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    湖北省鄖西核桃炭疽病病原菌的分離鑒定

    2023-11-23 15:10:34曹春霞姚經(jīng)武黃大野王蓓蓓鄭嬌莉
    湖北畜牧獸醫(yī) 2023年10期
    關(guān)鍵詞:鄖西縣炭疽病分生孢子

    曹春霞,姚經(jīng)武,黃大野,王蓓蓓,鄭嬌莉,楊 丹

    (湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心,武漢 430064)

    核桃(Juglans regia)炭疽病是核桃生長(zhǎng)過程中的重要真菌病害,可危害其葉片、果實(shí)、芽、花苞和嫩梢,引起葉斑、落葉、花腐、果腐和枝梢枯死,嚴(yán)重制約著核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,影響農(nóng)民收益[1]。其病原菌主要有膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)[2,3]、果生刺盤孢菌(Colletotrichum fructicola)[4]、核桃盤二孢菌(Marssonina juglandis)[5]、暹羅刺盤孢菌(Colletotrichum siamense)[6,7]和尖孢刺盤孢復(fù)合種(Colletotrichum acutatum)[8]。湖北省鄖西縣核桃炭疽病大發(fā)生,但病原種類尚不明確。

    本研究以2022 年鄖西縣棋盤山核桃基地中的病葉為材料,旨在以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ),結(jié)合分子生物學(xué)(ITS和看家基因)對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定,以期明確該地區(qū)核桃炭疽病的病原種類,為該病害的后續(xù)研究和防治提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    核桃炭疽病的感病葉片以及健康葉片、果實(shí)于2022 年采自鄖西縣棋盤山核桃基地。

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L。

    E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit、TaKaRa PCR Mix RR901A、武漢瑞華光照培養(yǎng)箱、哈東聯(lián)超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、BIO-RAD C1000 Touch Thermal Cycler PCR 儀、君意JY300C 電泳儀、OLYMPUS BX43 顯微鏡、ABI 3730XL 測(cè)序儀、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿等。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 病原菌分離純化 采用組織分離法[9]。新鮮病葉清洗干凈,將葉片病健交界處組織切成小塊,用75%乙醇消毒3 s,放入5%次氯酸鈉中浸泡3~5 min,無菌水漂洗3 次,待小塊組織表面晾干,用接種針將組織塊移入PDA 培養(yǎng)基表面,每平板放5 片,培養(yǎng)皿密封后放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待組織邊緣長(zhǎng)出菌絲后,將菌絲塊轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板上進(jìn)行純化培養(yǎng),待純化的菌落產(chǎn)孢后,通過單孢分離獲得純的病原菌。

    1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將病原菌接種在PDA 平板上,置于25 ℃條件下培養(yǎng)10 d,觀察菌落形態(tài)和顏色;培養(yǎng)15 d 后,用無菌水將孢子洗脫下來,三層擦鏡紙過濾,顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)和大小,并拍照保存。

    1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 收集病原菌菌絲,采用E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit 提取病原菌DNA,所用引物為ITS和3 對(duì)看家基因[6](表1)。25 μL PCR 體系為Premix Taq(TaKaRa Taq ?Version 2.0 plus dye)12.5 μL,DNA(40 ng/μL)1 μL,引物F/R(10 μmol/L)各1 μL,滅菌蒸餾水9.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;每個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s;56 ℃退火45 s;72 ℃延伸45 s,共32 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min,反應(yīng)結(jié)束后,凝膠電泳回收擴(kuò)增片段,純化后的DNA 片段送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

    表1 擴(kuò)增ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 基因序列的引物

    1.2.4 致病性鑒定 分別采用菌絲塊和分生孢子液刺傷接種離體核桃葉片和果實(shí)進(jìn)行致病力測(cè)定。在菌絲塊接種試驗(yàn)中,病原菌在PDA 平板上25 ℃培養(yǎng)2~3 d,然后用孔徑6 mm 的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊,接種于核桃葉片和果實(shí)上的刺傷點(diǎn)(菌絲面向下貼緊葉片和果實(shí)表面)。每片葉片接種2 個(gè)菌絲塊,每處理重復(fù)6 片葉片;每個(gè)果實(shí)接種1個(gè)菌絲塊,每處理重復(fù)6 個(gè)果實(shí)。

    在分生孢子液接種試驗(yàn)中,首先用無菌水從培養(yǎng)了15 d 的菌落平板上洗下分生孢子,并用三層擦鏡紙過濾收集孢子液,離心后PDB 重新懸浮。通過血球計(jì)數(shù)板將孢子液濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL。在每片待接種的植株葉片刺傷點(diǎn)上放置6 片滅菌的濾紙片(直徑6 mm)。吸取分生孢子液20 μL 滴加在各濾紙片上。每片葉片接種6 個(gè)濾紙片,每處理重復(fù)6 片葉片;每個(gè)果實(shí)滴加20 μL 孢子液,每處理重復(fù)6 個(gè)果實(shí)。

    接種完成后,將葉片和果實(shí)置于放有濕潤(rùn)吸水紙的淺盤中,保鮮膜密封后置于25 ℃和12 h 光照/12 h 黑暗條件下保濕培養(yǎng),接種發(fā)病后,采用組織分離法分離發(fā)病部位病原菌,鑒定分離到的病原菌性狀是否與原始菌株相同。

    1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

    將ITS、ACT、GAPDH和HIS3基因的序列合并后,利用ML 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展支持率分析采用1 000 次重復(fù),并使用稻瘟菌菌株Magnaporthe oryzaPO-FA28 的對(duì)應(yīng)基因序列為外群[10]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 核桃葉部病害田間癥狀

    對(duì)鄖西縣棋盤山核桃基地的核桃葉部病害進(jìn)行了田間癥狀觀察,發(fā)現(xiàn)炭疽病是其重要病害,主要為害葉片。發(fā)病初期為圓形小斑點(diǎn),隨后在葉尖及葉緣形成大小不同的褐色病斑,呈不規(guī)則形狀,發(fā)病后期葉部病斑極易碎裂、脫落,形成穿孔癥狀,葉片焦枯脫落。

    2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

    采用組織分離法分離得到真菌菌株NYF2-2,菌株在25 ℃條件下生長(zhǎng)良好,產(chǎn)生白色菌絲,向四周輻射狀生長(zhǎng),隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),慢慢形成圓形菌落,7 d 左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿,初期菌絲為白色絮狀,菌落邊緣光滑規(guī)則。培養(yǎng)10 d 后,菌落背面可見黃綠色色素沉積(圖1A 和圖1B);菌株分生孢子是單孢,長(zhǎng)橢圓形,兩端鈍圓,孢子大小為(14.79±1.78)μm×(4.49±0.41)μm(圖1C)。經(jīng)菌落特性和孢子形態(tài)初步確定NYF2-2 屬于刺盤孢屬(Colletotrichumspp.)真菌。

    圖1 菌株NYF2-2 在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(25 ℃,10 d)和分生孢子

    2.3 病原菌的分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

    利用引物ITS4/ITS5及3 對(duì)看家基因引物對(duì)真菌DNA 進(jìn)行擴(kuò)增,通過1%瓊脂糖凝膠電泳均可檢測(cè)到單一清晰的條帶,條帶回收后測(cè)序。測(cè)得所有序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 分析,結(jié)果表明,所有序列都與膠孢炭疽菌的同源性最高,均可達(dá)到100%;系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明,菌株NYF2-2 和4 個(gè)膠孢炭疽菌菌株(C.gloeosporioidesCBS 112999、C.gloeosporioideslq27、C.gloeosporioideslq30 和C.gloeosporioideslq35)聚為同一分支(圖2)。因此,根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析,將病原菌NYF2-2 鑒定為膠孢炭疽菌。

    圖2 菌株NYF2-2 基于ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 4 個(gè)基因合并序列用NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.4 病原菌的致病力測(cè)定

    菌絲塊接種離體核桃葉片4 d 后病斑明顯,呈黑褐色(圖3B)。菌絲塊接種離體核桃果實(shí)7 d 后,病斑清晰可見(圖3F),隨著侵染時(shí)間增加,病斑面積逐漸擴(kuò)大;分生孢子液接種離體核桃葉片5 d 后出現(xiàn)明顯病斑(圖3D),分生孢子液接種離體核桃果實(shí)7 d 后出現(xiàn)明顯病斑(圖3H),后期病斑處易形成橘紅色孢子堆,所有病斑形態(tài)與田間葉片發(fā)病癥狀一致,發(fā)病的病斑經(jīng)過重新分離,重新獲得的菌株與原始菌株培養(yǎng)形態(tài)相同,表明菌株NYF2-2 是核桃炭疽病的病原菌。

    圖3 菌株NYF2-2 接種離體核桃葉片和果實(shí)的發(fā)病癥狀

    3 小結(jié)與討論

    湖北省鄖西縣核桃基地炭疽病發(fā)生危害程度日益嚴(yán)重。為了有效控制核桃炭疽病的暴發(fā)流行,明確病原種類十分必要。本研究于2022 年6 月從核桃發(fā)病葉片上分離到1 株強(qiáng)致病力菌株NYF2-2,將菌株進(jìn)行離體接種可使核桃葉片和果實(shí)發(fā)病,回接病葉和果實(shí)后再分離,得到的菌株與原分離菌株培養(yǎng)形態(tài)相同,經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證該菌株為核桃炭疽病的病原菌。通過培養(yǎng)特性和多基因序列(ITS、ACT、GAPDH和HIS3)分析,將菌株NYF2-2 鑒定為膠孢炭疽菌,表明膠孢炭疽菌是引起鄖西縣核桃產(chǎn)區(qū)炭疽病暴發(fā)流行的主要致病菌。菌株NYF2-2 在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)為灰白色,7 d 后逐漸變?yōu)榛揖G色。分生孢子單孢、無色、長(zhǎng)橢圓形,大小為(14.79±1.78)μm×(4.49±0.41)μm,與已報(bào)道的膠孢炭疽菌的分生孢子形態(tài)、大小基本一致[10]。

    有研究對(duì)其他省市的核桃炭疽病病原進(jìn)行了報(bào)道,如山東省濟(jì)南市[7]的核桃炭疽病病原菌為暹羅刺盤孢菌,陜西省核桃炭疽病的病原為咖啡刺盤孢(C.coffeanum)[11]等。本研究是關(guān)于湖北省鄖西縣核桃炭疽病病原的首次報(bào)道。1 種炭疽菌可以侵染幾種寄主植物,也可以幾種炭疽菌侵染1 種寄主植物。如引起葡萄炭疽病的有膠孢炭疽菌C.gloeosporioides[12],引起辣椒炭疽病的有C.acutatum、C.truncatum、C.fructicola和C.siamense4 種炭疽菌[13-15],而C.acutaum和C.gloeosporioides均可以引起草莓炭疽病[16]。本研究?jī)H對(duì)從病葉上分離到的1 株強(qiáng)致病性菌株進(jìn)行了鑒定,至于核桃上是否存在其他炭疽菌還需進(jìn)行后續(xù)研究,同時(shí),該病原菌的生物學(xué)特性、所致病害的發(fā)病規(guī)律等還需繼續(xù)研究,以便制定行之有效的防治方案。

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