萹蓄HPLC-ECD 指紋圖譜建立與抗氧化活性評(píng)價(jià)

李 影，吳其妹，李志榮，邵起菊，陳榮祥*，周亞平*

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563000； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000）

萹蓄PolygonumaviculareL.為蓼科植物，其味苦、微寒，具有利尿，殺蟲(chóng)等功效［1］，主要含有黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、苯丙素類(lèi)等化學(xué)成分［2］，具有抗氧化、抑菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理活性［3-5］，能有效清除DPPH 自由基、抑制細(xì)胞衰老等，對(duì)小鼠皮膚的抗皺亦有顯著作用［6-8］。

目前，萹蓄已被2020 年版 《中國(guó)藥典》 收載，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣以楊梅苷含量（≥0.03%） 進(jìn)行評(píng)價(jià)。中藥成分復(fù)雜，僅靠單一或幾種成分的測(cè)定難以反映其質(zhì)量水平［9-11］。中藥譜效關(guān)系是以中藥指紋圖譜為基礎(chǔ)，通過(guò)與藥效結(jié)合闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，能較全面的評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量［12］。在建立HPLC指紋圖譜的常用檢測(cè)方法中，電化學(xué)檢測(cè)法（ECD） 具有特異性篩選藥材中酚酸、黃酮等抗氧化活性成分的特點(diǎn)［13-15］，將其與HPLC 結(jié)合，可用以繪制中藥“抗氧化指紋圖譜”。中藥指紋圖譜結(jié)合譜效關(guān)系可進(jìn)一步明確各化合物的貢獻(xiàn)，灰色關(guān)聯(lián)分析（GRA） 與偏最小二乘回歸分析（PLSR）是較常見(jiàn)的分析方法［16］。GRA 可系統(tǒng)分析藥效指標(biāo)與指紋圖譜共有峰的關(guān)聯(lián)度，PLSR 可反映色譜峰與藥效的正負(fù)關(guān)系及密切程度［17-18］。

因此，本研究采用HPLC-ECD 法篩查萹蓄抗氧化活性成分并建立指紋圖譜，利用GRA 和PLSR分析探究萹蓄化學(xué)成分與抗氧化活性的關(guān)系，以期為萹蓄的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Ultimate 3000 bio-RS 型高效液相色譜儀、1510 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）； FE 28 型PH 計(jì)、ME104E/02 型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； Purelab Chorus 2 型純水超純水系統(tǒng)（英國(guó)Elga 公司）。

1.2 藥物與試劑 沒(méi)食子酸（批號(hào)H1817069，純度≥98%）、原兒茶酸（批號(hào)K1717091，純度≥97%）、香草酸（批號(hào)B1914116，純度98%）、咖啡酸（批號(hào)H1505037，純度98%）、綠原酸（批號(hào) J1523050，純度 98%）、楊梅苷 （ 批號(hào)D1522033，純度98%） 對(duì)照品均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司； 原兒茶醛對(duì)照品（批號(hào)KSBEB12，純度98%） 購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司； 葒草苷對(duì)照品（批號(hào)M2490010，純度99.45%） 購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司； 新綠原酸（批號(hào)19042305，純度≥98%）、原花青素B2 （批號(hào)21032902，純度 98.17%）、洋薊素 （ 批號(hào)21062408，純度 99.47%）、異葒草苷 （ 批號(hào)20052201，純度 99.67%）、牡荊素 （ 批號(hào)21022209，純度 98.36%）、萹蓄苷 （ 批號(hào)20070702，純度 99.76%）、槲皮苷 （ 批號(hào)21032404，純度98.63%） 對(duì)照品均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司； 兒茶素對(duì)照品（批號(hào)2NJZKHM，純度＞97%） 購(gòu)自梯希愛(ài)（上海） 化成工業(yè)發(fā)展有限公司； 表兒茶素對(duì)照品（批號(hào)C19PA491108，純度≥97%） 購(gòu)自北京謹(jǐn)明生物科技有限公司； 對(duì)香豆酸對(duì)照品（批號(hào)P03468，純度≥98%） 購(gòu)自上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司； 甲醇、乙腈為色譜純，2，2＇-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS，批號(hào)E2018132，分析純）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號(hào)D915107，分析純），均購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司。

萹蓄采于2021 年5 月至6 月，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)孟令杰博士鑒定為正品，具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 將17 批樣品在45 ℃下烘干后粉碎，過(guò)60 目篩，精密稱(chēng)取粉末1 g，加入30 mL 80% 甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，40 kHz 超聲提取30 min，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，9 000 r/min 離心4 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、綠原酸、楊梅苷、原兒茶醛、葒草苷、新綠原酸、原花青素B2、洋薊素、異葒草苷、牡荊素、萹蓄苷、槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、對(duì)香豆酸對(duì)照品適量，甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的貯備液，在-20 ℃下保存?zhèn)溆?，使用前?0% 甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度，即得。

2.3 色譜條件 XBridge BEH shield RP18 色譜柱（3.0 mm×150 mm，2.5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -9.6 mg/mL 檸檬酸溶液（pH 2.74，B），梯度洗脫（0～15 min，2.5% ～7%A； 15 ～20 min，7% ～14%A； 20～40 min，14% ～25%A； 40 ～48 min，25% ～80%A； 50 ～55 min，80% ～2.5%A）； 體積流量0.6 mL/min； 柱溫45 ℃； 樣品盤(pán)溫度8 ℃； 檢測(cè)電壓650 mV； 進(jìn)樣量2 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.1” 項(xiàng)下同一份供試品溶液（S9），在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，以楊梅苷（19 號(hào)峰） 為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.4%，相對(duì)峰面積RSD 均小于2.1%，表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1” 項(xiàng)下同一份供試品溶液（S9），室溫下于0、4、8、12、16、24 h在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以楊梅苷（19號(hào)峰） 為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.5%，相對(duì)峰面積RSD 均小于4.2%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一份萹蓄粉末（S9），按“2.1” 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以楊梅苷（19 號(hào)峰） 為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.7%，相對(duì)峰面積RSD 均小于3.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 HPLC-ECD 指紋圖譜建立

2.5.1 圖譜生成 取17 批樣品，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版） 軟件，由中位數(shù)法得到指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜，共確認(rèn)26 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1～2。萹蓄指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度結(jié)果見(jiàn)表2，可知均≥0.944，表明各批樣品成分相似，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

圖1 17 批樣品HPLC-ECD 指紋圖譜Fig.1 HPLC-ECD fingerprints for seventeen batches of samples

圖2 萹蓄對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint for P.aviculare

表2 17 批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2 Similarity evaluation results of seventeen batches of samples

2.5.2 共有峰指認(rèn) 共指認(rèn)出18 個(gè)共有峰，分別為1 號(hào)峰（沒(méi)食子酸）、2 號(hào)峰（原兒茶酸）、3 號(hào)峰（原兒茶醛）、4 號(hào)峰（新綠原酸）、5 號(hào)峰（香草酸）、6 號(hào)峰（兒茶素）、7 號(hào)峰（咖啡酸）、8號(hào)峰（綠原酸）、10 號(hào)峰（表兒茶素）、11 號(hào)峰（原花青素B2）、12 號(hào)峰（對(duì)香豆酸）、14 號(hào)峰（洋薊素）、15 號(hào)峰（葒草苷）、16 號(hào)峰（異葒草苷）、17 號(hào)峰（牡荊素）、19 號(hào)峰（楊梅苷）、20號(hào)峰（萹蓄苷）、21 號(hào)峰（槲皮苷），色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照品HPLC-ECD 色譜圖Fig.3 HPLC-ECD chromatogram of reference substances

2.6 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 為研究產(chǎn)地間差異，將17 批樣品按照產(chǎn)地分為4 組，并將26 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入SIMCA-14.1 軟件進(jìn)行PLS-DA 分析，測(cè)得R2X值為1，R2Y值為0.995，Q2值為0.727，三者均大于0.5，表明該模型的擬合和預(yù)測(cè)能力較好，見(jiàn)圖4。由此可知，不同地區(qū)各批樣品之間較靠近，而不同省份之間的差異較大。

圖4 17 批樣品PLS-DA 得分圖Fig.4 PLS-DA score plot for seventeen batches of samples

2.7 總酚含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道，取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液400 μL （用80%甲醇稀釋40 倍），與400 μL 福林酚溶液（23.5 mg/mL） 混合后反應(yīng)3 min，加入800 μL 15% Na2CO3溶液，反應(yīng)混合物于暗處保持30 min 后，在760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，不同批樣品中總酚含量較高，在10.1～20.0 mg/g 范圍內(nèi)。

表3 總酚含量及抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of total phenol content and antioxidant activity determination

2.8 抗氧化活性研究

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 參考文獻(xiàn)［20］報(bào)道，取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液70 μL （用80%甲醇稀釋90 倍），與30 μL 80% 甲醇混勻后加入200 μL DPPH，作為樣品組，以80% 甲醇為空白組，暗處反應(yīng)10 min 后在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），樣品組、空白組的吸光度分別以As、Ao表示，重復(fù)3 次，計(jì)算清除率，公式為清除率＝［（Ao-As） /Ao］ ×100%。

2.8.2 ABTS 自由基清除能力 參考文獻(xiàn)［21］報(bào)道，ABTS 試劑由K2S2O8（0.67 mg/mL） 與ABTS （3.75 mg/mL） 等體積混合并于室溫暗反應(yīng)12 h，稀釋至吸光度為0.8±0.02。取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液100 μL （用80%甲醇稀釋40 倍），與200 μL ABTS 混勻，作為樣品組，再以80%甲醇為空白組，室溫下保持30 min 后，在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），樣品組、空白組吸光度分別以As、Ao表示。重復(fù)3 次，計(jì)算清除率。

2.8.3 鐵離子還原能力 參考文獻(xiàn)［22］ 報(bào)道，將體積比為1 ∶1 ∶10 的FeCl3水溶液（5 g/L）、TPTZ （3 mg/mL，用1.46 mg/mL 鹽酸配制）、醋酸鈉緩沖液 （pH 3.6，40 mg/mL） 混合，作為T(mén)PTZ 工作液。取 “2.1” 項(xiàng)下供試品溶液 （用80%甲醇稀釋75 倍），與300 μL TPTZ 工作液混合，室溫靜置10 min 后在593 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，在相同條件下測(cè)定不同濃度奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox） 吸收值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，F(xiàn)RAP 結(jié)果以Trolox 當(dāng)量表示。

2.8.4 結(jié)果分析 表3 顯示，不同批樣品抗氧化活性差異較大，DPPH 自由基清除率在38.2% ～77.9%范圍內(nèi)，ABTS 自由基清除率在26.7% ～99.8%范圍內(nèi)，F(xiàn)RAP 值在25.0 ～53.0 mg/g 范圍內(nèi)。再將總峰面積同總酚含量、DPPH 自由基清除活性、ABTS 自由基清除活性及FRAP 進(jìn)行相關(guān)性分析，可知總峰面積與總酚及抗氧化活性間的相關(guān)系數(shù)≥0.855，見(jiàn)表4。

表4 總峰面積、總酚含量、抗氧化活性的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between total peak areas，total phenol contents and antioxidant activities

2.9 譜效關(guān)系研究

2.9.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 以抗氧化活性指標(biāo)為參考序列，共有峰峰面積為比較序列進(jìn)行分析，r為各參考序列與比較序列之間的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)的均值（即關(guān)聯(lián)度），其數(shù)值越大，則對(duì)抗氧化的貢獻(xiàn)越大［23］，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，26 個(gè)共有峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，關(guān)聯(lián)度較高；除4 號(hào)峰（新綠原酸） 外，其余25 個(gè)共有峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與FRAP 的關(guān)聯(lián)度均大于0.8。綜上所述，對(duì)抗氧化能力貢獻(xiàn)較大的共有峰為10 號(hào)峰（表兒茶素）、3 號(hào)峰（原兒茶醛）、12 號(hào)峰（對(duì)香豆酸）、9 號(hào)峰、11 號(hào)峰（原花青素B2）、16 號(hào)峰（異葒草苷）、24 號(hào)峰、6 號(hào)峰（兒茶素）、14 號(hào)峰（洋薊素）、15 號(hào)峰（葒草苷）、25 號(hào)峰、1 號(hào)峰（沒(méi)食子酸）、19 號(hào)峰（楊梅苷）、2 號(hào)峰（原兒茶酸）、23 號(hào)峰、21 號(hào)峰（槲皮苷）、20 號(hào)峰（萹蓄苷）。

表5 灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果Tab.5 Results of grey relational analysis

2.9.2 偏最小二乘回歸分析（PLSR） 以FRAP值、DPPH 自由基清除活性、ABTS 自由基清除活性為因變量，共有峰峰面積為自變量，將量化數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-14.1 軟件進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)為正，則表共有峰與抗氧化活性呈正相關(guān)，反之為負(fù)相關(guān)； 變量重要性投影（VIP） 值＞1 時(shí)，共有峰對(duì)抗氧化活性有顯著貢獻(xiàn)［24］，結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知，3 號(hào)峰（原兒茶醛）、6 號(hào)峰（兒茶素）、10 號(hào)峰（表兒茶素）、11 號(hào)峰（原花青素B2）、12 號(hào)峰（對(duì)香豆酸）、14 號(hào)峰（洋薊素）、16 號(hào)峰（異葒草苷）、19 號(hào)峰（楊梅苷）、20 號(hào)峰（萹蓄苷）、21 號(hào)峰（槲皮苷）、9 號(hào)峰、13 號(hào)峰、23號(hào)峰、24 號(hào)峰、25 號(hào)峰的VIP 值均大于1，而且均為正值，表明它們與抗氧化活性呈高度正相關(guān)，并與灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果基本一致。

圖5 PLSR 標(biāo)準(zhǔn)化回歸分析Fig.5 Standardization regression analysis of PLSR

3 討論

萹蓄中的主要抗氧化成分為酚酸、黃酮類(lèi)化合物，較低pH 的流動(dòng)相有利于這些化合物的分離［25］。同時(shí)，適量的緩沖鹽可以降低ECD 的背景噪音并保護(hù)工作電極，因此本研究采用檸檬酸作為流動(dòng)相的添加劑，一方面在于檸檬酸在有機(jī)溶劑中的溶解性較好，另一方面在于檸檬酸緩沖溶液在較低的pH 值下有較強(qiáng)的緩沖能力。采用9.6 mg/mL檸檬酸溶液和乙腈作為流動(dòng)相，并利用NaOH 溶液調(diào)節(jié)檸檬酸溶液的pH 值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 值小于3 時(shí)，色譜峰分離度與峰形較好，而pH 值過(guò)低則導(dǎo)致ECD 響應(yīng)降低，故最終確定以9.6 mg/mL檸檬酸溶液（NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為2.74） 和乙腈作為流動(dòng)相。在優(yōu)化流動(dòng)相的基礎(chǔ)上，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依據(jù)“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，每隔50 mV 進(jìn)樣1 次，考察萹蓄化學(xué)成分在50～750 mV 電壓范圍內(nèi)的響應(yīng)情況，以確定最優(yōu)電壓。當(dāng)電壓小于650 mV 時(shí)，各成分的信號(hào)響應(yīng)隨電壓的增大而增大，而在650～700 mV 時(shí)大部分化合物的信號(hào)響應(yīng)已趨于平緩，綜合考慮，確定以650 mV 作為最佳檢測(cè)電壓。

本研究所采集的萹蓄來(lái)自4 個(gè)不同的產(chǎn)地，不同批次萹蓄間的化學(xué)成分和抗氧化活性均有較大差異。為研究不同產(chǎn)地間的萹蓄差異，對(duì)17 批樣品進(jìn)行PLS-DA 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地的萹蓄之間較為相近，但不同省份間的差異較大。這可能與不同產(chǎn)地間的氣候條件、生態(tài)系統(tǒng)差異較大，對(duì)藥用植物次生代謝物的影響較大有關(guān)［26］。較為特殊的是河南省的5 批樣品，彼此間的差異較大，這可能是由S15 和S16 與其他萹蓄的采集時(shí)間不同所致。該結(jié)果說(shuō)明，產(chǎn)地和采集時(shí)間均影響萹蓄藥材的質(zhì)量。

現(xiàn)有研究證實(shí)，萹蓄具有良好的抗氧化作用，但有關(guān)其具體的抗氧化成分研究較少。由于中藥的成分組成較為復(fù)雜，采用常規(guī)的分離、純化單體化合物的方法來(lái)篩查抗氧化成分難度較大。基于ECD 可特異性檢測(cè)酚類(lèi)等還原性化合物的原理，本研究采用HPLC-ECD 法建立萹蓄指紋圖譜，進(jìn)一步對(duì)萹蓄色譜圖總峰面積同總酚含量、DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)均大于0.855，即HPLC-ECD 色譜峰面積與抗氧化活性呈高度正相關(guān)，與其他藥用植物抗氧化的研究結(jié)果相一致［27-28］。

為深入探究萹蓄指紋圖譜共有峰與抗氧化活性之間的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步對(duì)萹蓄指紋圖譜中的26 個(gè)共有峰與3 種抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行GRA 與PLSR分析。GRA 結(jié)果顯示，除4 號(hào)峰（新綠原酸） 外，其余共有峰與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度均在0.8 以上，表明萹蓄發(fā)揮抗氧化活性為多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。經(jīng)PLSR 分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)抗氧化作用貢獻(xiàn)較大的為3 （原兒茶醛）、6 （兒茶素）、9、10 （表兒茶素）、11、12 （對(duì)香豆酸）、14 （洋薊素）、16 （異葒草苷）、19 （楊梅苷）、20 （萹蓄苷）、21 （槲皮苷）、23、24、25 號(hào)峰。9、23 ～25 號(hào)峰所代表的成分尚不清楚，后期可利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)以上4種未知成分及其他成分進(jìn)行指認(rèn)，從而為萹蓄抗氧化物質(zhì)的揭示提供依據(jù)。