Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化豆粕大豆異黃酮提取工藝

花嬌嬌，劉 琦，耿曉桐，趙麗平，潘 巖

（信陽農(nóng)林學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000）

豆粕是大豆（Glycine maxL.）提取豆油后得到的副產(chǎn)品，含有大豆異黃酮［1，2］。大豆異黃酮具有藥用價值［3-9］，其提取方法主要有加熱回流法、有機溶劑萃取法、超聲波輔助萃取法、超臨界CO2萃取法、大孔樹脂吸附法、酸解法和酶解法等［10-13］。與傳統(tǒng)的有機溶劑法、酸解法等相比，超聲輔助提取的效率高，操作安全、節(jié)約能源、環(huán)境友好、提取費用低［14］，適用于大豆異黃酮的實驗室提取以及工業(yè)化的大規(guī)模提?。?5］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕原料購自當(dāng)?shù)丶屑Z油店；標(biāo)準(zhǔn)品染料木素，福州飛凈生物科技有限公司；三氯化鋁，濟南匯錦川化工有限公司；無水乙醇，蘇州辰澤化工有限公司。亞硝酸鈉，山東偉明化工有限公司；氫氧化鈉，溫州紅日化學(xué)試劑儀器有限公司；抗壞血酸，天津市鼎盛化工有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）試劑，福州飛凈生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；80-1 型臺式電動離心機，江蘇金壇市億通電子有限公司；FW-400A 型傾斜式高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆粕大豆異黃酮提取工藝流程 將豆粕置于50 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，再用高速粉碎機粉碎，并將豆粕粉過40 目篩，置于干燥的試劑瓶中儲存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取1.0 g 豆粕粉，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇萃取劑，再放入250 mL 具塞錐形瓶內(nèi)，用超聲波清洗機進(jìn)行超聲波萃取。將萃取結(jié)束后的溶液置于高速離心機中，以3 000 r/min 的速度離心10 min，并過0.45 μm 濾膜。取一定體積的濾液加入50 mL 容量瓶中，加入顯色試劑0.6 mL 亞硝酸鈉，使溶液充分混合，靜置5 min；加入10%的氯化鋁溶液0.6 mL，靜置6 min；然后加入4%的NaOH 溶液4 mL，最后用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇稀釋定容，測定其吸光度。豆粕大豆異黃酮的提取工藝流程如圖1所示。

圖1 豆粕大豆異黃酮的提取工藝流程

1.3.2 染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取5.000 0 mg染料木素標(biāo)準(zhǔn)品，加入無水乙醇，然后將其定容到50 mL 的容量瓶中，得到0.1 mg/mL 的染料木素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。準(zhǔn)確量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，加入無水乙醇定容到10 mL 的容量瓶中，采用紫外可見分光光度計，在波長260 nm 處對一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。以染料木素濃度（X）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，建立濃度與吸光度之間的線性關(guān)系，得到線性回歸方程Y=0.112 5X-0.032 5（R2=0.999 2），表明染料木素濃度在0.002～0.010 mg/mL 時，吸光度和濃度線性關(guān)系較好。

將按照以上工藝得到的豆粕大豆異黃酮提取液裝入比色皿中，測量其吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其濃度c，計算大豆異黃酮得率，具體計算式如下。

式中，T為大豆異黃酮得率，mg/g；c為提取液大豆異黃酮的濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；K為提取液稀釋的倍數(shù)；m為豆粕粉的投加質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗 在“1.3.1”的工藝下，準(zhǔn)確稱量1.000 0 g 豆粕粉，以豆粕大豆異黃酮得率為指標(biāo)，通過單因素試驗探究乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、超聲功率（200、250、300、350、400、450 W）、超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）、超聲溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，mL∶g）對豆粕大豆異黃酮得率的影響。并篩選出影響較大的3 個單因素，作響應(yīng)面優(yōu)化，每組試驗平行3 次（表1）。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 通過單因素試驗分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和液料比對豆粕大豆異黃酮得率的影響，采用Box-Behnken 法對豆粕大豆異黃酮提取工藝進(jìn)行研究，采用Design-Expert 8.0.6 軟件回歸擬合表中的試驗數(shù)據(jù)［16，17］。

1.3.5 豆粕大豆異黃酮體外抗氧化活性 配制質(zhì)量濃度為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL 的樣品溶液和0.05 mg/mL 的DPPH·溶液，并以維生素C 作對照。對照品2 mL DPPH·溶液+2 mL 無水乙醇，記為A0，2 mL 樣品溶液+2 mL 無水乙醇，記為A2，2 mL DPPH·溶液+2 mL 樣品溶液，記為A1。常溫下避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm 處測量DPPH·被還原后的吸光度。DPPH 自由基清除率計算式如下［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對大豆異黃酮得率的影響 設(shè)置液料比為30∶1，超聲輔助功率為200 W，加熱溫度30 ℃的條件下，萃取30 min。結(jié)果顯示（圖2），隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，大豆異黃酮得率呈先上升后下降的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，大豆異黃酮得率出現(xiàn)了最大值（3.11 mg/g）。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大豆異黃酮得率的影響

2.1.2 不同超聲功率對大豆異黃酮得率的影響 選擇上述最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，研究不同超聲功率對大豆異黃酮得率的影響。結(jié)果顯示（圖3），在超聲功率為300 W時，大豆異黃酮得率最高，為3.39 mg/g，當(dāng)超聲功率超過300 W時，大豆異黃酮得率逐漸降低。

圖3 超聲功率對大豆異黃酮得率的影響

2.1.3 不同超聲時間對大豆異黃酮得率的影響 選擇上述最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率300 W，研究不同超聲時間對大豆異黃酮得率的影響。由圖4可知，大豆異黃酮得率在30 min 時較20 min 有明顯的提高，說明延長萃取時間能促進(jìn)原料在溶劑中擴散，其主要原因是豆粕富含纖維素且蛋白質(zhì)含量低，有利于溶劑的滲透，也有利于大豆異黃酮在短時間內(nèi)進(jìn)入到溶劑中。而在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡后，大豆異黃酮得率將不再升高。

圖4 超聲時間對大豆異黃酮得率的影響

2.1.4 不同超聲溫度對大豆異黃酮得率的影響 由圖5 可知，當(dāng)超聲溫度低于40 ℃時，大豆異黃酮得率隨著超聲溫度的升高而升高，但超聲溫度在40 ℃以上時大豆異黃酮得率降低，故以40 ℃為最佳超聲溫度。

圖5 超聲溫度對大豆異黃酮得率的影響

2.1.5 不同液料比對大豆異黃酮得率的影響 由圖6可知，大豆異黃酮得率隨液料比的增加而先增加后減少，當(dāng)液料比為30∶1 時，大豆異黃酮得率最大，達(dá)3.26 mg/g。結(jié)果表明，液相比例過大，溶劑揮發(fā)會使大豆異黃酮含量降低，同時也會使雜質(zhì)的溶出速度加快，從而降低大豆異黃酮得率。因此，液料比以30∶1 為最佳。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 采用Box-Behnken法對大豆異黃酮提取工藝進(jìn)行研究，用Design-Expert 8.0.6 軟件回歸擬合表中的試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果如表2所示。回歸方程為Y=3.89-0.260A-0.015B+0.310C+0.300AB+0.080AC-0.008BC-0.680A2-0.660B2-0.790C2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸方程的方差分析 對回歸方程進(jìn)行方差分析，F(xiàn)的數(shù)值反映了有關(guān)模型分量對響應(yīng)值影響的貢獻(xiàn)度，F(xiàn)越大，則該因子的影響就越大；回歸模型在統(tǒng)計學(xué)上P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，說明試驗?zāi)Ｐ陀薪y(tǒng)計學(xué)意義。由表3可知，模型的F為72.760，P＜0.000 1，差異極顯著，說明回歸方程可靠；失擬項F為1.210，P=0.414 5＞0.05，誤差小，說明回歸方程擬合度較好，建立的模型可用于試驗結(jié)果的分析預(yù)測；A、C、AB、A2、B2和C2是影響較大的因子，其中A、C對豆粕大豆異黃酮得率影響極顯著?；贔的大小，影響大豆異黃酮得率因素從大到小排序為液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率。圖7、圖8 和圖9 中響應(yīng)面和等高線反映了3 個因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，若等高線的坡度較平緩，形近圓形，則交互作用不明顯；若等高線的坡度較陡峭，形狀偏橢圓形，則說明交互作用較明顯。由圖7、圖8、圖9 可知，交互作用中乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率的影響最大，超聲功率和液料比的影響最小。模型決定系數(shù)R2=0.989 4，表明實際測試所得數(shù)據(jù)與回歸方程之間呈現(xiàn)良好的吻合性，調(diào)整后的決定系數(shù)R2Adj=0.975 8，說明用該模式可以對97.58%的試驗響應(yīng)值變化進(jìn)行解釋。試驗的精確度為4.03%，信噪比為23.77，大于4.00，因此該模型和試驗操作可靠，能準(zhǔn)確反映試驗結(jié)果，具有較好的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。

表3 方差分析結(jié)果

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率對大豆異黃酮得率的響應(yīng)面（a）和等高線（b）

圖8 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對大豆異黃酮得率的響應(yīng)面（a）和等高線（b）

圖9 液料比和超聲功率對大豆異黃酮得率的響應(yīng)面（a）和等高線（b）

根據(jù)模型預(yù)測，得到豆粕大豆異黃酮的最佳提取工藝為液料比30.95∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)58.04%，超聲功率297.13 W，預(yù)測最佳提取量為3.95 mg/g。結(jié)合實踐方便操作，將工藝修正為液料比30∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率300 W。以此為條件進(jìn)行5 次平行試驗，得到豆粕大豆異黃酮得率的平均值為3.89 mg/g，接近預(yù)測值，表明建立的模型可靠，基于響應(yīng)面法輔助超聲可用于豆粕大豆異黃酮提取工藝優(yōu)化。

2.2.3 大豆異黃酮體外抗氧化活性 用DPPH·的清除性試驗驗證豆粕大豆異黃酮提取液的體外抗氧化性，由圖10 可知，隨著大豆異黃酮和維生素C 濃度的增加，DPPH 自由基清除率也增加，抗氧化能力不斷增強。維生素C 對DPPH 自由基清除率強于豆粕大豆異黃酮提取液，當(dāng)豆粕大豆異黃酮濃度達(dá)0.80 mg/mL 時，對自由基的清除率達(dá)68.20%。

圖10 大豆異黃酮提取液和維生素C 對DPPH·清除能力的測定結(jié)果

3 小結(jié)

試驗采用的超聲波輔助技術(shù)，運用響應(yīng)面法優(yōu)化了提取大豆異黃酮的因素，實現(xiàn)了實驗室豆粕大豆異黃酮的提取，避免了豆粕中大豆異黃酮資源的浪費，能為簡單高效地提取豆粕大豆異黃酮提供理論依據(jù)。

試驗通過單因素和Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波提取大豆異黃酮的工藝，得出了最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比30∶1、超聲溫度40 ℃、超聲功率300 W、超聲時間30 min。該工藝下豆粕大豆異黃酮得率的平均值為3.89 mg/g，該方法可以有效地從豆粕中分離出大豆異黃酮。當(dāng)大豆異黃酮濃度為0.80 mg/mL 時，其DPPH 自由基清除率達(dá)68.20%。該提取法穩(wěn)定簡單，可為豆粕大豆異黃酮的提取提供工藝指導(dǎo)，且表明豆粕中大豆異黃酮具有較好的抗氧化活性。