(yīng)是參與糖尿病腎病啟動(dòng)和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一，即過量的活性氧作用于各種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，抑制抗氧化酶的表達(dá)，最終導(dǎo)致糖尿病腎病腎組織中相關(guān)應(yīng)激損傷的發(fā)生進(jìn)程[3-4]。2019年國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)表明：全球20～79 歲成人糖尿病患者約4.63 億人，其中20%～40%的患者患有糖尿病腎病，可見糖尿病腎病的高患病率已成為世界性的重大公共衛(wèi)生問題[5-6]。隨著糖尿病腎病研究的不斷深入，基于藥食同源、中藥材中的活性成分在基于多靶點(diǎn)協(xié)同作用及緩解氧化應(yīng)激進(jìn)程等改善腎臟病變作用越來越受到人們的關(guān)注[7]。

藥膳是指采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)加工方法，將不同藥食同源材料進(jìn)行合理組方配伍并制作成具有保健防病作用的特殊膳食[8]?！妒朝煴静荨纷鳛楝F(xiàn)存最早的一部藥膳學(xué)專著，其推崇的“藥食同源、醫(yī)食同源”的思想，對(duì)藥膳的發(fā)展起到了推動(dòng)作用[9]。從中醫(yī)視角看，枸杞滋肝補(bǔ)腎，桑椹補(bǔ)腎養(yǎng)肝，覆盆子固精縮尿益肝腎[10]。因此，在民間早有在“大寒”時(shí)煮制“枸杞-桑椹-覆盆子湯”的悠久歷史與傳統(tǒng)。近年來，大量體內(nèi)或體外研究表明，枸杞、桑椹和覆盆子中的活性成分可用于治療糖尿病腎病，如李菁菁等[11]通過研究枸杞多糖對(duì)糖尿病腎病兔子腎功能的影響證實(shí)枸杞多糖能夠明顯延緩腎臟損傷。謝欣梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，覆盆子中的活性成分覆盆子酮可增加胰島素分泌，具有劑量依賴性的降血糖效果。Chen 等[13]證明了桑椹提取物對(duì)糖尿病小鼠具有顯著的降糖與多種活性功能。各方面皆表明藥膳“枸杞-桑椹-覆盆子湯”對(duì)于糖尿病腎病有潛在治療效果，但具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本文遵循平衡陰陽、扶正驅(qū)邪、三因制宜等應(yīng)用原則[14]，以“枸杞-桑椹-覆盆子”為藥膳方研究其在糖尿病腎病中的應(yīng)用。

藥膳在多成分、多靶點(diǎn)、多通路的多因素復(fù)雜疾病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但目前其活性成分與人體內(nèi)潛在作用機(jī)制尚不明確，因此難以從“整體-細(xì)胞-分子”水平進(jìn)行全面的理論研究[15]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為以系統(tǒng)生物學(xué)和大數(shù)據(jù)技術(shù)為理論基礎(chǔ)的學(xué)科，可通過網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等多角度對(duì)相關(guān)疾病的形成與發(fā)展進(jìn)行解釋，廣泛應(yīng)用于中藥組方與新興藥理學(xué)，具備“疾病-靶向基因-活性成分”多角度與多層次的特點(diǎn)，這也與食品領(lǐng)域中食療藥膳潛在作用機(jī)制研究的內(nèi)核十分契合，因此具有發(fā)展?jié)摿εc優(yōu)勢(shì)[16-17]。利用藥膳在多維視角上干預(yù)糖尿病腎病的氧化應(yīng)激途徑，不僅具有適用范圍廣、可操作性強(qiáng)、接受度高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，更對(duì)藥膳進(jìn)行基礎(chǔ)與理論研究具有重要意義。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子模擬與體外抗氧化方法，研究了藥膳“枸杞-桑椹-覆盆子湯”防治糖尿病腎病的潛在機(jī)制，以期為糖尿病腎病的食療開發(fā)與后續(xù)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

桑椹、枸杞、覆盆子：江蘇揚(yáng)州聯(lián)誼農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；2,2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（98%）、L-抗壞血酸（≥99%）、硫酸亞鐵（90%無水）、水楊酸（HPLC≥98%）、H2O2（30%水溶液）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1-14K 型離心機(jī)：北京博勱行儀器有限公司；DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)（太倉精宏儀器）設(shè)備有限公司；SS-1022型高速多功能粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司；KQ5200 型超聲機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀：帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；UV-6100S型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥膳的活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)收集

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（Traditional chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）（https://old.tcmspp-e.com/tcmsp.php/）分別檢索“枸杞-桑椹-覆盆子湯”中3 味藥食同源材料，以枸杞子（Lycii fructus）、桑椹（Mori fructus）、覆盆子（Rubi fructus）為關(guān)鍵詞初步獲取化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)，同時(shí)對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的活性成分進(jìn)行補(bǔ)充[18-21]。由于“枸杞-桑椹-覆盆子湯”屬于口服方劑，因此以口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和類藥性指數(shù)（Drug-likeness,DL）≥0.18為篩選條件分別確定活性化學(xué)成分。然后通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，通過將蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot）（http://www.uniprot.org/）限定物種為“Homo sapiens”后，對(duì)上述靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.2 糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)篩選

分別在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/search）中以“diabetic kidney disease”為關(guān)鍵詞，搜索糖尿病腎病相關(guān)基因，獲得糖尿病腎病的潛在靶點(diǎn)。

1.2.3 “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

利用Cytoscape 3.8.0 構(gòu)建“活性成分-疾病靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)，邊代表節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系。

1.2.4 基于交集靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的有效成分與糖尿病腎病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0（https://cn.string-db.org/），設(shè)定物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建“枸杞-桑椹-覆盆子湯”治療糖尿病腎病共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)對(duì)交集靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系進(jìn)行可視化分析。

1.2.5 核心團(tuán)簇及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

利用Cytoscape 中MCODE 插件對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行聚類分析，選取網(wǎng)絡(luò)中關(guān)系最為緊密的核心團(tuán)簇（Core cluster）。然后利用CytoHubba 插件，對(duì)核心團(tuán)簇進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)相關(guān)分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)介度中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）和借助度中心性（Degree）分別進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)逐層篩選。

1.2.6 交集基因的基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

將共同基因靶點(diǎn)通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行在線基因ID轉(zhuǎn)換，并對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程（Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，CC）及分子功能（Molecular function,MF）的GO注釋分析和KEGG通路富集分析，以校正后P值小于0.05為條件進(jìn)行“枸杞-桑椹-覆盆子湯”中治療糖尿病腎病生物學(xué)過程和信號(hào)通路的分析。

1.2.7 分子對(duì)接

分別從PubChem 數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取初始的活性化學(xué)分子和靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)文件。使用AutoDock Tools 1.5.6 軟件進(jìn)行去水加氫，采用AutoDock Vina進(jìn)行核心靶點(diǎn)-活性成分分子對(duì)接，計(jì)算最低結(jié)合能，最后利用PyMol 對(duì)蛋白與分子結(jié)合模式進(jìn)行可視化分析。

1.2.8 抗氧化活性測(cè)試

1.2.8.1 “枸杞-桑椹-覆盆子湯”抗氧化物質(zhì)提取

將組方“枸杞-桑椹-覆盆子”于60 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后過120 目篩，按料液比1∶10（g/mL）加入無水乙醇，然后置于50 ℃、超聲功率300 W條件下提取30 min，再以8 000 r/min離心20 min，取上清液為待測(cè)液。

1.2.8.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

精確移取0.1 mL質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/mL 的VC 標(biāo)準(zhǔn)溶液或提取樣液，與5.0 mL 濃度為0.16 mmol/mL的DPPH乙醇溶液混合均勻，于避光處靜置30 min。取上清液于517 nm條件下測(cè)定吸光度值，記為A1；用無水乙醇代替VC 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣液，測(cè)定517 nm 處的吸光度值，記為A0；用無水乙醇代替DPPH 自由基溶液，測(cè)定517 nm 處的吸光度值，記為A2。通過以下公式[22]計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.2.8.3 羥基自由基清除率的測(cè)定

在比色管中加入1 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/mL）、1 mL水楊酸的無水乙醇溶液（9 mmol/mL）、1 mL質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液或提取樣液、1 mL過氧化氫溶液（8.8 mmol/mL），然后搖勻，在37 ℃下反應(yīng)30 min，于510 nm處測(cè)定吸光度值，記為A1；用1 mL 蒸餾水代替樣液，測(cè)定510 nm 處吸光度值，記為A0；用1 mL 蒸餾水代替過氧化氫溶液，測(cè)定510 nm 處吸光度值，記為A2。通過以下公式[23]計(jì)算羥基自由基清除率。

1.2.8.4 ABTS陽離子自由基清除率的測(cè)定

按ABTS試劑盒要求將ABTS原液和氧化劑按1∶1混合后于4 ℃冰箱避光反應(yīng)16 h 后制成ABTS 母液，將其稀釋至在734 nm處吸光度值為0.700±0.020。移取2 mL 質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/mL 的VC 標(biāo)準(zhǔn)溶液或提取樣液，加入2 mL ABTS 工作液混合均勻，室溫避光反應(yīng)20 min，于波長734 nm處測(cè)定吸光度值，記為A1；用1 mL 蒸餾水代替樣液，測(cè)定734 nm 處吸光度值，記為A0；用1 mL 蒸餾水代替ABTS溶液，測(cè)定734 nm處吸光度值，記為A2。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式[24]如下：

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以ˉx±s表示。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定兩組之間的差異是否具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥膳“枸杞-桑椹-覆盆子湯”活性成分及活性成分靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到已報(bào)道的活性成分共392個(gè)，其中枸杞子189個(gè)、桑椹91個(gè)、覆盆子112個(gè)。經(jīng)去重并以DL≥0.18，OB≥30%為條件進(jìn)行篩選后，共得到有效化學(xué)成分55個(gè)。同樣基于TCMSP數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，對(duì)預(yù)測(cè)所得作用靶點(diǎn)匯總?cè)コ貜?fù)項(xiàng)后通過UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化，共得209個(gè)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

2.2 糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

如圖1A 所示，通過GeneCards、OMIM、TTD、Dis-GeNET數(shù)據(jù)庫檢索出糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)分別為273 個(gè)、252 個(gè)、27 個(gè)和206 個(gè)。剔除重復(fù)項(xiàng)后，共得糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)641 個(gè)。如圖1B 所示，將糖尿病腎病作用靶點(diǎn)與208 個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)取交集，得65個(gè)共同靶點(diǎn)。由此可初步推測(cè)，藥膳“枸杞-桑椹-覆盆子湯”通過“多成分-多靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)作用于糖尿病腎病。

圖1 藥膳與糖尿病腎病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)圖Fig.1 The prediction diagram of medicated diet and diabetic kidney disease targets

2.3 “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖分析

如圖2 所示，將藥食同源材料、分子活性成分和65 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構(gòu)建“活性成分-糖尿病腎病共同靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)。其中：多邊形為經(jīng)篩選后的活性分子成分，而長方形代表靶點(diǎn)。通過對(duì)可視化網(wǎng)絡(luò)的總體特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，55 個(gè)活性成分中存在一個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶蛋白的情況，也存在多個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)同一個(gè)靶蛋白的情況，表明“枸杞-桑椹-覆盆子”具備多活性成分、多靶標(biāo)的作用特點(diǎn)[25]。

圖2 “枸杞-桑椹-覆盆子湯-活性成分-糖尿病腎病共同靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Visualization network of‘Chinese wolfberry-mulberry-raspberry decoction-active ingredient-diabetic nephropathy co-targets’

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)篩選

為了進(jìn)一步了解活性化合物作用靶點(diǎn)與糖尿病腎病相關(guān)蛋白間的交集蛋白的相互作用關(guān)系，構(gòu)建交集靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)。如圖3 所示，共獲得64個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 040 個(gè)相互作用（邊），經(jīng)MCODE 進(jìn)行核心團(tuán)簇分析后得到兩個(gè)核心團(tuán)簇。其中：核心團(tuán)簇1（圖3B）為3 個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 個(gè)相互作用（邊）；核心團(tuán)簇2（圖3C）為43個(gè)節(jié)點(diǎn)和742個(gè)相互作用（邊）。

圖3 交集靶點(diǎn)PPI及核心簇分析Fig.3 PPI network of intersection targets and core cluster analysis

如圖4所示，在上述核心團(tuán)簇中分別以介度中心性、接近中心性和借助度中心性為指標(biāo)，共篩選出5個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為白介素6（IL6）、人白介素-1β（IL1B）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）和血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA），這些靶點(diǎn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位，推斷它們是藥膳治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 “枸杞-桑椹-覆盆子湯”核心靶點(diǎn)篩選Fig.4 Identification of hub genes of Sanzi decoction

2.5 GO富集分析

如圖5 所示，GO 富集分析進(jìn)一步解釋了“枸杞-桑椹-覆盆子湯”治療糖尿病腎病的潛在機(jī)制。交集靶點(diǎn)經(jīng)富集分析后可以看見這些核心靶點(diǎn)以交互且復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)態(tài)發(fā)揮作用，并非獨(dú)立作用。基因表達(dá)的正調(diào)控（Positive regulation of gene expression）、DNA模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（Positive regulation of transcription,DNA-templated）、凋亡的負(fù)反饋（Negative regulation of apoptotic process）、藥物反應(yīng)（Response to drug）、衰老（Aging）等生物學(xué)過程在參與糖尿病腎病的調(diào)控中起到主要作用；細(xì)胞組分集中于血小板顆粒腔（Platelet alpha granule lumen）、胞質(zhì)成分（Cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、質(zhì)膜（Plasma membrane）、細(xì)胞外間隙（Extracellular space）等；而分子功能富集于蛋白結(jié)合（Protein binding）、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段（Cysteine-type endopeptidase activity involved in execution phase of apoptosis）、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程（Cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）、同源蛋白結(jié)合（Identical protein binding）、酶結(jié)合（Enzyme binding）等，如核心靶點(diǎn)之一的PPARG 可與內(nèi)源性配體發(fā)生廣譜性結(jié)合，形成復(fù)合物，進(jìn)而使受體發(fā)揮系列生物學(xué)效應(yīng)[26-27]。此外，CASP3作為半胱氨酸蛋白酶的重要成員，可通過半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程作用于糖尿病腎病的調(diào)控[28-29]。

圖5 交集靶點(diǎn)GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of the intersection targets

2.6 KEGG富集分析

通路分析在系統(tǒng)藥理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，它不但可以通過將數(shù)千個(gè)基因蛋白分組到幾百條通路中來降低功能分析的復(fù)雜性，而且可以增加解釋效率。如圖6 所示，按-lgP由大到小排名，取前10繪制KEGG 通路富集分析氣泡圖，圖中氣泡越大，代表富集到本通路的基因越豐富，進(jìn)而表示在此通路發(fā)揮的作用也越明顯且重要。通過KEGG 通路富集共得到214條通路，其中排名靠前的相關(guān)通路為癌癥途徑（Pathways in cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、癌癥中蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease）和缺氧誘導(dǎo)因子1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway），它們以發(fā)揮協(xié)同作用來治療糖尿病腎病。其中，AGE-RAGE通路可以激活NF-κB，以及通過激活NADPH 氧化酶導(dǎo)致NF-κB活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞活化及組織損傷，并可使這一過程重復(fù)而致惡性循環(huán)；另可通過刺激血管內(nèi)皮生長因子造成血管通透性增加，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[30-31]。此外，F(xiàn)luid shear stress and atherosclerosis 通路是抑制炎癥、血管舒張、抗動(dòng)脈粥樣硬化的主要途徑[32]。這些信號(hào)通路在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中起核心作用，表明“枸杞-桑椹-覆盆子湯”可能作用于這些信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的治療作用。

圖6 交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathpay enrichment analysis of the intersection targets

2.7 分子模擬

選擇活性成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中含最多相關(guān)靶基因的有效活性蛋白為對(duì)接配體。選擇交集基因拓?fù)浞治龅暮诵幕颍篒L6、IL1B、PPARG、MMP9、VEGFA共5 個(gè)，分別與活性成分β-谷甾醇（MOL000358：Beta-sitosterol）、大豆黃素（MOL008400：Glycitein）、桑色素（MOL000737：Morin）、槲皮素（MOL000098：Quercetin）、β-胡蘿卜素（MOL002773：Beta-carotene）和鞣花酸（MOL001002：Ellagic acid）進(jìn)行分子對(duì)接。使用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并計(jì)算各個(gè)蛋白與小分子配體的最低結(jié)合能，如圖7 所示，結(jié)合能小于0 kcal/mol 代表復(fù)合物可進(jìn)行自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越小，結(jié)合能熱圖越接近紅色，構(gòu)象越穩(wěn)定。在本研究中，全部活性靶點(diǎn)與關(guān)鍵化學(xué)成分間的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明靶點(diǎn)與成分間不但能自發(fā)結(jié)合，更表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，進(jìn)一步從理論計(jì)算的角度驗(yàn)證了“枸杞-桑椹-覆盆子湯”中“多活性成分-多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。

圖7 關(guān)鍵成分與作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)合能熱圖Fig.7 The heatmap of molecular docking binding energy between hub compounds and action targets

圖8 為核心蛋白與活性成分相互作用的2D 和3D 示意圖，圖中所示為5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分形成的結(jié)合能最強(qiáng)的復(fù)合物，復(fù)合物及結(jié)合能分別為：IL6-Glycitein（-8.7 kcal/mol），PPARG-Quercetin（-8.9 kcal/mol），IL1B-Ellagic acid（-6.7 kcal/mol），MMP9-Beta-sitosterol（-7.3 kcal/mol），VEGFA-Betasitosterol（-6.1 kcal/mol）。槲皮素是廣泛存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，且與本研究中所有核心靶點(diǎn)皆有較強(qiáng)的親和力（結(jié)合能＜-5 kcal/mol）。如圖8E 所示，槲皮素與PPARG 形成了以Carbon hydrogen bond、Alkyl、Pi-Alkyl 和Pi-Sigma 等作用力共同驅(qū)動(dòng)的復(fù)合物，結(jié)合能達(dá)-8.9 kcal/mol，說明槲皮素在“枸杞-桑椹-覆盆子湯”中的活性作用顯著，具有很大的應(yīng)用潛力。此外，β-谷甾醇作為植物甾醇的一種，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降脂、抗腫瘤等作用[33-35]，同樣與本研究中的核心靶點(diǎn)具有相當(dāng)廣譜的親和力（結(jié)合能＜-6 kcal/mol）。PPARG 是一種重要的細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，屬過氧化物酶體增殖物激活受體家族中的一個(gè)亞型，研究表明，高糖可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)PPARG表達(dá)的下調(diào)[36]。而本研究中的6 種活性成分均與PPARG 呈穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象，其中β-谷甾醇、槲皮素與鞣花酸分別與PPARG 呈較高的親和力（結(jié)合能＜-8 kcal/mol）。同樣，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的異常表達(dá)與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)。在糖尿病腎病早期，VEGF 的表達(dá)顯著增多，從而引起進(jìn)展性蛋白尿、腎小球塌陷，導(dǎo)致腎功能衰竭。而血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）作為最主要的血管內(nèi)皮生長因子，主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管和集合管，對(duì)維持腎小球?yàn)V過屏障的完整性和足細(xì)胞活性有重要意義[37]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，“枸杞-桑椹-覆盆子湯”的核心活性成分可以很好地與主要潛在靶點(diǎn)結(jié)合，驗(yàn)證了活性成分治療糖尿病腎病的可能性。

圖8 關(guān)鍵成分與作用靶點(diǎn)的結(jié)合模式圖Fig.8 Binding pattern of hub compounds and action targets

2.8 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

如圖9 可知，“枸杞-桑椹-覆盆子湯”提取物對(duì)DPPH 自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大。提取物質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為47.92%，對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率為58.58%，對(duì)羥基自由基的清除率為36.60%；在質(zhì)量濃度為100 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除率可達(dá)76.78%，對(duì)ABTS 陽離子自由基的清除率為84.02%，對(duì)羥基自由基的清除率為67.70%。研究表明，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制是由多因素共同決定的，體內(nèi)氧化劑與抗氧化劑之間的失衡與糖尿病腎病發(fā)展存在密切聯(lián)系。楊曉曦等[38]研究表明，芡實(shí)醇提物可作為備選的自由基清除成分，其不僅具有降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白的作用，更具有較強(qiáng)的抗氧化能力。同樣，崔丹丹[39]通過體外抗氧化與體內(nèi)模型驗(yàn)證表明，羅漢果多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力與減輕腎臟負(fù)荷、損傷的作用，可以減輕糖尿病腎病相關(guān)癥狀，因此對(duì)氧化應(yīng)激的抑制可作為治療糖尿病腎病的一種可行性方法。本研究結(jié)果表明，“枸杞-桑椹-覆盆子湯”提取物對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基和ABTS 陽離子自由基均具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，該結(jié)果為后續(xù)“枸杞-桑椹-覆盆子湯”復(fù)雜發(fā)病機(jī)制研究提供了一定的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本文通過“枸杞-桑椹-覆盆子湯”活性成分收集、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)篩選，發(fā)現(xiàn)“枸杞-桑椹-覆盆子湯”可通過β-谷甾醇、大豆黃素、桑色素、槲皮素、β-胡蘿卜素和鞣花酸等活性成分作用于IL6、IL1B、PPARG、MMP9和VEGFA等核心靶點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果表明，全部活性靶點(diǎn)與關(guān)鍵化學(xué)成分之間的結(jié)合能小于-5 kcal/mol，表明靶點(diǎn)與成分之間可自發(fā)形成具有相當(dāng)結(jié)合力且可發(fā)揮生物學(xué)功能的復(fù)合物。GO 與KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，“枸杞-桑椹-覆盆子湯”對(duì)防治糖尿病腎病主要通過癌癥途徑、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等通路發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的治療作用。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，“枸杞-桑椹-覆盆子湯”具有較強(qiáng)的抗氧化能力，說明抑制抗氧化應(yīng)激通路也可能是預(yù)防糖尿病腎病的潛在路徑之一。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)“枸杞-桑椹-覆盆子湯”中活性成分、靶點(diǎn)、通路和體外抗氧化分析發(fā)現(xiàn)，具備“多成分、多靶點(diǎn)和多通路”特點(diǎn)的“枸杞-桑椹-覆盆子湯”具有治療和預(yù)防糖尿病腎病的潛力，但后續(xù)仍需進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)和體外試驗(yàn)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行分子層面的探討。本研究可為“枸杞-桑椹-覆盆子湯”防治糖尿病腎病作用機(jī)理與功能性應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。