基于HPLC-QAMS/GC 法聯(lián)合多元統(tǒng)計(jì)分析及加權(quán)TOPSIS 法評(píng)價(jià)廣藿香質(zhì)量

吳學(xué)輝，程心玲，潘艷琳，張曉斌，肖 欽*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350004； 2.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350001）

廣藿香為唇形科植物廣藿香Pogostemoncablin（Blanco） Benth.的干燥地上部分，用于濕濁中阻、脘痞嘔吐、暑濕表證、濕溫初起、發(fā)熱倦怠、胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛的治療［1］，主要含有甾體類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、苯丙素類(lèi)等成分［2-3］，臨床使用廣泛。廣藿香為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑藿砂顆粒的君藥之一，現(xiàn)收載于2020 年版《中國(guó)藥典》 一部，該標(biāo)準(zhǔn)使用GC 法對(duì)百秋李醇進(jìn)行含量測(cè)定，檢索廣藿香定量控制相關(guān)文獻(xiàn)大多為HPLC 法測(cè)定，未對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行有效評(píng)價(jià)。本研究采集廣東、海南、廣西、福建4 個(gè)省、自治區(qū)18 個(gè)產(chǎn)地的廣藿香藥材，采用HPLC-QAMS/GC 法［4-6］對(duì)廣藿香中新西蘭牡荊苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷、異毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黃酮醇、雷杜辛黃酮醇、廣藿香酮、百秋李醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合主成分分析（PCA）［7-8］、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）［8-9］和加權(quán)TOPSIS 法［10-11］，篩選出引起不同批廣藿香成分差異的主要標(biāo)志性成分，同時(shí)對(duì)不同產(chǎn)地廣藿香綜合質(zhì)量進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，以期為廣藿香整體質(zhì)量控制提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 新西蘭牡荊苷 （批號(hào)14022804，純度99.1%）、異毛蕊花糖苷 （批號(hào)15031204，純度96.1%）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批號(hào)PRF7090824，純度97.3%）、廣藿香酮（批號(hào)PRF8072523，純度99.0%） 對(duì)照品購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司； 毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，純度95.2%）、百秋李醇（批號(hào)110772-201909，純度100.0%） 對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院； 紫葳新苷Ⅱ （批號(hào)CFS202101，純度98.0%）、藿香黃酮醇 （批號(hào)CFS202101，純度 98.5%）、列當(dāng)苷 （ 批號(hào)CFS202003，純度98.0%）、雷杜辛黃酮醇（批號(hào)CFS202101，純度98.5%） 對(duì)照品購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司； 鼠李素（批號(hào)AF21080308，純度98.0%） 對(duì)照品購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司。乙腈、磷酸為色譜純； 水為純凈水。

廣藿香按2020 年版《中國(guó)藥典》 一部“廣藿香” 項(xiàng)下要求葉片篩凈，莖洗凈潤(rùn)透，切段曬干，按莖葉比80 ∶20 混勻，備用，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院肖欽主任藥師鑒定為正品。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 儀器 LC-10AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）； Agilent 7820A 型氣相色譜儀、Agilent TC C18色譜柱、Agilent HP-5 毛細(xì)管柱（美國(guó)Agilent公司）； Primaide 1210 型高效液相色譜儀（日本日立公司）； Phenomenex Gemini C18色譜柱 （美國(guó)Phenomenex 公司）； Waters ODS C18色譜柱（美國(guó)Waters 公司）； XS105 型電子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； FQ-1024 型超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-QAMS 多組分定量方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取新西蘭牡荊苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷、異毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黃酮醇、雷杜辛黃酮醇、廣藿香酮對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用75%甲醇制成每1 mL 分別含對(duì)照品0.834、0.052、2.310、0.616、0.754、0.076、0.102、0.310、0.248、0.972 mg 的貯備液。精密吸取貯備液適量，75%甲醇稀釋20 倍制得質(zhì)量濃度分別為41.70、2.60、115.50、30.80、37.70、3.80、5.10、15.50、12.40、48.60 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取廣藿香粉末（過(guò)3 號(hào)篩） 約1.0 g，精密稱(chēng)定，置25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入75% 甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理45 min，冷卻，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，即得。

2.1.3 色譜條件 參考文獻(xiàn) ［12-14］ 報(bào)道，Phenomenex Gemini C18色譜柱； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～7 min，12.0%A；7 ～20 min，12.0% ～29.0% A； 20 ～38 min，29.0% ～65.0%A； 38～45 min，65.0% ～12.0%A）；體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)309 nm； 進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1，供試品溶液中各成分與相鄰色譜峰分離分離度均大于1.5。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，用75% 甲醇稀釋4、10、20、40、100、200 倍，得6 份不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新西蘭牡荊苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷、異毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黃酮醇、雷杜辛黃酮醇、廣藿香酮峰面積RSD 分別為1.06%、1.53%、0.59%、1.18%、1.03%、1.41%、1.28%、1.14%、1.23%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新西蘭牡荊苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷、異毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黃酮醇、雷杜辛黃酮醇、廣藿香酮峰面積RSD 分別為1.33%、1.88%、0.94%、1.35%、1.46%、1.78%、1.61%、1.43%、1.59%、1.17%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取廣藿香粉末6 份（S1），按 “2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新西蘭牡荊苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列當(dāng)苷、異毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黃酮醇、雷杜辛黃酮醇、廣藿香酮含量RSD分別為1.09%、1.48%、0.57%、1.22%、1.06%、1.43%、1.25%、1.17%、1.22%、0.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各成分含量已知的廣藿香粉末9 份（S1），每份0.5 g，隨機(jī)平均分為3 組，按80%、100%、120%的水平加入對(duì)照品溶液（新西蘭牡荊苷0.211 mg/mL、紫葳新苷Ⅱ0.015 mg/mL、毛蕊花糖苷0.807 mg/mL、列當(dāng)苷0.176、異毛蕊花糖苷0.215 mg/mL、鼠李素0.019 mg/mL、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.031 mg/mL、藿香黃酮醇0.087 mg/mL、雷杜辛黃酮醇0.069 mg/mL、廣藿香酮0.335 mg/mL），按 “2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率分別為98.70%、97.83%、100.20%、98.81%、100.12%、98.23%、98.05%、96.85%、98.39%、98.44%，RSD 分別為1.64%、0.99%、0.87%、0.67%、1.24%、1.33%、1.50%、0.75%、1.49%、1.10%。

2.1.9 相對(duì)校正因子 （f） 計(jì)算 精密吸取“2.1.4” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以毛蕊花糖苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他9種成分相對(duì)校正因子，公式為fk/s＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積。計(jì)算得毛蕊花糖苷與新西蘭牡荊苷、紫葳新苷Ⅱ、列當(dāng)苷、異毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黃酮醇、雷杜辛黃酮醇和廣藿香酮的平均相對(duì)校正因子分別為0.785 8、4.738 9、0.620 5、0.529 0、2.453 9、1.783 4、0.937 5、1.427 1、0.572 9，RSD 分別為1.86%、1.53%、1.10%、0.78%、1.05%、1.30%、1.93%、1.67%、1.06%。

2.1.10 耐用性考察 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別考察色譜儀（LC-10AT、Primaide 1210）、色譜柱 （Phenomenex Gemini C18、Waters ODS C18、Agilent TC C18）、體積流量 （0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃） 等條件對(duì)f的影響。結(jié)果，不同儀器及色譜柱條件下毛蕊花糖苷與其他9 種成分的平均相對(duì)校正因子分別為0.784 2、4.736 5、0.624 3、0.524 8、2.455 6、1.785 2、0.936 0、1.427 0、0.572 5，不同體積流量條件下平均相對(duì)校正因子分別為0.785 0、4.738 9、0.623 8、0.526 1、2.458 1、1.785 0、0.937 5、1.427 7、0.572 2，不同柱溫條件下平均相對(duì)校正因子分別為0.790 3、4.739 1、0.622 1、0.525 6、2.461 9、1.786 5、0.934 8、1.429 5、0.568 6，RSD 值均小于2.0%，表明不同儀器及色譜柱、體積流量、柱溫對(duì)所建立的f無(wú)顯著性影響，耐用性良好。

2.1.11 色譜峰定位 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察色譜儀（LC-10AT、Primaide 1210）、色譜柱（Phenomenex Gemini C18、Waters ODS C18、Agilent TC C18） 對(duì)相對(duì)保留時(shí)間值（t） 的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。可知各成分相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于2.0%，相對(duì)保留時(shí)間值法可用于廣藿香中各成分色譜峰定位。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.2 百秋李醇GC 定量檢測(cè)方法 取廣藿香粉末（過(guò)3 號(hào)篩） 約3.0 g，精密稱(chēng)定，按2020 年版《中國(guó)藥典》 一部［1］“廣藿香” 項(xiàng)下方法對(duì)百秋李醇進(jìn)行定量檢測(cè)。

2.3 多組分含量測(cè)定 取18 批廣藿香 （S1 ～S18），按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備廣藿香供試品溶液，平行3 份，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)SPSS 26.0 軟件正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，廣藿香中各成分2 種方法含量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布（P＞0.05） 和方差齊（P＞0.05），t檢驗(yàn)結(jié)果顯示2 種方法結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明HPLC-QAMS 法準(zhǔn)確可靠； 百秋李醇GC 法穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of content determination for various constituents （n＝3）

2.4 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 PCA 以18 批廣藿香中10 種成分HPLCQAMS 法測(cè)定結(jié)果以及百秋李醇GC 法測(cè)定結(jié)果為變量，采用SPSS 26.0 軟件PCA 分析對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維。結(jié)果第1、2 個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為62.880%、24.098%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.978%，表明前2 個(gè)主成分可以代表廣藿香中11種成分86.98%的信息量，故確定采用前2 個(gè)主成分作為分析對(duì)象。由廣藿香主成分矩陣結(jié)果可知，第1 主成分信息主要由新西蘭牡荊苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、雷杜辛黃酮醇、廣藿香酮、百秋李醇組成，第2 主成分信息主要由列當(dāng)苷、異毛蕊花糖苷、藿香黃酮醇組成。進(jìn)一步應(yīng)用SIMCA 14.1 軟件對(duì)18 批廣藿香樣品構(gòu)建PCA 模型（圖2），提取出2 個(gè)主成分R2X為0.870，表明建立的模型穩(wěn)定性較高，不同產(chǎn)地廣藿香樣品呈現(xiàn)一定的聚集性，S1～S8 位于得分圖中上部，S9 ～S12 位于得分圖左下角，S13～S18 位于得分圖右側(cè)。

圖2 PCA 得分圖Fig.2 Score plot for PCA

2.4.2 OPLS-DA 以18 批廣藿香中10 種成分HPLC-QAMS 法測(cè)定結(jié)果以及百秋李醇GC 法測(cè)定結(jié)果為變量，采用SIMCA 14.1 軟件OPLS-DA 分析，挖掘影響廣藿香產(chǎn)品質(zhì)量差異的主要潛在標(biāo)志物，得OPLS-DA 模型。結(jié)果顯示模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測(cè)能力好，累積解釋能力參數(shù)R2X 為0.950、R2Y 為0.858，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.744，均大于0.5； 不同產(chǎn)地18 批廣藿香樣品分類(lèi)聚集結(jié)果與PCA 結(jié)果相吻合。對(duì)構(gòu)建的OPLS-DA 模型中2 個(gè)主成分進(jìn)行200 次置換檢驗(yàn)（圖3）。結(jié)果模型可靠，且未過(guò)度擬合，預(yù)測(cè)能力好。采用OPLS-DA模型中變量重要性投影（VIP） 值篩選影響廣藿香化學(xué)成分差異的標(biāo)志性成分（圖4），VIP 值越大，表明該成分對(duì)區(qū)分不同產(chǎn)地廣藿香整體質(zhì)量的貢獻(xiàn)度越大。結(jié)果VIP ＞1.0 的指標(biāo)成分分別為成分3（毛蕊花糖苷，2.014 0）、成分11 （百秋李醇，1.548 0）、成分10 （廣藿香酮，1.277 0） 和成分4 （列當(dāng)苷，1.009 0），表明上述成分對(duì)不同產(chǎn)地廣藿香樣品的分類(lèi)聚集影響顯著，可能是影響廣藿香產(chǎn)品質(zhì)量差異的主要潛在標(biāo)志物。

圖3 OPLS-DA 分析置換檢測(cè)結(jié)果圖Fig.3 Permutation test results graph for OPLS-DA

圖4 OPLS-DA 分析VIP 值圖Fig.4 VIP value graph for OPLS-DA

2.5 加權(quán)TOPSIS 分析

2.5.1 原始數(shù)據(jù)歸一化 以18 批廣藿香中11 種成分含量結(jié)果為變量，建立數(shù)據(jù)矩陣Xnm（n＝1，2，3，……，18；m＝1，2，3，……，11），采用越大越優(yōu)型指標(biāo)計(jì)算公式對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，式中max （Xm） 和min（Xm） 分別指第m個(gè)指標(biāo)18 批樣品含量的最大值和最小值，得歸一化后數(shù)據(jù)矩陣Ynm。

2.5.2 加權(quán)決策矩陣 以O(shè)PLS-DA 分析中影響廣藿香化學(xué)成分差異的VIP 值為11 個(gè)指標(biāo)權(quán)重（Wm），按加權(quán)決策計(jì)算公式Znm＝Y(jié)nm×Wm對(duì)歸一化后數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行加權(quán)處理，得加權(quán)決策矩陣Znm，最優(yōu)方案矩陣，最劣方案矩陣均為0。

2.5.3 相對(duì)貼近度計(jì)算及樣品優(yōu)劣評(píng)價(jià) 按歐氏距離計(jì)算公式和分別計(jì)算18 批廣藿香樣品與最優(yōu)方案的歐氏距離以及與最劣方案的歐氏距離，再根據(jù)相對(duì)貼近度計(jì)算公式計(jì)算18 批廣藿香樣品的相對(duì)貼近度Dn，Dn值越大，被評(píng)價(jià)的廣藿香樣品質(zhì)量最優(yōu)，反之則最差。按照Dn值大小對(duì)18 批廣藿香樣品質(zhì)量?jī)?yōu)劣進(jìn)行排序，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示排名前6 位依次為廣東石牌、棠下、高要、陽(yáng)春、遂溪、徐聞，廣西和海南居中，福建位于排名后四位。

表5 加權(quán)TOPSIS 模型綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.5 Results of comprehensive evaluation using weighted TOPSIS model

3 討論

本研究對(duì)提取溶劑 （50% 甲醇［13］、75% 甲醇［14］、100% 甲醇［15-16］、乙醇［17-19］）、提取方式（超聲和加熱回流） 和提取時(shí)間 （30、45、60 min） 進(jìn)行了對(duì)比考察，最終確定采用75%甲醇超聲提取45 min 對(duì)廣藿香供試品溶液進(jìn)行制備。在篩選流動(dòng)相時(shí)，首先對(duì)甲醇-水、乙腈-水進(jìn)行了考察，結(jié)果乙腈-水相對(duì)穩(wěn)定，但個(gè)別色譜峰出現(xiàn)拖尾變形，同時(shí)檢驗(yàn)用時(shí)較長(zhǎng)，考慮加入0.1%磷酸［14-15］、0.1% 冰醋酸和0.1% 甲酸［13］加以改善，最終確定采用乙腈-0.1% 磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫。

本研究采用HPLC-QAMS 法對(duì)廣藿香中新西蘭牡荊苷等10 種成分含量進(jìn)行了同步檢測(cè)，方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，較普通多組分檢測(cè)方法，大大降低了檢驗(yàn)成本，有效避免了部分對(duì)照品不穩(wěn)定等因素影響，有效推動(dòng)了方法的普及應(yīng)用。百秋李醇揮發(fā)性較強(qiáng)，HPLC 法難以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確度，參考廣藿香現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用GC 法對(duì)百秋李醇進(jìn)行含量檢測(cè)。廣藿香中11 種成分含量檢測(cè)結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地廣藿香質(zhì)量差異較大。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示毛蕊花糖苷、百秋李醇、廣藿香酮和列當(dāng)苷可能是影響廣藿香產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物。加權(quán)TOPSIS 法結(jié)果顯示廣東產(chǎn)廣藿香質(zhì)量最優(yōu)，位于排名前6 位，其次為廣西和海南產(chǎn)廣藿香，福建產(chǎn)廣藿香位于排名后4 位，所建立的方法能夠有效地區(qū)分不同產(chǎn)地廣藿香產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

綜上所述，本研究建立的HPLC-QAMS/GC 多組分定量聯(lián)合多元統(tǒng)計(jì)分析及加權(quán)TOPSIS 方法，操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，客觀(guān)全面，為廣藿香資源的合理開(kāi)發(fā)和利用、優(yōu)質(zhì)種源的篩選和栽培以及道地性研究提供參考和借鑒。