白花蛇舌草對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞Tca83 的作用機(jī)制研究

戚路晗，杜英南，陳靖怡，崔臻，常懷廣，張蕾

舌癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的口腔癌之一，大部分惡性程度較高，浸潤(rùn)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快。因舌體的運(yùn)動(dòng)頻繁和血運(yùn)豐富，舌癌經(jīng)常在早期就發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且轉(zhuǎn)移率比較高，亦可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。對(duì)于舌癌的臨床治療，目前國(guó)內(nèi)和國(guó)外學(xué)者普遍認(rèn)為，以手術(shù)為主，輔以放化療的綜合治療是降低患者死亡率，減少術(shù)后復(fù)發(fā)，提高人生存率的最有效途徑。

為了減少化療副作用，中草藥越來(lái)越多的應(yīng)用于腫瘤術(shù)后。白花蛇舌草是茜草科的草本植物，是目前國(guó)內(nèi)研究較多的抗癌中草藥，從白花蛇舌草中已經(jīng)提取分離出環(huán)蒽醌類(lèi)、烯醚萜類(lèi)、多糖類(lèi)和黃酮類(lèi)等數(shù)十種化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎以及增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能作用[2]。有研究報(bào)道白花蛇舌草能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]。因此，在胃癌、肝癌、直腸癌及子宮頸癌等治療中被廣泛應(yīng)用。目前，白花蛇舌草對(duì)于口腔鱗癌，尤其是舌鱗癌的研究很少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、凋亡率及抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)來(lái)研究白花蛇舌草提取物能否促進(jìn)人口腔舌鱗癌細(xì)胞Tca83 的凋亡，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株及藥品 人舌鱗癌Tca83 細(xì)胞株購(gòu)于北京大學(xué)口腔醫(yī)院科研中心。白花蛇舌草購(gòu)于同仁堂大藥房，制備方法：取白花蛇舌草干品100 g，研磨成粉末狀，用1 000 ml 水浸泡1 h，加熱沸騰2 h，過(guò)濾后離心2 次，取上清液濃縮至100 ml，過(guò)濾除菌后獲1.0 g/ml 白花蛇舌草提取液[4]。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）、PI、RNA 酶等購(gòu)于生工生物工程公司；臺(tái)盼藍(lán)、Bcl-2 免疫組化試劑盒和DEPC等購(gòu)于新正好生物工程有限公司。羅氏Cedex HiRes高清圖像細(xì)胞分析系統(tǒng)：艾力特生命科學(xué)有限公司；流式細(xì)胞儀：貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)科研型。

1.3 Tca83 細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 取匯集成片、良好狀態(tài)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca83 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶（0.5%）和EDTA（0.2%）混合消化，形成細(xì)胞懸液。以1×105/ml 的濃度接種在培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5%CO2的培育箱中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)分為5組，對(duì)照組是等量標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，每天更換。實(shí)驗(yàn)組為白花蛇舌草提取液配制成100、300、600 和900g/ml 4 個(gè)濃度組。接種24h后，在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca83 細(xì)胞中開(kāi)始加藥，并且每隔24 小時(shí)換液以維持藥物濃度。每個(gè)濃度組的藥物分別作用Tca83 細(xì)胞24、48 和72h后，測(cè)定白花蛇舌草提取液對(duì)細(xì)胞作用的時(shí)效關(guān)系。

1.4 光學(xué)顯微鏡下觀察Tca83 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 用胰蛋白酶消化Tca83 細(xì)胞，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔濃度均為1×104/ml，在24 h 細(xì)胞完全貼壁后，分別加入各濃度藥物，在倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)間Tca83 細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況及形態(tài)變化。

1.5 免疫組化檢測(cè)Tca83 細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá) 按上述分組加入不同濃度藥物，分別于24、48、72 h 后制作細(xì)胞爬片，經(jīng)酶消化液37 ℃消化，經(jīng)山羊抗兔IgG、SABC 處理后，DAB 染色，空白對(duì)照組以PBS代替一抗。

1.6 MTT 法檢測(cè)Tca83 細(xì)胞存活率 將Tca83 細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，按照分組設(shè)計(jì)加4 種濃度的白花蛇舌草提取液，其中第一孔為空白對(duì)照，分別培養(yǎng)24、48、72 h；然后加入MTT 溶液，測(cè)定各孔吸光度值，重復(fù)3 次取平均值。細(xì)胞存活率計(jì)算方法：存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組平均OD）×100%。

1.7 FCM 檢測(cè)Tca83 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Tca83 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的提取液，作用24、48 和72h后收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 13.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tca83 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 光學(xué)顯微鏡下，正常的Tca83 細(xì)胞為多角形，伸展好，細(xì)胞質(zhì)呈均勻狀態(tài)，細(xì)胞核大，核仁清楚，透明度較好，見(jiàn)封三彩圖1。經(jīng)過(guò)白花蛇舌草提取液處理的Tca83 細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞皺縮，不能附壁，大部分漂浮在培養(yǎng)液中。隨著實(shí)驗(yàn)組藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的加大，能夠見(jiàn)細(xì)胞脫落，壞死細(xì)胞和細(xì)胞碎片漂浮在培養(yǎng)液中，見(jiàn)封三彩圖2。

2.2 Bcl-2 蛋白免疫組化表達(dá) 對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中均勻分布有深棕黃色和棕紅色的細(xì)顆粒，這是Bcl-2 表達(dá)，有此特征的為陽(yáng)性細(xì)胞。900g/ml 濃度組作用24 h 的細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)無(wú)染色，不見(jiàn)Bcl-2表達(dá)，為陰性結(jié)果。

2.3 細(xì)胞存活率 各濃度組分別作用細(xì)胞24、48 和72 h，結(jié)果顯示細(xì)胞存活率與白花蛇舌草提取物的濃度呈反比關(guān)系，且具有比較明顯的劑量依賴性；除去空白對(duì)照組，細(xì)胞存活率與提取物的作用時(shí)間呈反比關(guān)系，具有明顯時(shí)間依賴性，見(jiàn)封三彩圖3。

2.4 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

2.4.1 細(xì)胞凋亡率 相同藥物作用時(shí)間，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率也在增加。72 h 后，藥物濃度雖然增加到900g/ml，但細(xì)胞凋亡率不再增加。900g/ml組72 h 的細(xì)胞凋亡率與48 h 相比沒(méi)有增加，而其它實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加，顯示出明顯時(shí)間依賴性，見(jiàn)封三彩圖4。

2.4.2 細(xì)胞周期分布分析 低濃度提取液組在短時(shí)間內(nèi)主要將細(xì)胞抑制在G0/G1 期，而隨著藥物濃度和（或）作用時(shí)間的增加，抑制在G2/M 期的細(xì)胞增多，見(jiàn)表1。

表1 白花蛇舌草提取液作用后Tca83 細(xì)胞周期分布情況 %

3 討論

舌癌是口腔常見(jiàn)惡性腫瘤之一，術(shù)后藥物治療可有效降低復(fù)發(fā)率和死亡率。傳統(tǒng)西藥化療副作用大，而中藥有多靶點(diǎn)效應(yīng)，毒副作用小，被廣泛應(yīng)用于臨床。白花蛇舌草作為一種應(yīng)用廣泛的抗癌中草藥，通過(guò)抑制腫瘤血管及淋巴管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)控腫瘤信號(hào)通路等方式作用于癌細(xì)胞[4]。孫超等[5]研究證實(shí)中藥白花蛇舌草有效成分為2-羥基-3-甲基蒽醌（HMA），其對(duì)人肝癌Hep G2 細(xì)胞有體外抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。汪增秀等[6]研究同樣證實(shí)白花蛇舌草能抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白花蛇舌草與半枝蓮聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及直腸癌等有顯著的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其仍是通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)側(cè)重研究白花蛇舌草對(duì)舌癌細(xì)胞的促凋亡和抑制增殖作用。

Bcl-2 家族蛋白在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Bcl-2 家族蛋白失調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡失衡，促進(jìn)腫瘤形成[8]。因此，抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要手段之一，Bcl-2蛋白與一系列凋亡調(diào)節(jié)因子互相作用，抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，白花蛇舌草作用后，Tca83 細(xì)胞的Bcl-2 表達(dá)水平下調(diào)，因此Bcl-2 抑制舌癌細(xì)胞凋亡的作用減弱。雖然本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)并沒(méi)有檢測(cè)白花蛇舌草與Bcl-2 作用的具體機(jī)制，但從Bcl-2 與白花蛇舌草濃度和作用時(shí)間的負(fù)相關(guān)性，間接證實(shí)白花蛇舌草能夠促進(jìn)舌癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期是細(xì)胞復(fù)制的過(guò)程，分為G1（DNA 合成前期）、S（DNA 合成期）、G2（DNA 合成后期）、M（分裂期）四個(gè)時(shí)期，細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖緊密相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白花蛇舌草將Tca83 細(xì)胞抑制在G0/G1 期或G2/M 期，從而抑制癌細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)低濃度藥物在短時(shí)間內(nèi)主要將細(xì)胞抑制在G0/G1 期；而高濃度和（或）作用時(shí)間的增加，主要將癌細(xì)胞抑制在G2/M 期。不過(guò)將癌細(xì)胞分別抑制在這兩個(gè)不同時(shí)期對(duì)臨床治療是否有實(shí)際意義，有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)白花蛇舌草作用的舌癌細(xì)胞存活率降低，并且隨著藥物濃度增加和/或藥物作用時(shí)間增加，舌癌細(xì)胞的存活率也在降低。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)藥物濃度和作用時(shí)間增加到一定程度，舌癌細(xì)胞的存活率不再降低，這提示白花蛇舌草對(duì)舌癌的作用有一定的劑量和時(shí)間臨界點(diǎn)，在臨床應(yīng)用時(shí)要找到合適的劑量和使用時(shí)間。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 戚路晗：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)；杜英南、陳靖怡、崔臻：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；常懷廣、張蕾：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持