HPLC 法同時(shí)測(cè)定除濕防疫顆粒中11 種成分

隋欣彤，董 欣，胡力銘，王仁廣，李小歡，王淑敏

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

除濕防疫顆粒是一種中藥復(fù)方制劑，由黃芩、赤芍、連翹、當(dāng)歸、生地黃、生黃芪、黃連、黃柏、蘆根、生薏苡仁、桃仁、冬瓜子、浙貝母、知母組成，具有清熱解毒、止咳平喘功效，以清熱藥為主，清肺化痰藥、補(bǔ)氣血藥為輔，共同作用于上焦，加強(qiáng)肺衛(wèi)之氣，抵御外邪。方中黃芩［1-2］、黃柏［3］、知母［4］、蘆根［5］、赤芍［6］等為清熱藥，而黃芪［4］、浙貝［7］、冬瓜子［8］等為清肺補(bǔ)氣血藥。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜多樣，其作用往往是協(xié)同效應(yīng)，故對(duì)多成分進(jìn)行質(zhì)量控制已成為相關(guān)研究的發(fā)展方向［9-12］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定除濕防疫顆粒中黃芩、赤芍、黃柏、黃連、桃仁、連翹、知母、黃芪、當(dāng)歸主要成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿、苦杏仁苷、連翹苷、芒果苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀，配置DAD檢測(cè)器（日本島津公司）； DE-100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）； AB135-S 型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）； FD 中試凍干機(jī)［金西盟（北京） 儀器有限公司］； C21-SDHCB15 多功能電磁爐（浙江蘇泊爾股份有限公司）； SB-4200DT 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芩（產(chǎn)地山西）、赤芍（產(chǎn)地內(nèi)蒙）、連翹（產(chǎn)地河南）、當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅）、生地黃（產(chǎn)地河南）、生黃芪（產(chǎn)地內(nèi)蒙）、黃連（產(chǎn)地四川）、黃柏（產(chǎn)地四川）、蘆根（產(chǎn)地河北）、生薏苡仁（產(chǎn)地貴州）、桃仁（產(chǎn)地河北）、冬瓜子（產(chǎn)地山東）、浙貝母（產(chǎn)地浙江）、知母（產(chǎn)地河北） 均購(gòu)自安國(guó)市安興中藥飲片有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王淑敏教授鑒定為正品，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 相關(guān)規(guī)定。除濕防疫顆粒（自制，方法為取總藥材183 g，加10 倍量水煎煮2 次，每次2 h，濾過(guò)，濾液凍干成粉末，加入乳糖、淀粉制粒，即得，每粒10 g，批號(hào)210402、210405、210408、210411、210414、210417）?？嘈尤受眨ㄅ?hào)B20687）、黃芩素（批號(hào)B20571）、鹽酸黃柏堿（批號(hào)B21437）、漢黃芩素（批號(hào)B20489） 對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司； 連翹苷（批號(hào)110821-201514）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)18031920） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院； 黃芩苷 （批號(hào)DSTDH002301）、鹽酸小檗堿 （批號(hào)DST191113-009）、芒果苷 （批號(hào)DST190305-031）、阿魏酸（ 批 號(hào) DST191022-001 ）、芍 藥 苷 （ 批 號(hào)DSTDS007001） 對(duì)照品均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司。乙腈為色譜純； 其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridge BEH C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)210、230、258、280、330 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 供試品溶液制備 取本品適量，粉碎成粉末，精密稱(chēng)取0.2 g，置于50 mL 錐形瓶中，精密加入20 mL 80% 甲醇，搖勻，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理40 min，冷卻至常溫，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮葡萄糖、阿魏酸、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、鹽酸黃柏堿、芒果苷、連翹苷、苦杏仁苷、芍藥苷對(duì)照品適量，甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為1、1、1、1、1、0.5、0.5、0.5、0.25、2、2 mg/mL 的溶液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照處方工藝，分別制成缺黃芪、缺當(dāng)歸、缺黃芩、缺黃連、缺黃柏、缺知母、缺連翹、缺桃仁、缺赤芍的陰性樣品，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 量取“2.2” “2.3 “ “2.4” 項(xiàng)下溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。由此可知，各成分色譜峰均有良好的分離度，理論塔板數(shù)大于3 000，陰性樣品溶液中除鹽酸小檗堿以外的成分無(wú)干擾（黃連、黃柏含有鹽酸小檗堿），表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

圖2 陰性樣品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of negative samples

2.6 線性關(guān)系考察 將“2.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液中的鹽酸小檗堿、苦杏仁苷、連翹苷、芒果苷、黃芩素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、漢黃芩素質(zhì)量濃度稀釋至0、2、4、8、16、32、64 μg/mL，芍藥苷質(zhì)量濃度稀釋至0、5、10、20、40、80、160 μg/mL，黃芩苷質(zhì)量濃度稀釋至50、100、200、300、400、500、600 μg/mL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3 次。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、苦杏仁苷、連翹苷、芒果苷、黃芩素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.69%、0.35%、0.86%、0.17%、0.84%、0.94%、0.76%、0.62%、0.45%、0.79%、0.83%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品6 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、苦杏仁苷、連翹苷、芒果苷、黃芩素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、漢黃芩素峰面積RSD 分別為 0.51%、0.39%、0.29%、1.79%、1.22%、1.75%、1.31%、1.04%、1.55%、1.05%、0.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份本品，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、苦杏仁苷、連翹苷、芒果苷、黃芩素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、漢黃芩素峰面積RSD 分別為1.29%、1.06%、1.00%、0.80%、0.38%、0.43%、1.48%、1.25%、1.23%、0.83%、1.05%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各成分含量已知的本品 （批號(hào)210404） 6 份，每份0.1 g，按100%水平精密加入“2.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、苦杏仁苷、連翹苷、芒果苷、黃芩素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、漢黃芩素平均加樣回收率（RSD） 分別為 100.12% （0.95%）、102.04% （1.28%）、93.33% （1.41%）、104.03% （1.54%）、98.66%（1.88%）、96.99% （2.11%）、97.07% （0.68%）、100.86% （1.60%）、95.83% （1.38%）、101.50%（1.88%）、97.55% （1.79%）。

2.11 含量測(cè)定 取6 批樣品，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，平行3 次，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)除濕防疫顆粒中各成分的理化性質(zhì)，選擇不同體積分?jǐn)?shù)甲醇作為溶劑進(jìn)行超聲提取，并考察了不同超聲時(shí)間的效果。結(jié)果，超聲時(shí)間為40、50、60 min 時(shí)各成分含量均無(wú)明顯差異，最終確定80% 甲醇超聲處理40 min 作為供試品溶液制備方法。

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)參考2020 年版《中國(guó)藥典》［13］，比較甲醇-10 mmol/L 甲酸銨（氨水調(diào)pH 至8）、甲醇-5 mmol/L 磷酸二氫銨溶液等流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果，乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相梯度洗脫71 min 時(shí)，各成分色譜峰峰形良好，基線平穩(wěn)，分離度理想，理論塔板數(shù)均大于3 000。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 由于除濕防疫顆粒成分復(fù)雜多樣，故本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［1-8，14-21］ 報(bào)道，利用二極管陣列紫外檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)，考察不同檢測(cè)波長(zhǎng)下色譜峰數(shù)目、分離度、峰面積。最終，采用“2.1” 項(xiàng)下多波長(zhǎng)檢測(cè)，此時(shí)各成分色譜峰均有較好的分離度，并且干擾較少。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定除濕防疫顆粒中黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、苦杏仁苷、連翹苷、芒果苷、黃芩素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、漢黃芩素的含量，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。