三七脂肝丸對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠脂肪酸代謝的影響

郭 真，王伊雯，戚 莉，劉 佳，杜 曾，邱劍楠，王曉檸

（上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海 201203）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是目前全球最常見的慢性肝病，普通成人NAFLD患病率約為6.3% ～45%［1］。NAFLD 是一種代謝應(yīng)激性肝損傷，目前尚無特效治療藥物［2］。三七脂肝丸是目前臨床用于治療NAFLD，且具有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的中成藥之一［3］，但其作用機(jī)制尚不清晰。本實(shí)驗(yàn)使用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 大鼠模型，觀察三七脂肝丸對(duì)模型大鼠的藥效，并從肝臟脂肪酸攝入、脂肪酸從頭合成以及腸道緊密連接角度，探索三七脂肝丸治療NAFLD 的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠48 只，體質(zhì)量180 ～200 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬） 2017-0005］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫23 ～24 ℃，相對(duì)濕度 （60±10）%，晝夜節(jié)律控制，自由飲水。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過 （倫理號(hào)PZSHUTCM200703012）。

1.2 試劑與藥物 高脂飼料（批號(hào)20200806，南通特洛菲飼料科技有限公司）。三七脂肝丸 （國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025353，批號(hào)20181105，云南玉藥生物制藥有限公司）； 奧貝膽酸（批號(hào)20200707，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。血清肝功能生化試劑盒（南京建成生物工程研究所）； 脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（cluster of differentiation 36，CD36）、硬脂酰輔酶A 去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD-1）抗體（貨號(hào)ab252922、ab19862，英國(guó)Abcam 公司）； 脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶A 羥化酶（acetyl-coA carboxylase，ACC1） 抗體 （貨號(hào)3180、4190，美國(guó)CST 公司）； 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c （sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c） 抗體（貨號(hào)sc13551，美國(guó)Santa Cruz 公司）； 閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、咬合蛋白 （Occludin） 抗體（貨號(hào)61-7300、33-1500，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； β-肌動(dòng)蛋白 （β-actin） 抗體 （貨號(hào)66009-1，美國(guó)Proteintech 公司）； 辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒 （貨號(hào)A0208、A0216、P0012S、P0012AC，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 TBA-40FR 全自動(dòng)生化儀（日本東芝公司）；Tissuelyser-24 全自動(dòng)快速樣品研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）； Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；Fresco17 低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；MTC-100 恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）； Tanon-3500 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）； RO lab/RO DI 實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 將48 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、奧貝膽酸組和三七脂肝丸低、中、高劑量組，每組8 只。除正常組外，其余各組使用高脂飼料喂養(yǎng)12 周誘導(dǎo)NAFLD 大鼠模型［4-5］。第9 周起，正常組和模型組大鼠灌胃給予10 mL/kg 去離子水； 三七脂肝丸低、中、高劑量組分別灌胃給予0.77、1.54、3.08 g/kg（臨床等效劑量的0.5、1、2 倍） 三七脂肝丸混懸液； 奧貝膽酸組灌胃給予0.514 mg/kg 奧貝膽酸，以每天10 mL/kg容量灌胃。

2.2 取材 12 周后處死所有大鼠，采集全血和肝、回腸組織。全血4 ℃靜置3 h，1 000 ×g離心15 min，分裝血清。采集肝臟，稱重，留取肝、回腸組織標(biāo)本。肝臟取相同部位組織浸入中性福爾馬林溶液中固定。肝、回腸組織分裝在凍存管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 組織病理學(xué)檢測(cè) 肝組織經(jīng)脫水、包埋、切片后，分別行HE、油紅O 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。通過Image Pro plus 6.0 軟件分析油紅O 陽性染色面積比值。

2.4 血清、肝組織生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇 （total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇 （high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、游離脂肪酸 （free fatty acid，F(xiàn)FA） 水平； 試劑盒法檢測(cè)肝組織TG、FFA 水平。

2.5 Western blot 法檢測(cè)肝組織脂肪合成、代謝相關(guān)蛋白以及回腸緊密連接蛋白表達(dá) 將40 ～50 mg 肝、回腸組織裂解后取上清，BCA 法蛋白定量后，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體，顯影成像。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，符合正態(tài)分布及方差齊性者，組間比較采用單因素方差分析； 方差不齊者，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 模型復(fù)制過程中，正常組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，毛色光澤，飲食、二便正常，精神狀態(tài)良好；模型組大鼠體質(zhì)量快速增加，毛色光澤油亮，精神狀態(tài)良好。造模及給藥結(jié)束后，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)均升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量降低（P＜0.05，P＜0.01），三七脂肝丸中、高劑量組肝指數(shù)降低（P＜0.05），見表1。

表1 三七脂肝丸對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)的影響（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別體質(zhì)量/g肝質(zhì)量/g肝指數(shù)/%正常組415.80±32.779.79±0.872.35±0.06模型組474.90±21.52△△11.98±0.89△△2.53±0.25△三七脂肝丸低劑量組423.30±23.23**10.72±0.83*2.54±0.23三七脂肝丸中劑量組413.80±36.36**9.66±0.72**2.34±0.13*三七脂肝丸高劑量組414.30±27.73**9.81±0.64**2.37±0.08*奧貝膽酸組440.40±34.45*10.67±0.45*2.43±0.12

3.2 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠血清肝功能的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 活性升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠血清ALT、AST 活性降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠血清肝功能的影響（IU/L，±s，n＝8）

表2 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠血清肝功能的影響（IU/L，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別ALTAST正常組14.71±3.0085.11±12.65模型組20.82±3.67△115.80±6.08△△三七脂肝丸低劑量組15.23±3.37*87.33±12.37*三七脂肝丸中劑量組11.56±6.95*84.00±19.43**三七脂肝丸高劑量組13.89±2.23**83.20±6.54**奧貝膽酸組15.44±5.94*75.00±17.02**

3.3 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠血清脂質(zhì)水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-c、FFA 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠血清FFA 水平降低（P＜0.05），三七脂肝丸中、高劑量組和奧貝膽酸組大鼠血清TC、TG 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），三七脂肝丸高劑量組大鼠血清LDL-c 水平降低（P＜0.01），奧貝膽酸組大鼠血清HDL-c 水平升高 （P＜0.01）； 與奧貝膽酸組比較，三七脂肝丸高劑量組血清LDL-c 水平降低（P＜0.01），見表3。

表3 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠血清脂質(zhì)水平的影響（mmol/L，±s，n＝8）

表3 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠血清脂質(zhì)水平的影響（mmol/L，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與奧貝膽酸組比較，＃＃P＜0.01。

組別TCTGHDL-cLDL-cFFA正常組1.60±0.081.43±0.341.10±0.070.22±0.030.36±0.08模型組1.81±0.15△2.54±0.36△△0.77±0.050△△0.35±0.030△△0.46±0.05△三七脂肝丸低劑量組1.60±0.312.05±0.640.82±0.160.35±0.060.32±0.12*三七脂肝丸中劑量組1.48±0.24*1.80±0.50*0.85±0.120.32±0.050.33±0.04*三七脂肝丸高劑量組1.45±0.14*1.73±0.62*0.88±0.160.28±0.03**＃＃0.32±0.07*奧貝膽酸組1.48±0.24*1.49±0.15**0.95±0.08**0.34±0.020.30±0.05*

3.4 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織FFA、TG 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織FFA、TG 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織FFA、TG 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），奧貝膽酸組大鼠肝組織TG 水平降低（P＜0.01）； 與奧貝膽酸組比較，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織FFA 水平降低（P＜0.05），見表4。

表4 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織FFA、TG 水平的影響（mmol/g，±s，n＝8）

表4 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織FFA、TG 水平的影響（mmol/g，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△△P ＜0.01； 與模型組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01； 與奧貝膽酸組比較，＃P＜0.05。

組別FFATG正常組0.20±0.081.02±0.31模型組0.42±0.04△△1.79±0.61△△三七脂肝丸低劑量組0.40±0.071.75±0.38三七脂肝丸中劑量組0.26±0.07**＃0.97±0.51**三七脂肝丸高劑量組0.29±0.02**＃1.15±0.43*奧貝膽酸組0.36±0.030.97±0.51**

3.5 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織病理學(xué)的影響 HE染色顯示，正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； 與正常組比較，模型組大鼠肝臟可見大小泡混合性肝細(xì)胞脂肪變性，伴有小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其肝細(xì)胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變以及NAS 積分升高（P＜0.01），符合NAFLD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2，6］； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠肝臟脂肪變性及細(xì)胞浸潤(rùn)情況均有所改善，其中三七脂肝丸高劑量組和奧貝膽酸組肝細(xì)胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變以及NAS 積分降低（P＜0.05，P＜0.01），三七脂肝丸中劑量組肝細(xì)胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥以及NAS 積分降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1、表5。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色（×400）

表5 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織NAS 病理評(píng)分及油紅O 陽染面積比的影響（±s，n＝8）

表5 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織NAS 病理評(píng)分及油紅O 陽染面積比的影響（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別脂肪變/分小葉內(nèi)炎癥/分氣球樣變/分NAS 積分/分油紅O 陽染面積比/%正常組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.006.76±0.11模型組2.25±0.50△△1.75±0.50△△1.50±0.58△△5.50±1.00△△44.12±1.41△△三七脂肝丸低劑量組1.75±0.501.25±0.501.25±0.504.25±0.5031.22±1.33三七脂肝丸中劑量組0.50±0.58**0.75±0.50*0.75±0.502.00±0.81**21.76±1.09**三七脂肝丸高劑量組0.50±0.58**0.25±0.50**0.25±0.50*1.00±0.81**10.88±1.65**奧貝膽酸組0.75±0.50**0.75±0.50*0.25±0.50*1.75±0.50**15.86±0.69**

油紅O 染色顯示，正常組大鼠肝組織未見紅色脂肪滴；與正常組比較，模型組大鼠肝組織可見脂肪浸潤(rùn)，油紅O陽染面積比升高（P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組肝組織脂肪浸潤(rùn)減輕，其中三七脂肝丸中、高劑量組和奧貝膽酸組油紅O 陽染面積比降低（P＜0.01），見圖2、見表5。

圖2 各組大鼠肝組織油紅O 染色（×200）

3.6 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36、SCD-1 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），SCD-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與模型組比較，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），SCD-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），三七脂肝丸低劑量組大鼠肝組織SREBP-1c、CD36 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），奧貝膽酸組大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與奧貝膽酸組比較，三七脂肝丸中劑量組肝組織FAS 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），三七脂肝丸中、高劑量組肝組織SCD-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

圖3 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36、SCD-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

3.7 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠回腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠回腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸高劑量組和奧貝膽酸組回腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 三七脂肝丸對(duì)NAFLD 大鼠回腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

4 討論

肝臟是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的重要器官，負(fù)責(zé)脂肪酸攝入、脂肪酸從頭合成（de novo lipogenesis，DNL）、脂肪酸氧化和脂質(zhì)輸出。當(dāng)脂肪酸的攝入、合成超過氧化和輸出時(shí)，肝細(xì)胞TG 過度蓄積是NAFLD 的主要病理特征。中醫(yī)認(rèn)為，NAFLD 的病機(jī)是肝失疏泄、脾失健運(yùn)［3］，根據(jù)臨床表現(xiàn)，治法上多以健脾化痰、清熱利濕、疏肝理氣為主［4-5］。三七脂肪丸的主要成分包括三七、莪術(shù)、云山楂、澤瀉、菊花等，具有健脾化濁、祛痰軟堅(jiān)的功效，可治療肝郁脾虛型脂肪肝。臨床表明，三七脂肝丸能夠降低NAFLD 患者血脂水平，改善肝功能［6-7］。本實(shí)驗(yàn)觀察到模型大鼠肝組織脂肪浸潤(rùn)，血清ALT、AST 活性及TC、TG、LDL-c、FFA 水平升高，肝組織TG、FFA 水平升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8-9］。三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織TG、FFA 水平降低，脂肪浸潤(rùn)減輕，提示三七脂肝丸能夠改善NAFLD 大鼠脂質(zhì)代謝狀態(tài)。

肝臟脂肪酸主要來源于CD36 攝取的肝外游離脂肪酸和肝臟DNL［10］。肝臟DNL 失調(diào)是NAFLD 形成的中心事件［11］。DNL 過程中脂肪酸生成的關(guān)鍵酶ACC 和FAS，均由SREBP-1c 轉(zhuǎn)錄調(diào)控［12］。SREBP-1c 表達(dá)增加能夠上調(diào)ACC和FAS 表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸合成。ACC 催化乙酰輔酶A 生成丙二酰輔酶A，不僅為長(zhǎng)鏈脂肪酸合成提供底物，還可變構(gòu)抑制線粒體膜上的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，降低線粒體的脂肪酸β 氧化。SCD-1 是催化飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限速酶，其催化產(chǎn)物單不飽和脂肪酸是甘油三酯生成的重要底物［13］。SCD-1 的去飽和作用將具有促炎作用的飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為低脂毒性的單不飽和脂肪酸； 其表達(dá)減少或活性過低會(huì)導(dǎo)致高脂毒性的飽和脂肪酸積累，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織CD36、SREBP-1c、ACC1 和FAS 表達(dá)降低，SCD-1表達(dá)升高，提示三七脂肝丸能夠減少肝細(xì)胞的脂肪酸攝入，抑制DNL，促進(jìn)高脂毒性的飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化，減輕炎癥反應(yīng)。

除肝臟DNL 失調(diào)外，腸道黏膜屏障破壞也被認(rèn)為是NAFLD 發(fā)生發(fā)展的重要因素［12］。腸道黏膜機(jī)械屏障破壞、通透性增加，腸內(nèi)細(xì)菌及微生物移位，脂多糖等外源性毒素進(jìn)入門靜脈，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，是NAFLD 發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)［15］。腸道黏膜機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接組成。腸緊密連接在調(diào)節(jié)腸道黏膜通透性方面具有重要作用，由閉合蛋白Claudin、Occludin 和連接黏附分子3 種膜蛋白以及ZO-1、ZO-2 和ZO-3 等外周漿蛋白組成。ZO-1 蛋白與緊密連接的功能變化密切相關(guān)，被作為評(píng)價(jià)緊密連接通透性的指標(biāo)［16］。而缺乏Occludin 則不能形成典型的緊密連接結(jié)構(gòu)［17-18］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 患者小腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 表達(dá)降低［19］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，NAFLD 大鼠小腸組織ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)降低，腸道黏膜機(jī)械屏障受損，通透性增加［20-21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠小腸ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)均較正常組降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。三七脂肝丸高劑量組大鼠小腸ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)較模型組升高，提示高劑量三七脂肝丸能夠改善NAFLD 腸道黏膜機(jī)械屏障功能。

綜上所述，三七脂肝丸能夠改善NAFLD 大鼠血清肝功能、脂質(zhì)水平、肝細(xì)胞脂肪變及腸道黏膜機(jī)械屏障損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸攝入、脂肪酸從頭合成，降低脂肪酸脂毒性的相關(guān)蛋白以及腸緊密連接蛋白表達(dá)密切相關(guān)。