QuEChERS-GC-MS/MS 法快速測(cè)定地黃中12 種多環(huán)芳烴

何成軍，王 穎，鐘慈平，付 苓，楊超林，余曉琴*，吳平谷

（1.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611731； 2.四川省藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611731； 3.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310051）

多環(huán)芳烴（PAHs） 是指分子中含有2 個(gè)或2 個(gè)以上苯環(huán)以稠環(huán)形式排列的碳?xì)浠衔?，主要來源于礦物燃料及其他有機(jī)物的不完全燃燒和對(duì)廢棄物的不妥當(dāng)處置，是最早發(fā)現(xiàn)的具有致癌、致畸、致突變的環(huán)境污染物之一［1-3］。按照結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)可以分為有2～3 個(gè)苯環(huán)的低分子量多環(huán)芳烴和有4～7 個(gè)苯環(huán)的高分子量多環(huán)芳烴2 類。隨著人類對(duì)化石產(chǎn)品開采和使用量的增加，大量的多環(huán)芳烴被排入環(huán)境中。多環(huán)芳烴污染問題也日益受到關(guān)注，已經(jīng)被世界許多國(guó)家列為有機(jī)污染物的研究重點(diǎn)［4］。目前多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法主要有液相色譜法（HPLC）［5-6］、氣相色譜法（GC）［7-8］、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （UPLC-MS/MS）［9-10］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）［11-13］等。

生地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是著名的“四大懷藥” 之一，至今已有千年的應(yīng)用歷史。將生地黃酒制后再干燥即得熟地黃。生地黃和熟地黃均具有滋陰補(bǔ)腎的功效，凡陰虛血虛腎虛者食之，頗有益處，被大量應(yīng)用于臨床［14-16］。關(guān)于多環(huán)芳烴污染的研究大多集中在環(huán)境和食品等方面。近年來，對(duì)于中藥中多環(huán)芳烴的污染也開始受到關(guān)注。但是目前關(guān)于地黃中多環(huán)芳烴檢測(cè)的研究很少，特別是能夠快速、準(zhǔn)確的同時(shí)測(cè)定藥材中多種多環(huán)芳烴的檢測(cè)技術(shù)更是鮮見報(bào)道。

QuEChERS 技術(shù)是一種適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中多種污染物分析的樣品制備和凈化技術(shù)，由于具有回收率高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、高通量以及低溶劑使用量等優(yōu)點(diǎn)，使得該方法自發(fā)布以來，獲得了美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)、歐盟等多個(gè)國(guó)際機(jī)構(gòu)認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于食品及藥品中各種污染物的分析研究［17］。

為研究地黃中多環(huán)芳烴的風(fēng)險(xiǎn)暴露情況，本文以地黃為基質(zhì)，采用QuEChERS 前處理，聯(lián)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS） 對(duì)地黃中12 種多環(huán)芳烴殘留量進(jìn)行了含量測(cè)定研究，以期為地黃的用藥安全風(fēng)險(xiǎn)提供一定的借鑒與參考。

1 材料

1.1 儀器 TQ 8050 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu公司）； DB-5 MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） （美國(guó)Agilent 公司）； Heraeus Multifuge X3R 高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)、Barnstead Gen Pure 超純水機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； XSE 105 分析天平 （瑞士Mettler Toledo 公司）； T25 Digital 渦旋振蕩儀（德國(guó)IKA 公司）；KQ-500DE 超聲儀（江蘇昆山超聲儀器公司）； N1 全自動(dòng)氮吹濃縮儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試劑與藥物 12 種多環(huán)芳烴（PAHs） 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（單個(gè)化合物質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，批號(hào)S059017），包括菲（Phe）、蒽（Ant）、熒蒽（Flua）、芘（Pyr）、苯并［a］ 蒽（BaA）、艸屈 （Chr）、苯并［b］ 熒蒽（BbF）、苯并［k］ 熒蒽（BkF）、苯并［a］ 芘（BaP）、茚并［1，2，3-c，d］ 芘（IcdP）、二苯并［a，h］ 蒽（DahA）、苯并［g，h，i］ 芘（BghiP）、苯并 ［a］ 芘-d12（BaP-d12）內(nèi)標(biāo)溶液（100 μg/mL，批號(hào)S043605），均購(gòu)于天津阿爾塔科技有限公司；N-丙基乙二胺（PSA） 吸附劑、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18粉末）、C18小柱、中性氧化鋁小柱（天津博納艾杰爾科技公司）； MIPs、Florisil 小柱（上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司）； HLB 小柱（美國(guó)Waters 公司）。二氯甲烷、丙酮、乙腈、正己烷均為色譜純（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； 水為超純水。

地黃（16 批生地黃、7 批熟地黃） 均購(gòu)自當(dāng)?shù)貙I(yè)藥材市場(chǎng)或飲片公司，經(jīng)四川省藥品檢驗(yàn)研究院黎躍成主任中藥師鑒定為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根或炮制品，具體見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS/MS 分析條件

2.1.1 色譜 DB-5MS 石英毛細(xì)管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 進(jìn)樣口溫度300 ℃； 程序升溫 （70 ℃保持2 min，以35 ℃/min 升至160 ℃，以10 ℃/min 升至260 ℃，以6 ℃/min 升至310 ℃，保持5 min）； 載氣高純氦氣； 體積流量1.5 mL/min； 進(jìn)樣量1 μL； 不分流進(jìn)樣。

2.1.2 質(zhì)譜 電子轟擊離子源（EI 源）； 電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃； 傳輸線溫度310 ℃； 溶劑延遲時(shí)間8 min； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式?？傠x子流圖見圖1，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

圖1 12 種多環(huán)芳烴總離子流圖

表2 12 種多環(huán)芳烴質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，置于25 mL 量瓶中，正己烷定容至刻度，搖勻，正己烷稀釋至400 ng/mL，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密吸取苯并［a］ 芘-d12對(duì)照品1 mL至25 mL 量瓶中，正己烷定容至刻度，搖勻，正己烷稀釋至400 ng/mL，即得。

2.2.3 供試品溶液

2.2.3.1 提取 取地黃適量，在-40 ℃下冷凍12 h 后迅速粉碎，精密稱取1 g 至50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，混勻后再準(zhǔn)確加入10 mL 正己烷，超聲提取10 min，渦旋振蕩提取10 min，8 000 r/min 離心5 min，收集上清液，殘?jiān)偌尤?0 mL 正己烷重復(fù)提取1 次，合并2次上清液，混勻，即得。

2.2.3.2 凈化 精密吸取“2.2.3.1” 項(xiàng)下提取液5 mL 至10 mL 離心管中，加入C18、PSA 粉末各100 mg，渦旋60 s后8 000 r/min 離心5 min，吸取所有上清液，40 ℃氮吹至近干，準(zhǔn)確加入正己烷1.0 mL，渦旋混勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析。另外，多環(huán)芳烴屬于環(huán)境污染物，故在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)隨樣品前處理過程制備全試劑空白溶液，以判斷實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否對(duì)檢測(cè)造成影響。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 提取方式選擇 以加入25 μg/kg 多環(huán)芳烴的地黃樣品為研究對(duì)象，分別考察了10 mL 二氯甲烷、正己烷、乙腈、丙酮提取2 次對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表二氯甲烷、正己烷、乙腈、丙酮提取效率依次降低。但二氯甲烷提取溶液中色素等雜質(zhì)較多，容易對(duì)儀器造成污染并影響檢測(cè)結(jié)果； 乙腈、丙酮的極性相對(duì)較大，不利于多環(huán)芳烴的溶出，綜合對(duì)比了提取溶液顏色、對(duì)目標(biāo)物的提取效率，本實(shí)驗(yàn)選擇正己烷。另外，還考察了美國(guó)環(huán)境保護(hù)署推薦的PAHs 提取方法——超聲提取對(duì)樣品中多環(huán)芳烴提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲提取能夠加快多環(huán)芳烴的溶出，提高了提取效率，最終確定提取方式為10 mL 正己烷超聲提取2 次。

2.3.2 凈化方式選擇 本實(shí)驗(yàn)以5 mL 離心后的25 μg/kg加標(biāo)樣品提取液為對(duì)象，考察了中性氧化鋁小柱、HLB 小柱、C18小柱、高分子印跡多環(huán)芳烴專用萃取柱（MIPs）、Florisil 小柱、QuEChERS 粉末的凈化效果，結(jié)果見圖2。由此可知，C18小柱、中性氧化鋁小柱對(duì)多環(huán)芳烴類化合物基本沒有保留能力； HLB 小柱、MIPs 小柱、Florisil 小柱、QuEChERS 粉末凈化均具有較高的回收率，但HLB、MIPs小柱對(duì)樣品溶液中色素的凈化效果不理想，溶液顏色仍較深，不利于儀器進(jìn)樣分析，而Florisil 小柱、QuEChERS 粉末回收率均較高，尤其是除去色素能力強(qiáng)，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。考慮到前處理操作方便性和實(shí)驗(yàn)成本，最終確定凈化方式為QuEChERS 粉末。

圖2 不同凈化方式對(duì)多環(huán)芳烴凈化效果的影響

2.3.3 QuEChERS 粉末填料量?jī)?yōu)化 目前，常用的QuEChERS 凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑 （C18）、石墨化碳黑 （GCB）、無水硫酸鎂等［18］，其中GCB 表面具有正六元環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)平面分子有極強(qiáng)的親和力，能有效除去樣品溶液中的色素和甾醇類干擾物，但由于多環(huán)芳烴結(jié)構(gòu)中含有平面芳香環(huán)，會(huì)被GCB 不同程度的吸附，導(dǎo)致各目標(biāo)化合物的加樣回收率較低； PSA能夠吸附樣品溶液中的糖類、脂肪酸、有機(jī)酸、脂類以及某些色素等； C18的主要作用是除去長(zhǎng)鏈脂類化合物、甾醇及其他非極性雜質(zhì)等； 無水硫酸鎂能吸附樣品溶液中多余的水分。由于地黃含水量較小，本實(shí)驗(yàn)比較了不同用量PSA、C18粉末對(duì)樣品溶液的凈化效果，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)色素均有明顯的凈化效果，隨著其用量增加溶液顏色逐漸變淺，但進(jìn)一步增加后會(huì)引入菲的二次污染，考慮到進(jìn)化和二次污染之間的平衡，最終確定QuEChERS 凈化劑為PSA、C18粉末各100 mg。另外，對(duì)于含水量較大的藥材，可以考慮加入硫酸鎂來驗(yàn)證其除水、凈化效果。

2.3.4 線性關(guān)系考察及精密度、加樣回收率試驗(yàn) 考慮到基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物準(zhǔn)確定量的影響，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配系列校正曲線，內(nèi)標(biāo)法定量?？瞻讟悠钒础?.2.3” 項(xiàng)下方法處理，得到空白供試品，加入25 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和適量多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次稀釋至1、2、4、8、16、32 ng/mL，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以多環(huán)芳烴質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并以信噪比為3 時(shí)的濃度為檢測(cè)限，為10 時(shí)的濃度為定量限，結(jié)果見表3，可知各多環(huán)芳烴在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各多環(huán)芳烴線性關(guān)系及精密度、加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.3.5 加樣回收率、精密度試驗(yàn) 在空白樣品中加入不同體積的對(duì)照品溶液，分別得到低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)水平6 份，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取16 批生地黃（DH01～DH16）、7批熟地黃（DH17 ～DH23），按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。由此可知，所有批次樣品中均檢出多環(huán)芳烴，含量范圍32.7～3 628.9 μg/kg； 10 批樣品（2 批熟地黃、8 批生地黃） 檢出全部多環(huán)芳烴，占總數(shù)的43.5%，最高達(dá)3 628.9 μg/kg （DH04）； 菲、苯并 ［a］ 蒽、艸屈及苯并［b］ 熒蒽在所有批次樣品中的檢出率為100%，最高達(dá)1 119.5 μg/kg，值得引起重視； 苯并［a］ 芘在多環(huán)芳烴中毒性最大，也是備受關(guān)注的典型代表［19］，該成分在所有批次樣品中的檢出率為61.5%，含量為12.8～85.2 μg/kg。

表4 各多環(huán)芳烴含量測(cè)定結(jié)果（μg/kg）

3 討論

目前，對(duì)中藥外源性污染物的關(guān)注重點(diǎn)主要集中在重金屬［20-21］、二氧化硫殘留［22］、真菌毒素污染［23-25］和農(nóng)藥殘留［26-28］等方面。雖然現(xiàn)在關(guān)于中藥材中多環(huán)芳烴的報(bào)道較少，但是從上述結(jié)果和部分報(bào)道［12-13，29-30］中可以看出，部分中藥材中多環(huán)芳烴污染的情況值得引起重視。尤其是這類化合物又具有典型的致癌、致畸、致突變的特性，這可能會(huì)成為影響中藥材用藥安全性的另一風(fēng)險(xiǎn)問題。

中藥材中多環(huán)芳烴的污染可能來源于多種因素、多個(gè)環(huán)節(jié)，產(chǎn)業(yè)鏈中的相關(guān)環(huán)節(jié)都應(yīng)該樹立防止多環(huán)芳烴污染的意識(shí)。在種植環(huán)節(jié)，植物可能會(huì)吸收土壤和環(huán)境中的PAHs，并在生長(zhǎng)過程中富集，種植基地可以選擇建立在遠(yuǎn)離污染的地方。藥材在干燥、加工和運(yùn)輸?shù)倪^程中也應(yīng)該注重環(huán)境衛(wèi)生，盡量避免藥材被廢氣或廢煙污染。藥材在烘烤、高溫炮制等過程中，脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物可能會(huì)發(fā)生熱裂解反應(yīng)，再經(jīng)過環(huán)化和聚合反應(yīng)形成PAHs，應(yīng)該通過科學(xué)合理的方法優(yōu)化炮制工藝。同時(shí)，相關(guān)部門應(yīng)該引起重視，加大對(duì)這方面的投入，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法找出這類化合物的污染途徑或代謝途徑。

目前我國(guó)尚無相關(guān)法律和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定中藥材中多環(huán)芳烴的殘留限量，相關(guān)監(jiān)管部門應(yīng)該關(guān)注此類物質(zhì)在中藥材中的污染情況，在科學(xué)的方法指導(dǎo)下制定合理的防范措施，以保證中藥的安全用藥。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)提取試劑、提取方式和凈化方式進(jìn)行選擇和優(yōu)化，建立了能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定地黃中12 種多環(huán)芳烴的方法。采用正己烷超聲提取2 次，使用QuEChERS（含PSA、C18各100 mg） 粉末凈化，氮吹濃縮后，結(jié)合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。與文獻(xiàn)［12-13，29-30］ 中采用固相萃取、皂化后液液萃取等前處理方法相比，本方法具有前處理操作簡(jiǎn)單、對(duì)色素凈化效果好、成本低廉、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適合在短時(shí)間內(nèi)完成大批量的樣品分析，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室中大批量檢測(cè)的需要?？梢钥紤]在此方法的基礎(chǔ)上，開展其他藥材樣品的普查，掌握基礎(chǔ)本底數(shù)據(jù)，明確污染程度，為進(jìn)一步制定相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)質(zhì)性的數(shù)據(jù)支撐。