UTMD 聯(lián)合抑制CREB基因促進動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的實驗研究

邱勤，徐萍，劉旭東

隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，各種心肌梗死和缺血性腦卒中等致死性疾病正在逐漸年輕化且發(fā)病率顯著上升[1]。動脈粥樣硬化（AS）易損斑塊的破裂與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在斑塊的形成和促進不穩(wěn)定性中起著重要的作用；因此，抑制上述因子是增加斑塊穩(wěn)定性的重要方法[3]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）是細胞內(nèi)第二信使的轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥因子、斑塊內(nèi)新生血管和MMP 的調(diào)節(jié)[4-7]，調(diào)節(jié)CREB的表達有望成為穩(wěn)定斑塊治療AS的新方法。超聲靶向微泡破壞技術(shù)（UTMD）是一種新型的基因轉(zhuǎn)染方法，具有安全、無創(chuàng)、靶向性和可重復(fù)使用性好等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于基因和藥物的靶向治療[8]。本研究將UTMD 與RNA 干擾技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建針對CREB 的shRNA，以超聲微泡為載體釋放shRNA后用超聲輻照兔頸動脈斑塊組織，觀察其是否能通過抑制頸動脈斑塊中白介素（IL）-17A、MMP-2、MMP-9 和VEGF的表達，達到減促進斑塊穩(wěn)定性的目的，報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 健康雄性新西蘭兔（4～5月齡）20 只購自寧波大學(xué)動物實驗中心，體質(zhì)量2.0 ～2.5 kg。完全隨機分為空白組（n=5），模型組（n=5），對照組（單純CREB 質(zhì)粒組，n=5）和治療組（UTMD 聯(lián)合CREB 質(zhì)粒組，n=5）。用液氮損傷右側(cè)頸總動脈（RCCA）后，采用含10%膽固醇的高膽固醇血癥飲食喂養(yǎng)10 周建立AS 模型，食物攝入量限制在100 g/d。本研究中的新西蘭兔于寧波大學(xué)實驗動物研究中心飼養(yǎng)，動物實驗按照寧波大學(xué)《動物實驗規(guī)定》進行。研究結(jié)束后，通過耳緣靜脈（150 mg/kg）注射戊巴比妥鈉對實驗動物實施安樂死。本研究經(jīng)寧波大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過（申請編號：12698）。

1.2 超聲儀器及方法 彩色多普勒超聲診斷儀選用西門子Accuson S2000 超聲診斷儀，探頭頻率為6 ～18 MHz，用于斑塊的二維測量；麥瑞Resona7S 超聲診斷儀，探頭頻率為5 ～14 MHz，用于斑塊的彈性成像和造影；融海低功率聚焦超聲實驗裝置用于超聲輻照。分別在第0、56 和70 天對仰臥位兔子的右側(cè)頸總動脈進行了B-型超聲、實時剪切波彈性成像（SWE）和超聲造影檢查，評估斑塊的形狀、大小、回聲、硬度、微血管密度和頸總動脈內(nèi)膜-中層厚度（CIMT）。同時治療組給予超聲輻照（輸出頻率650 kHz、輸出能量2.5 W/cm2、輻照時間3 min）。

1.3 超聲微泡和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 GV102 質(zhì)粒（6.4 kb）購自吉凱基因（中國上海），將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞（吉凱基因，中國上海），并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒（中國北京天根）說明書提取純化。通過分光光度法（1 mg/ml）測量所得質(zhì)粒DNA 的濃度，并在260 nm處測量質(zhì)粒DNA的吸光度。OD260/OD280 在1.8 ～2.0 之間表明質(zhì)粒DNA 中沒有污染，然后將產(chǎn)物保存于-20 ℃。聲諾維購自Bracco Imaging（意大利米蘭）。用0.9%氯化鈉注射液制備聲諾維微泡懸浮液，然后倒置或振動使微泡以（2 ～5）×108/ml 的密度和5 mg/ml 的濃度均勻分布。實驗前，將5 ml 聲諾維與1 ml 質(zhì)粒DNA 溶液（含1 mg質(zhì)粒）混合，在4 ℃下保存15 min 后，通過耳靜脈將混合物注射入AS 模型兔，然后對AS 模型兔右側(cè)頸動脈斑塊處進行3 min的超聲脈沖輻照（2.5 W/cm2）。

1.4 血脂測定 新西蘭兔禁食24 h后，通過耳緣靜脈抽取血液樣本后放入普通干燥試管中。采用自動生化分析儀分別測定第0 和56 天的血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.5 血清超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和IL-17A測定分別于第56 和70 天抽取3 ml 新西蘭兔空腹靜脈血，放入普通干燥試管中，立即行乳膠增強免疫比濁測定，測量血清hs-CRP 和IL-17A 水平。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析 獲得組織提取物并在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA 封閉后，將膜與適當(dāng)稀釋的特異性一抗[抗CREB 抗體，抗VEGF，抗MMP-9，抗MMP-2 和GAPDH（購自上海愛必信）]在4 ℃下共孵育過夜。然后，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（博斯特，中國武漢）一起孵育后，使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析使用Trizol 試劑從新西蘭兔右側(cè)頸總動脈中提取總RNA，使用分光光度法測量總RNA 量，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RNA 定量是通過qRT-PCR 進行的，引物如下：-actin（正義鏈：5’-ATCAGCAAGCAGGAGTAT-3’，反義鏈：5’-CAATCTCGTCTCGTTTCTG-3’），兔CREB（正義鏈：5’-TCAGCTCCTCAATCAGCGTCT-3’，反義鏈：5’-AGTTGTTATGGCTTCCTCCCC-3’），兔MMP-9（正義鏈：5’-CCACCACAACATCACGTACTGGA-3’，反義鏈：5’-ACTGGATGACAATGTCTGCGTCC-3’），兔MMP-2（正義鏈：5’-CTTCGTGTAGGTGTAAATGGG- 3’，反義鏈：5’-TTCCTGGGCAACAAGTATGAG-3’）和兔VEGF（正義鏈：5’-GGTGACGTTGAACTCCTCGGT-3’，反義鏈：5’-GGAGACAATAAACCCCACGAA-3’）。qRT-PCR 數(shù)據(jù)的分析通過比較2- CT方法進行。

1.8 組織學(xué)和免疫組織化學(xué) 切除新西蘭兔右側(cè)頸總動脈的組織塊，在4%多聚甲醛中固定48 h，嵌入石蠟中，切片用蘇木精/伊紅（HE）染色。使用的一抗為抗CREB 抗體、抗MMP-9、抗MMP-2 和抗-VEGFR 抗體，按1∶500 稀釋。二抗為辣根過氧化物酶-山羊抗-兔IgG。二氨基聯(lián)苯胺用于產(chǎn)生信號。切片用蘇木精輕輕復(fù)染。

1.9 統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)通過Graphpad Prism 6.0軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較用獨立樣本t 檢驗和Menn-Whitney 檢驗，多組比較用單因素方差分析和Kruskal-Wallis檢驗，多重比較用LSD-t 和Dunnet t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立AS動物模型 喂養(yǎng)10 周后，模型組體質(zhì)量高于空白組（t=12.34，P ＜0.05），見圖1a。模型組TC、HDL-C 和LDL-C 顯著增加，特別是血清TC 和LDL-C 濃度與空白組相比分別上調(diào)了15 和12 倍，見圖1b。模型組RCCA 中可觀擦到斑塊回聲形成（圖1c），同時，與空白組相比，模型組的頸動脈內(nèi)中膜厚度（CMIT）顯著增加（t=10.19，P ＜0.05），見圖1d，證明AS 動物模型建立成功。

2.2 4組新西蘭兔CREB mRNA 水平比較 4組CREB mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.15，P＜0.05）。其中治療組CREB mRNA 水平和表達顯著低于模型組和對照組（t=4.88、7.50，均P ＜0.05）；模型組和對照組的CREB mRNA 水平和表達均較高，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見圖2。

圖2 qRT-PCR 和Western blot 評估轉(zhuǎn)染效率

2.3 4組新西蘭兔hs-CRP、IL-17A 水平比較 4組hs-CRP、IL-17A 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=107.30、73.81，均P ＜0.05）。其中模型組hs-CRP 和IL-17A水平高于其他組（t≥13.51，均P ＜0.05）；治療組hs-CRP 和IL-17A 水平低于對照組（t=2.50、7.18，均P ＜0.05），見圖3。

圖3 4組血清hs-CRP 和IL-17A 水平比較

2.4 4組新西蘭兔VEGF、超聲造影峰值強度和楊氏模量值水平比較 4組VEGF mRNA 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=213.61，P ＜0.05），其中模型組VEGF mRNA 水平高于其他組（t≥13.10，均P ＜0.05）；治療組VEGF mRNA 水平低于對照組（t=28.50，P ＜0.05），見圖4a、b。治療組斑塊組織的楊氏模量值明顯高于其他兩組（t=7.96、4.60，均P＜0.05），見圖4c、d；而治療組斑塊的超聲造影峰值強度低于模型組和對照組（t=8.54、5.54，均P ＜0.05），見圖4e、f。治療組VEGF 表達陽性細胞數(shù)明顯低于模型組和對照組，見圖4g。

2.5 4組新西蘭兔MMP-2、MMP-9 水平比較 4組MMP-2 和MMP-9 的mRNA 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=93.78、41.66，均P ＜0.05），其中模型組MMP-2 和MMP-9 的mRNA 水平高于其他組（t≥6.72，均P ＜0.05），治療組MMP-2 和MMP-9的mRNA 水平低于對照組（t=4.95、4.59，均P ＜0.05），見圖5a ～d。與模型組和對照組相比，定位于細胞質(zhì)中的MMP-2 和MMP-9 在治療組中的表達顯著降低，見圖5e、f。

3 討論

AS 不穩(wěn)定斑塊的形成與以下三個方面密切相關(guān)：（1）炎癥。炎癥是引起斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，斑塊破裂及糜爛幾乎與炎癥共存，在斑塊的不穩(wěn)定狀態(tài)時炎癥總是上調(diào)的[9-11]。（2）MMP。斑塊纖維帽的主要成分是細胞外基質(zhì)，MMP是降解細胞外基質(zhì)最重要的酶類；不穩(wěn)定斑塊的MMP 活性增加，纖維帽強度減弱，斑塊變得易破裂[12-14]。（3）新生血管?；罨木奘杉毎僧a(chǎn)生VEGF，導(dǎo)致內(nèi)膜新生血管的形成；新生血管主要分布在斑塊的肩部和基底部，成為炎性細胞和脂質(zhì)成分進入斑塊的通路；此外，新生血管發(fā)育不完善基底膜不完整，故易于破裂和出血，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定[15]。因此尋找能抑制以上三方面的靶點并進行干預(yù)來促進斑塊的穩(wěn)定性是本實驗的研究基礎(chǔ)。

CREB是細胞中第二信使的轉(zhuǎn)錄因子。Westbom等[16]發(fā)現(xiàn)CREB 可以上調(diào)炎癥因子，參與體內(nèi)的炎癥過程。有研究報道，CREB 可參與某些病理生理過程中MMP 的調(diào)節(jié)[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)CREB 與VEGF 的表達密切相關(guān)[4]。這提示CREB 可通過調(diào)控炎癥因子、MMP和VEGF的表達促進斑塊的不穩(wěn)定性。本研究通過建立新西蘭兔AS 斑塊模型并在此基礎(chǔ)上進行了CREB-shRNA 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CREB-shRNA 質(zhì)?？沙聊珹S 斑塊模型血清中炎癥因子hs-CRP 和IL-17A 表達；同時AS 斑塊中MMP-2、MMP-9 及VEGF 的表達也隨之下調(diào)；超聲彈性成像顯示斑塊的楊氏模量值上升，超聲造影顯示斑塊的造影峰值強度下降。這證實了CREB 對斑塊不穩(wěn)定性的促進作用，沉默CREB 可增加斑塊的穩(wěn)定性。

UTMD治療性超聲已顯示出其作為靶向破壞腫瘤脈管系統(tǒng)的巨大潛力。研究較多且具有潛力的策略是用治療劑加載微泡，在超聲治療區(qū)域內(nèi)靶向破壞微泡時能夠局部釋放有效載荷。該技術(shù)正在探索用于局部基因轉(zhuǎn)染、靶向藥物遞送和釋放、血腦屏障破壞和溶栓等方面。本研究微泡與CREB 質(zhì)粒結(jié)合作為靶向治療的是一種具有潛力且可行性高的新方法。

綜上所述，用UTMD 遞送和靶向CREB 質(zhì)粒釋放比單純的CREB 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以更有效地沉默CREB 基因，更能有效降低CREB、VEGF、MMP-2、MMP-9 和炎癥因子hs-CRP、IL-17A的表達，且擁有更高的楊氏模量值和更低的超聲造影峰值強度，達到穩(wěn)定斑塊的目的。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 邱勤：論文撰寫、統(tǒng)計學(xué)分析、數(shù)據(jù)整理；劉旭東：實驗操作、數(shù)據(jù)整理；徐萍：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持