基于還原氧化石墨烯的電化學(xué)適配體傳感器對黃曲霉毒素M1的檢測

惠媛媛，王畢妮，張富新，彭海帥，劉玉芳，賈 蓉，任 榮

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710119）

黃曲霉毒素（AFS）是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一類具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，其具有很高的毒性和很強的致癌能力[1]。在整個黃曲霉毒素家族中，黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最大、致癌能力最強，且在濕熱的環(huán)境中，玉米、花生、堅果、棉籽等農(nóng)產(chǎn)品極易被黃曲霉毒素B1污染，即使?jié)舛容^低，AFB1也會對人類和動物的健康構(gòu)成嚴重的威脅，如免疫失調(diào)、黃疸、肝癌、腎癌和乳腺癌等[2?3]。黃曲霉毒素M1（AFM1）是黃曲霉毒素B1的代謝產(chǎn)物，當(dāng)哺乳動物被喂食AFB1污染的飼料時，AFB1在肝酶細胞色素P450 的參與下在肝臟中被羥基化為AFM1，隨后分泌到哺乳動物的乳汁中[4?5]。AFM1耐高溫，在常規(guī)的乳制品滅菌過程中（如巴氏滅菌）是相當(dāng)穩(wěn)定的，如果它存在于原料奶中，可能持續(xù)存在于供人類食用的最終產(chǎn)品中，考慮到人類，尤其是嬰幼兒對乳制品的需求量較大。為了防止食品安全事件的發(fā)生，世界各國家對乳及乳制品中AFM1含量都制定了限量標(biāo)準，中國和美國的限量為0.5 μg/kg，歐盟的規(guī)定更加嚴格為0.05 μg/kg。因此，AFM1檢測方法對于防止其危害具有重要意義。

傳統(tǒng)的黃曲霉毒素檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。HPLC和LC-MS 因其準確性和靈敏度高成為目前最常用的技術(shù)，然而這兩種方法由于樣品前處理復(fù)雜、儀器昂貴且需專業(yè)人員操作等缺點限制其應(yīng)用。ELISA雖然操作簡單，但是對于真菌毒素的定量檢測易出現(xiàn)假陽性。

近年來，電化學(xué)適配體傳感器因其特異性好、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點在抗生素、重金屬、致病菌、毒素等檢測中被廣泛應(yīng)用。對于高靈敏的電化學(xué)適配體傳感器，納米材料起了至關(guān)重要的作用。氧化石墨烯（GO）是一種具有代表性的單原子厚度（0.35～6 nm）、二維（2D）蜂窩晶格和sp2 雜化碳晶體的碳納米材料[6?7]。GO 的碳原子層平面上以及邊緣區(qū)域存在著大量的含氧官能團，如羥基、羧基和環(huán)氧基等[8]，這些官能團的存在使得GO 的化學(xué)性質(zhì)比較活潑，容易與有機物結(jié)合反應(yīng)。因此在使用時常通過還原法去掉其表面的官能團，常用的處理方法是化學(xué)還原法，如采用肼/肼衍生物或硼氫化鈉作為還原劑，但是這種方法有其缺陷（還原過程中常常涉及到有毒化學(xué)物質(zhì)）。近年來，產(chǎn)生了一個新的化學(xué)術(shù)語“綠色還原”，它主要是一種以生物分子、微生物和植物提取物為還原劑的綠色納米技術(shù)，在金屬納米顆粒的合成中得到了廣泛的應(yīng)用。其中涉及到納米顆粒的生物還原、形成和穩(wěn)定的化學(xué)成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、生物堿、醇類衍生物、多酚化合物、酶、螯合劑和維生素等生物分子[9?10]，該技術(shù)也適用于氧化石墨烯的生物還原，得到的石墨烯（RGO）比表面積大、電子傳遞能力強。例如，Weng 等[11]用綠茶提取物（綠茶提取物中含有多酚）還原氧化石墨烯。Kuila 等[12]研究了胡蘿卜根在制備石墨烯中的潛力。Kartick 等[13]使用椰子汁建立了氧化石墨烯的綠色還原反應(yīng)。Mahmoud 等[14]通過玫瑰水還原氧化石墨烯，合成了單層還原氧化石墨烯納米片，所得的RGO 很容易分散在水中，懸浮穩(wěn)定性很好，30 d后未見沉淀，且實驗證明該材料在生物傳感器的構(gòu)建中具有良好的潛力。

紅棗是鼠李科棗屬植物的成熟果實，紅棗富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、有機酸、碳水化合物等[15?17]，此外還含有多糖、皂苷、生物堿、黃酮和三萜類等功能成分[18]。研究表明紅棗中的酚類化合物（黃酮、花青素、酚酸類化合物）、還原性糖、維生素C 等具有較強的抗氧化活性[19?21]，抗氧化劑通常具有還原性，而紅棗中天然抗氧化劑的存在可能顯示出將棗汁作為綠色還原劑的巨大潛力。

本研究構(gòu)建了一種綠色、簡便及快速的電化學(xué)適配體傳感器用于檢測黃曲霉毒素M1。利用原紅棗汁還原氧化石墨烯得到還原氧化石墨烯，在玻碳電極（GCE）表面滴涂還原氧化石墨烯，然后在氯金酸溶液中電沉積納米金，巰基化的適配體通過Au-S 鍵固定在電極表面，當(dāng)待測液中存在靶標(biāo)時，靶標(biāo)與適配體的特異性結(jié)合阻礙了電極表面電子的傳遞，通過監(jiān)測電極表面的電化學(xué)信號變化完成對AFM1的定量檢測，該方法對于真菌毒素的快速檢測具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 狗頭棗，華潤萬家超市（西安，陜西）；羊乳樣品 紅星美羚乳業(yè)股份有限公司（西安，陜西）；黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB1）、黃曲霉毒素M1（AFM1）、赭曲霉毒素A（OTA）、伏馬毒素B1（FB1） 美國Sigma 公司；三水合氯化金（HAuCl4·3H2O）、6-巰基-1-己醇（MCH）、檸檬酸三鈉（99%）、鐵氰化鉀（k3[Fe（CN）6]）、亞鐵氰化鉀（k4[Fe（CN）6]）、石墨粉等試劑 阿拉丁試劑有限公司（上海，中國）；高錳酸鉀（KMnO4）、濃硫酸（H2SO4）、硝酸鈉（NaNO3）、H2O2、甲醇 均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；巰基化的適配體 序列如下：AFM1適配體（Apt）:3’-CAC CGA GAC ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT TTC TGT GTG TCC-（CH2）6-SH-5’（AFM1的適配體序列參考以下文獻[22]），生工生物科技有限公司（上海，中國）；實驗用水 均為超純水。

CHI660E 電化學(xué)工作 上海辰華儀器有限公司；水浴鍋 余姚市東方電子儀器廠；pH 計 上海精密儀器儀表有限公司；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱

賽福實驗儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原棗汁、發(fā)酵棗汁、原棗汁和發(fā)酵棗汁中多酚的制備

1.2.1.1 原棗汁 取600 mL 的蒸餾水加入到100 g干凈且去核的狗頭棗中，然后打漿、離心、過濾，得到的棗汁置于4 ℃的冰箱備用。

1.2.1.2 發(fā)酵棗汁 取600 mL 的蒸餾水加入到100 g干凈且去核的狗頭棗中，然后打漿、離心、過濾，得到的棗汁于121 ℃的高壓蒸汽滅菌鍋中，滅菌20 min，棗汁滅完菌后放置于無菌室中，使其冷卻至室溫。然后按棗汁體積的1%的量接種植物乳桿菌，震蕩混勻，在37 ℃發(fā)酵24 h，得到的漿液經(jīng)離心、過濾得到發(fā)酵棗汁。

1.2.1.3 原棗汁中多酚的提取 取100 mL 原棗汁，然后加入等體積的80%甲醇溶液（V/V），1000 W 超聲提取30 min，3000 r/min 離心10 min 后收集上清液，重復(fù)提取3 次，合并三次提取液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用甲醇定容至100 mL，放置于4 ℃冰箱備用。

1.2.1.4 發(fā)酵棗汁中多酚的提取 使用100 mL 的發(fā)酵棗汁，參照1.2.1.3 步驟進行提取。

1.2.2 氧化石墨烯（GO）和還原氧化石墨烯（RGO）的制備 以石墨粉為原料，采用Hummers 法制備氧化石墨烯（GO）[23?24]。具體步驟如下：在冰浴條件下，將2.0 g 石墨粉和1.6 g 硝酸鈉與67.5 mL 的濃硫酸（98%）混合均勻，然后加入9.0 g KMnO4并磁力攪拌40 min，撤去冰浴，繼續(xù)攪拌48 h 之后，緩慢加入560 mL 去離子水，98 ℃保持30 min，然后加入適量H2O2（30%）還原殘留的氧化劑至懸浮液變?yōu)榱咙S色，然后8000 r/min 離心，去除上清液后，用HCl（5%）溶液和去離子水洗滌、真空干燥即得GO。

將0.5 g 制備好的GO 分散在1 L 的超純水中超聲30 min。然后將紅棗汁與GO 分散體混合，在80 ℃的水浴中加熱8 h。反應(yīng)后得到RGO 用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾并用超純水清洗三次以除去雜質(zhì)。在不同的pH（2，4.2，5，8，11）下重復(fù)合成，其中pH 由HCl 或NaOH 溶液（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)，GO 與棗汁的比例（3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，V/V）。所得GO和RGO 的形貌及元素分布由環(huán)境掃描電鏡（Quanta 200，F(xiàn)EI 公司）進行表征。

1.2.3 電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建 電化學(xué)適體傳感器的構(gòu)建步驟如圖1所示。在修飾之前，采用0.05 μm 的Al2O3粉末對所用的GCE 進行打磨處理，然后在乙醇水溶液（1:1）中超聲清洗5 min，最后采用氮氣將電極表面吹干。在打磨好的電極表面滴涂上事先制備好的RGO（10 μL），用紅外燈烘干。之后將電極浸入1% HAuCl4溶液中，采用i-t恒電位法電沉積納米金，沉積電位為?0.2 V，沉積時間為40 s。隨后將GCE 電極浸入30 μL 的Apt 溶液中，室溫下孵育40 min 后用超純水沖洗，以除去未結(jié)合的適配體，再將10 μL 的MCH（2.0 mmoL/L）溶液滴涂于電極表面反應(yīng)30 min，MCH 不僅可以防止非特異性吸附，還能保持適配體的線性結(jié)構(gòu)，有利于靶標(biāo)與其結(jié)合。最后，將電極浸入不同濃度的黃曲霉毒素M1溶液中，于37 ℃下反應(yīng)40 min 后，用超純水清洗。差分脈沖伏安法（DPV）記錄電化學(xué)信號，實現(xiàn)對黃曲霉毒素M1的檢測。

圖1 基于還原氧化石墨烯的電化學(xué)適配體傳感器檢測AFM1 原理圖Fig.1 Schematic of the electrochemical aptasensor for the detection of AFM1 based on RGO

1.2.4 電化學(xué)檢測 循環(huán)伏安法（CV），方波伏安法（SWV）和差分脈沖伏安法（DPV）測量均在CHI660E電化學(xué)工作站上進行，采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，GCE 為工作電極，Ag/AgCl（飽和KCl 溶液）為參比電極，鉑絲為對電極。CV 和SWV 實驗在5 mL 5 mmol/L [Fe（CN）6]3?/4?（含0.1 moL/L 的KCl）溶液中進。DPV 實驗在0.01 moL/L 的PBS（含0.02 moL/L的KCl，pH7.4）中進行。CV 和SWV 的掃描范圍為-0.2～0.6 V，掃描速率為100 mV/s。DPV 的初始電位為?0.2 V，終止電位為0.6 V，振幅為0.05 V，脈沖寬度為0.05 s。

1.2.5 樣品的處理 根據(jù)文獻[25?26]報道的方法對樣品進行前處理。首先將25 mL 的羊乳和10 mL以9000 r/min 離心10 min，去掉上層脂肪，以離心管中部的水相作為樣品，然后將2 mL 樣品與6 mL 甲醇混合，所得的混合物超聲處理30 mim 后，用0.01 moL/L PBS 稀釋100 倍，最后用0.22 μm 的一次性過濾器過濾，得到的溶液用加入不同濃度的AFM1，用于實際樣品的檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準差的形式表示，采用Origin 9.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 用不同材料還原石墨烯的試驗條件的篩選

采用原紅棗汁、發(fā)酵紅棗汁、原紅棗汁中多酚及發(fā)酵紅棗汁中多酚分別對氧化石墨烯進行還原，然后將所得的RGO 滴涂在金電極上，使用CV 法和SWV 法測量電極的峰電流值。在CV 圖中產(chǎn)生了一個氧化峰電位和一個還原峰電位，兩峰電位差越大，表明電流值越高，RGO 導(dǎo)電性越好。在SWV 圖中峰電流值絕對值越大，RGO 導(dǎo)電性越好。如圖2A和圖2B 所示，發(fā)酵紅棗汁中的多酚還原GO 獲得的RGO 導(dǎo)電性最差（曲線a，a'），其次是棗汁中的多酚（曲線b，b'），用發(fā)酵棗汁和原棗汁還原GO 所得的RGO 的導(dǎo)電性基本相同，（曲線c，d 和c'，d'）。因此，考慮到實驗的簡便性，在接下來的實驗中使用紅棗汁作還原劑還原GO。

圖2 不同材料還原對RGO 導(dǎo)電性的影響Fig.2 Effects of different materials reduction on RGO conductivity

2.2 還原氧化石墨烯（RGO）的表征

對于合成的GO 和RGO，采用掃描電鏡表征，從圖3A 可以看出，GO 由彼此緊密相關(guān)的單個薄片組成，具有絲質(zhì)和葉狀結(jié)構(gòu)。相比之下，RGO 顯示出比較平滑的結(jié)構(gòu)（圖3B），這可能是由于還原過程中棗汁中的多酚等還原性物質(zhì)破壞了GO 表面的官能團（如羧基、羥基、環(huán)氧基團等），從而使其變成比較平滑的結(jié)構(gòu)[27]。

用EDS 測定了GO 和RGO 的元素組成。如圖3C所示，合成的氧化石墨烯同時含有C 和O峰。Cl、S 和K 元素是由于合成氧化石墨烯的過程中所添加的試劑所致。在RGO（圖3D）中C 和O 的比例相比GO 明顯減小，這是在還原的過程中，破壞了氧化石墨烯表面的含氧官能團，這證實了使用紅棗汁成功地綠色合成了RGO。另外由于二氧化硅組成作為基底，Si 的百分比仍然存在。

圖3 掃描電鏡圖與EDS 元素分布圖Fig.3 Images of SEM and EDS

2.3 電化學(xué)適配體傳感器構(gòu)建過程的電化學(xué)表征

在傳感器構(gòu)建過程中，采用循環(huán)伏安法（CV）和方波伏安法（SWV）對電化學(xué)適體傳感器進行表征。在CV 中，電流值越高意味著阻抗越小，由圖4A 可知，裸GCE 呈現(xiàn)一個較低的峰電流（曲線a），說明GCE 不利于電子的轉(zhuǎn)移。當(dāng)在裸GCE 上修飾上一層RGO 后，峰電流進一步減弱（曲線b）。主要原因是RGO 層含有大量帶負電荷的COO?，它可以作為靜電屏障，阻礙電子的傳遞，該結(jié)果與Gound 等[28]報道的結(jié)果一致。當(dāng)在電極上修飾納米金后，由于AuNPs 具有良好的導(dǎo)電性，促進了電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致峰電流明顯增強（曲線c）。當(dāng)將適配體修飾在電極上，峰電流減弱（曲線d），其原因可能是來自適配體的磷酸骨架所帶的負電荷阻止了[Fe（CN）6]3?/4?離子到達電極表面，從而抑制了氧化還原反應(yīng)的電子傳遞過程。當(dāng)目標(biāo)物AFM1存在時，AFM1與適配體的特異性結(jié)合導(dǎo)致空間位阻變大，從而進一步抑制了電子的轉(zhuǎn)移過程。同時也采用SWV 法進行驗證，結(jié)果如圖4B 所示，由圖可知CV 法與SWV 法所得出的結(jié)果一致，進一步證明該傳感器構(gòu)建成功。

圖4 電化學(xué)適配體傳感器在5 mmoL/L [Fe（CN）6]3?/4?溶液中的CV 和SWV 表征圖Fig.4 CV and SWV characterization of electrochemical aptasensor in 5 mmoL/L [Fe(CN)6]3-/4- solution

2.4 不同條件對RGO 導(dǎo)電性的影響

植物的不同部位，如葉子、果皮、根等，會產(chǎn)生不同的生化物質(zhì)。這些物質(zhì)主要含有生物分子，包括蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、糖類、生物堿、果膠、醇類化合物、類黃酮和酶[29?30]。為了獲得最佳試驗性能，對不同比例的GO 和紅棗汁對制備的RGO 的導(dǎo)電能力進行了測量，結(jié)果如圖5A 所示（采用CV 法），當(dāng)GO 和紅棗汁的比例是2:1 時，所制備的石墨烯的導(dǎo)電能力最強。原因可能是棗汁的用量過少致使GO 還原不完全，棗汁用量過多則GO 易發(fā)生團聚，而且易在溶液中殘留。

不同pH 對所制備的RGO 的導(dǎo)電能力的影響如圖5B 所示（采用SWV 法），隨著pH 的增加，所制備的RGO 的導(dǎo)電性增強，主要原因是GO 表面的羥基會電離出氫離子，在堿性環(huán)境下氫氧根離子與氫離子作用，有利于GO 的分散。而且，在堿性環(huán)境下，紅棗中多酚中的結(jié)合態(tài)多酚會向游離態(tài)多酚轉(zhuǎn)變，使游離態(tài)的酚含量增加，提高了棗汁的還原能力。

圖5 不同條件下制備的RGO 的導(dǎo)電能力Fig.5 The conductivity of RGO prepared under different conditions

2.5 電化學(xué)適配體傳感器的檢測性能

在最佳條件下，將構(gòu)建好的傳感器浸入不同濃度的AFM1，記錄DPV 電化學(xué)信號。從圖6可以看出，隨著AFM1濃度的增大，DPV 電流明顯減弱。在AFM1濃度為1×10?7～5×10?4ng/mL 時，傳感器DPV曲線的峰電流值與AFM1濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，線性方程為I（μA）=15.222lgC?76.935，R2=0.999，檢測限為3.3×10?5pg/mL（LOD=3σ/n，σ 為空白溶液的標(biāo)準偏差，n 為線性方程的斜率）[31]（圖7）。與文獻中報道的其他方法相比較（表1），此方法具有較低的檢測限和較寬的檢測范圍，尤其相較與HPLC 法，此方法不僅樣品前處理簡單，而且檢測限和檢測范圍完全符合國家要求。

表1 本研究與報道的檢測AFB1 的方法的比較Table 1 Comparison of reported methods for the detection of AFB1

圖6 不同濃度的AFM1 所對應(yīng)的DPV 響應(yīng)曲線圖Fig.6 Differential pulse voltammograms corresponding to different concentrations of AFM1

圖7 DPV 峰電流值與不同濃度的AFM1 的校準曲線Fig.7 Calibration curves of DPV peak current and AFM1 with different concentrations

2.6 電化學(xué)適配體傳感器的特異性和穩(wěn)定性

電化學(xué)適配體傳感器的特異性是一個必須考慮的重要參數(shù)，為了測量傳感器的特異性，在相同條件下對其它幾種干擾物質(zhì)（AFB1，AFG1，OTA，F(xiàn)B1）進行了檢測，結(jié)果如圖8所示，除了AFM1其他幾種干擾物質(zhì)的峰電流較強且與空白的峰電流基本一致，這表明該適配體傳感器的特異性良好。

圖8 電化學(xué)適配體傳感器對不同干擾物的特異性評估Fig.8 Evaluation of the specificity of the aptasensor toward different interferences

另外，為了驗證傳感器的穩(wěn)定性，在相同條件下制備三根電極，將其在4 ℃條件儲存15 d，每3 d 測量其峰電流值。結(jié)果顯示該傳感器15 d 后的峰電流值為初始值的93.8%。表明該電化學(xué)適配體傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 在實際樣品中的加標(biāo)回收實驗

為驗證構(gòu)建的AFM1電化學(xué)適配體傳感器在實際樣品中的可行性，在最佳條件下，對羊乳樣品中進行了加標(biāo)回收實驗，結(jié)果如表2所示，回收率為85.8%～103%，RSD 為5.05%～7.87%。由此可以判斷該方法具有良好的準確度，在實際樣品分析中具有潛在的應(yīng)用價值。

表2 羊乳樣品中AFM1 的檢測回收率（n=3）Table 2 Recovery of AFM1 detection in goat milk (n=3)

3 討論與結(jié)論

常規(guī)的氧化石墨烯還原用肼、硼氫化鈉等作為還原劑，都屬于化學(xué)還原。紅棗中的多酚、多糖均具有還原作用，在還原氧化石墨烯方面，兩者效果相同，為節(jié)省資源和時間，選用原棗汁進行還原，具有“綠色還原”的優(yōu)勢。同時，還原氧化石墨烯作為一種典型的二維碳納米材料，比表面積大，熱穩(wěn)定性好，將其滴涂在電極表面，可以使更多的AuNPs 沉積在電極表面。AuNPs 具有大的比表面積，良好的導(dǎo)電性，較好的生物相容性，其不僅可以促進電子轉(zhuǎn)移，還為適配體的固定提供一個完美的平臺。其次，AFM1和適配體的特異性識別能力確保了該傳感器具有良好的選擇性和穩(wěn)定性。同時，由于該傳感器的構(gòu)建步驟簡單，僅需三步，減少了實驗過程中的一些系統(tǒng)誤差。但是，該方法的局限性在于只能檢測到一種毒素。因此，在今后的工作中將考慮通過新的策略同時檢測多種毒素。

本研究成功構(gòu)建了一種用于AFM1檢測的電化學(xué)適配體傳感器。在最佳條件下，該傳感器對AFM1的檢測范圍為1×10?7～5×10?4ng/mL，檢測限為3.3×10?5pg/mL。同時在羊乳樣品中進行了加標(biāo)回收實驗，獲得了滿意的回收率?？傊?，該方法操作簡便，成本低廉、靈敏度高、特異性好，有望應(yīng)用于AFM1的定量檢測當(dāng)中，同時對食品工業(yè)中其它真菌毒素的檢測提供一個良好的借鑒。