小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體的研究進(jìn)展

紫紹貴，張海鵬，鐘佑宏

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，最早于1915 年被發(fā)現(xiàn)，最初10 年起步階段噬菌體被嘗試用于治療細(xì)菌感染，但由于當(dāng)時(shí)噬菌體具體療效尚未被探明以及抗生素的出現(xiàn)，導(dǎo)致噬菌體療法被拋棄［1］。細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性日益嚴(yán)峻，噬菌體療法又重新引起了人們的關(guān)注。噬菌體被用于食品初加工、生物滅菌和生物保鮮三大食品工業(yè)領(lǐng)域，并被用來控制食品質(zhì)量，比如對(duì)抗食源性致病微生物如大腸埃希氏菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌、單增李斯特菌，也用來對(duì)付引起人畜共患的病原菌［2，3］。噬菌體不僅是殺滅細(xì)菌的武器，而且可以作為食源性病原菌存在的指示器應(yīng)用于食品、水和環(huán)境污染預(yù)警系統(tǒng)中［4，5］。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體正是對(duì)抗食源性病原菌——小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的利器。

1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌屬于耶爾森菌屬，革蘭氏陰性桿菌，由此菌引起的疾病稱為耶爾森氏菌病，人類感染多呈自限性，臨床癥狀包括發(fā)熱、胃腸消化功能紊亂伴隨急性腹瀉腸道炎癥等，然而在動(dòng)物身上通常表現(xiàn)為無癥狀帶菌［6］。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌廣泛分離于人、圈養(yǎng)的豬和野豬的排泄物，但在食品、自然環(huán)境和臨床標(biāo)本上分離率較低［7］。豬是該致病菌株的主要儲(chǔ)存宿主，除豬肉制品為主要感染來源外，輸血和飲用被污染的水源也可能導(dǎo)致感染［8］。根據(jù)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌體O 抗原的結(jié)構(gòu)已鑒定出60 多種不同的血清型，其分別歸屬于6 種生物分型——1A、1B、2、3、4、5［9-11］。屬于生物型1A 的菌株被確定為無致病性，通常分離于環(huán)境、健康的動(dòng)物和人的樣本。而生物型1B 即美洲型，是該菌種中最危險(xiǎn)的生物型。生物型2、3、4、5 被稱為歐洲型，致病性弱，在中國主要的致病生物血清型是2/O∶9、3/O∶3［12，13］。

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體是一類專性感染小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的病毒。用不同的血清型宿主菌從污水、糞便里分離不同的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體，已發(fā)現(xiàn)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體，大部分屬于短尾病毒和肌尾病毒（表1），有些分離到的噬菌體還可感染假結(jié)核耶爾森氏菌及其他一些對(duì)人類不致病的耶爾森氏菌［1，14-17］。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體不僅可以從污水、糞便中分離得到，還可以從溶源宿主菌中誘導(dǎo)出。 Liang 等［18］通過絲裂霉素C 誘導(dǎo)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分離得到6 株溫和噬菌體，其基因型不僅具有多樣性，而且在同種血清型菌株中分離到的噬菌體基因高度保守。Hammerl 等［19］從102 株致病性菌株中誘導(dǎo)分離得到10 株溫和噬菌體，都屬于肌尾病毒，依據(jù)基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹可以分為3 個(gè)組，僅在室溫下（約22 ℃）表現(xiàn)出裂解性。約有75%的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是溶源菌，用絲裂霉素C 誘導(dǎo)分離的噬菌體在不攜帶同源原噬菌體的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的培養(yǎng)基上出現(xiàn)混濁的噬斑，誘導(dǎo)獲得的噬菌體裂解性弱。通過誘導(dǎo)獲得的方式增加了噬菌體的獲取來源，有助于從更廣闊的群體中篩選目標(biāo)。

表1 小腸結(jié)腸耶爾森氏菌噬菌體

2 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體受體

噬菌體感染宿主具有嚴(yán)格的特異性，有尾噬菌體通常由受體結(jié)合蛋白（Receptor binding protein，RBP）介導(dǎo)與宿主受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［20］。受體成分包括細(xì)菌的鞭毛/菌毛、脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、莢膜多糖（Capsular polysaccharides，CPS）和外膜蛋白（Outer membrane proteins，Omp）［21］。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，由類脂（Lipid A，LA）、內(nèi)核（Inner core，IC）、外核（Outer core，OC）、O 特異抗原（O-antigen，O-ag）構(gòu)成［22］。由表 1 可知，fPS-59、phi80-18、phiYeO3-12、vB_YenP_AP5、phiYe-F10、vB_YenP_AP10 利用脂多糖O 特異抗原成分（O-PS）為受體［17，21-25］，vB_YenS_φR2-01、φR1-RT、vB_YenM_TG1、fPS-54-ocr 受體是Omp［15，16，22，26］，φR1-RT 和vB_YenM_TG1則同時(shí)利用IC of LPS、OmpF 為受體成分［27］，φR1-37、fPS-53、fPS-85、fPS-89 受體為OC［22，26］。

3 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體研究情況

3.1 短尾病毒噬菌體

根據(jù)噬菌體的受體類型和基因序列同源度把所屬噬菌體分為fPS 樣噬菌體和大腸桿菌T7 樣噬菌體。Salem 等［22，28］于2010—2012 年在14 家荷蘭養(yǎng)豬場中分離到fPS 類噬菌體，并從中選取了16 株具有代表性的噬菌體（Group Ⅰ：fPS-52、fPS-50、fPS-21、fPS-16、fPS-9、fPS-64、fPS-10、fPS-19、fPS-7、fPS-86、fPS-26；Group Ⅱ：fPS-89、fPS-85、fPS-53、fPS-54-ocr；Group Ⅲ：fPS-59），都屬于短尾病毒，均能夠感染小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型O∶3、O∶5，27、O∶9 菌株和假結(jié)核耶爾森氏菌血清型O∶1a、O∶1b、O∶3 菌株，總體基因組織結(jié)構(gòu)與大腸桿菌T7樣的噬菌體相似。除fPS-54-ocr 可能以細(xì)菌外膜蛋白為受體外，其余噬菌體均以細(xì)菌脂多糖為受體。Salem 等［22］的完整基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化樹研究表明，fPS 類噬菌體代表3 組類別，核苷酸序列高度重復(fù)。 大腸桿菌T7 樣的噬菌體有phi80-18、vB_YenP_Rambo、fHe-Yen3-01、phiYeO3-12、vB_YenP_AP5、phiYe-F10、vB_YenP_AP10 和PhiR8-01（表1）。phiYe-F10 分離自河南省登封市豬肛拭子，高度專性裂解O∶3 血清型菌株，對(duì)O∶5、O∶9 及其他菌株均不裂解［29］。研究表明其在25 ℃時(shí)裂解譜較窄，原因是受體由負(fù)責(zé)O 型抗原生物合成的DTDP-鼠李糖末端轉(zhuǎn)移酶RfbF 調(diào)節(jié)，推測O-抗原生物合成蛋白前體與phiYe-F10 受體吸附能力相關(guān)導(dǎo)致裂解效力下降［21］。PhiR8-01 在37 ℃生長的細(xì)菌上幾乎不產(chǎn)生噬斑，而在22 ℃下感染O 特異抗原和外核陰性的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶3，表明PhiR8-01的受體并不突出于外膜［30］。phiYeO3-12、vB_YenP_AP5 和phiYe-F10 能裂解致人類耶爾森氏菌病的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型O∶3 菌株，對(duì)耶爾森氏菌病的研究具有應(yīng)用價(jià)值［25，29，31，32］。

3.2 長尾病毒噬菌體

綜述3 株感染小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的長尾噬菌體。PY54 是從德國農(nóng)場糞便中采用不致病的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型O∶5 菌株在絲裂霉素C 的誘導(dǎo)下分離得到。PY54 作為溶源性耶爾森氏菌的質(zhì)粒，其基因?yàn)榫€性雙鏈閉環(huán)分子結(jié)構(gòu)，具有與大腸桿菌噬菌體N15 類似的特性［33-35］。vB_YenS_φR2-01 于1998 年分離自荷蘭圖爾庫城市污水處理廠，利用外膜蛋白BtuB 為受體，能夠裂解許多小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型和克氏耶爾森氏菌O∶3［15］。vB_YenS_P400 分離自德國東北部的野鹿糞便中，其宿主范圍窄，僅感染120 株測試株中的B4/O∶3 菌株2 株，且其基因組不與其他噬菌體同源，是繼vB_YenS_φR2-01 后發(fā)現(xiàn)的第2 株烈性長尾噬菌體［36］。

3.3 肌尾病毒

PY100 從德國農(nóng)場豬糞中分離得到，其宿主范圍廣，除能夠裂解小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型菌株O∶3、O∶5、27、O∶8、O∶9 和一些生物分型1A 菌株外，還可裂解假結(jié)核耶爾森氏菌、鼠疫耶爾森氏菌及其他耶爾森氏菌。衣殼蛋白和DNA 代謝相關(guān)蛋白與大腸桿菌噬菌體T1 同源，推測尾部蛋白與伴放線桿菌噬菌體AaΦ23 同源，PY100 ORF2 推測的基因產(chǎn)物與沙門氏菌噬菌體P22 的基因產(chǎn)物顯示出明顯的同源性［1］。φR1-37 是通過小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型O∶3 衍生物質(zhì)粒毒性固化O 抗原陰性菌株YeO3-R1 分離得到的，以小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌脂多糖外核多聚己糖為受體，該受體也存在于假結(jié)核耶爾森氏菌血清型O∶9 菌株中［16］。TG1 和φR1-RT分離于加拿大豬糞和芬蘭污水里，它們的核苷酸序列相似度為91%。低于25 ℃培養(yǎng)時(shí)，它們能裂解小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型O∶3、O∶5、27 和O∶9，不能感染其他屬類細(xì)菌，對(duì)宿主的選擇有嚴(yán)格的特異性。vB_YenM_TG1 和φR1-RT 均以細(xì)菌脂多糖內(nèi)核七碳糖殘基和外膜蛋白OmpF 為受體，而OmpF 受體依賴溫度表達(dá)，孵育溫度與OmpF 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。定量蛋白組學(xué)分析表明，OmpF 受體在22 ℃比37 ℃產(chǎn)生更高的蛋白豐度，且37 ℃下的蛋白豐度幾乎沒有超過測定的閾值［27］。fHe-Yen9-01、fHe-Yen9-02 和fHe-Yen9-03 是2013 年在芬蘭赫爾辛基污水處理廠中使用宿主菌小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶3 6471/76 和O∶9 Ruokola/71 菌株分離得到的。fHe-Yen9-01 宿主范圍比其他2 種更廣，在選用的測試菌株中三者的感染率分別為61.3%、42.4%、25.4%。Jun 等［37］首次將fHe-Yen9-01 用于食品、廚房用具和人工手污染模型試驗(yàn)中，取得了一定的殺菌效果。vB_YenM_P281 分離自德國東北部野鹿糞便中，該噬菌體具有寬闊的宿主范圍和較強(qiáng)的裂解能力，裂解小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶3、O∶5、O∶8 和O∶9 等血清型菌株。在28 ℃和37 ℃條件下，加入鈣、鎂離子后可裂解假結(jié)核耶爾森氏菌［14］。KFS-YE 是使用菌株ATCC23715 在韓國家禽養(yǎng)殖場水樣中分離得到的肌尾噬菌體，只裂解42 株測試株中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（ATCC55075、ATCC9610）2 株，具有在pH 4～11、溫度4～50 ℃條件下保持穩(wěn)定的特性［38］。vB_Yen_X1 分離自中國吉林省長春市一家污水處理廠，能夠在pH 4～11、溫度4～60 ℃條件下保持活性，并具有一定耐受性，裂解試驗(yàn)有27 株O∶3 和O∶8 菌株［39］。vB_Yen_X1 基因組與PY100 具有同源性，它們之間有10 個(gè)基因組編碼的蛋白存在差異［40］。通過研究小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌定殖小鼠腸道導(dǎo)致腸炎的模型，發(fā)現(xiàn)vB_Yen_X1 能夠有效緩解小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌對(duì)腸道的病理損傷［39，40］。

4 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體的應(yīng)用

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體在治療疾病、分離檢測致病菌和清除食源性病原菌中取得了理想的效果，展現(xiàn)出其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。利用噬菌體宿主受體結(jié)合蛋白分離食品中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，可以達(dá)到提高檢測效率的目的。從phi80-18、v_YenP_AP5、vB_YenM_TG1 中提取的受體結(jié)合蛋白表達(dá)在大腸埃希菌中，從中獲得與原生蛋白具有相同功能的Gp47、Gp17、Gp37，涂在磁性微粒表面與CIN 瓊脂結(jié)合使用，對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶3、O∶5、27、O∶8 和O∶9 菌株的分離特異度達(dá)85%，與CAY 瓊脂結(jié)合使用特異度高達(dá)95.7%。基于噬菌體識(shí)別結(jié)合蛋白的磁分離技術(shù)（RBP-MS）應(yīng)用于人工接種的碎豬肉樣品檢測與直接在CIN 或CAY平板上分離相比，其特異度提高了2 log10CFU/mL。RBP-MS 作為濃縮細(xì)菌的手段，提高了食品中致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的分離率［17］。利用phi-YeO3-12 尾蛋白結(jié)合雙抗免疫金標(biāo)記ELISA 試驗(yàn)，在透射電鏡下觀察小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，該方法能夠特異識(shí)別致病性血清型O∶3，是一種基于噬菌體黏附蛋白識(shí)別病原菌的應(yīng)用前景廣闊的方法［41］。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體用來治療食源性腸道致病菌，可以減少病菌在腸道中的定植量，并減輕腸炎癥狀。薛一冰［39］給小鼠口服vB_Yen_X1 制劑，6 h 后小鼠腸道內(nèi)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌消除率達(dá)33.3%，細(xì)菌數(shù)量在18 h 后減少至103 CFU/g，而未處理組則為107 CFU/g。Xue 等［40］通過腸道組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)噬菌體治療法對(duì)腸道組織有明顯的改善作用，而且促炎癥細(xì)胞因子水平明顯減少。噬菌體可以作為生物防治劑應(yīng)用于食品和廚具去污場景，如模擬小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌常見的感染途徑，用fHe-Yen9-01 對(duì)接種有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶9 的生肉、速食肉和牛奶進(jìn)行除菌，發(fā)現(xiàn)食品中的菌量分別降至2.12×102CFU/g、3.8×10 CFU/g、＜10 CFU/mL。噬菌體用在砧板、刀具和外科手套上，同樣能抑制細(xì)菌的生長［37］。還可以利用其控制微生物，如利用PY100 使小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在4 ℃肉湯中24 h 后減少3 log10單位，37 ℃中1.5 h 后減少5 log10單位，在4 ℃肉湯中48 h 后減少2 log10單位［42］。

5 展望

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體是對(duì)抗食源致病菌的有力武器，可以幫助人們提高檢出致病菌的能力，控制食源病菌的傳播。大多數(shù)的應(yīng)用研究尚屬于試驗(yàn)階段，成果未轉(zhuǎn)化，有待開發(fā)出可用于食品安全領(lǐng)域的產(chǎn)品及檢測試劑。分離噬菌體的主要來源是污水和排泄物，標(biāo)本來源途徑相對(duì)局限。有必要分離和鑒定出新的噬菌體，以擴(kuò)大用于食品安全領(lǐng)域噬菌體的候選范圍。通過誘導(dǎo)獲得噬菌體可拓寬其來源渠道，或有助于從多個(gè)候選者中選擇宿主譜寬、潛伏期短、暴發(fā)量高的目標(biāo)噬菌體。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌有眾多血清型，單個(gè)噬菌體難以覆蓋多種菌，需聯(lián)合使用多種噬菌體方能獲得理想的效果。廣泛應(yīng)用噬菌體還需要進(jìn)一步深入研究。