黃酒釀酒酵母對醇類物質(zhì)的代謝調(diào)控研究進展

馬博文

（上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海 201501）

黃酒，是世界上三大古發(fā)酵酒精飲料之一，源于中國，唯中國有之，屬于東方釀造的典型代表，在我國民族特產(chǎn)中占有一席之地。黃酒主要以大米、小麥和水為原料，麥曲和酒藥為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過浸米、蒸飯、糖化、發(fā)酵等工藝釀制而成[1]，酒精含量為14 %vol～20 %vol，營養(yǎng)十分豐富，有“液體蛋糕”“酒中之瑰寶”的美稱[2]。黃酒的釀造涉及復(fù)雜的生態(tài)微生物系統(tǒng)（包括真菌、酵母和細菌），用酒曲釀酒、雙邊發(fā)酵幾乎保留發(fā)酵所產(chǎn)生的全部營養(yǎng)成分，如有機酸、氨基酸、酯類和維生素等[3]，其中氨基酸種類多達20種以上，含量十分豐富，黃酒中人體必需的8 種氨基酸含量是釀造酒中含量最多的[4]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是黃酒發(fā)酵的主導(dǎo)微生物，貫穿黃酒釀造生產(chǎn)過程，也是影響黃酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素，其性能的優(yōu)劣直接影響黃酒的生產(chǎn)效率與風(fēng)味品質(zhì)[5]，不同性狀的黃酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也具有顯著差異。高級醇是釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物，是黃酒風(fēng)味形成的重要組成部分，適量的高級醇能增加酒體的復(fù)雜程度，賦予酒豐滿的口感，不同呈香特征的高級醇物質(zhì)互相協(xié)作形成各類風(fēng)格的酒，但其含量過高時，會破壞酒體結(jié)構(gòu)，有異雜味產(chǎn)生。芳香醇是影響黃酒香氣的重要化合物，是酵母合成細胞蛋白質(zhì)時的副產(chǎn)物[6]，其濃度對黃酒產(chǎn)品品質(zhì)影響較大。不同的酵母菌株在發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物的含量也存在顯著差異[7]。適量的芳香醇（包括β-苯乙醇、酪醇和色氨酸）對黃酒香氣風(fēng)味有積極貢獻，賦予黃酒特有的醇香和圓潤協(xié)調(diào)的酒體[8]。β-苯乙醇也是一種常見于黃酒中的芳香化合物[9]，具有典型的玫瑰芳香，β-苯乙醇在黃酒中的濃度含量為40～130 mg/L，遠高于其他發(fā)酵食品中的含量，對黃酒獨特香氣的形成有重要作用[10]。

1 研究意義及現(xiàn)狀

黃酒中的醇類物質(zhì)主要包括乙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等，每一種醇類化合物都賦予了黃酒不同的風(fēng)味和香氣。釀酒酵母主導(dǎo)酒精發(fā)酵過程醇類物質(zhì)的生成，選育有優(yōu)異乙醇耐受性和發(fā)酵活性的釀酒酵母對于發(fā)酵生產(chǎn)來說至關(guān)重要，研究黃酒酵母對乙醇的耐受機制有助于更好的篩選黃酒生產(chǎn)用工業(yè)酵母。釀酒酵母利用發(fā)酵原料中游離的氨基酸合成自身生長繁殖所需的蛋白質(zhì)，當氨基酸中的氨基被利用后，殘余的α-酮酸經(jīng)脫羧和加氫還原可生成相應(yīng)的高級醇，高級醇的代謝途徑包括埃里希途徑（Ehrlich 途徑）和合成代謝途徑（Harris 途徑），氨基酸分解生成相應(yīng)高級醇的反應(yīng)過程，是由酵母細胞中的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、酮酸脫羧酶、脫氫酶等酶的催化活性決定的[11]，選育釀酒酵母代謝過程中某些關(guān)鍵性酶活性降低或失活的菌株，可阻斷或減弱生成高級醇的代謝途徑，以此顯著降低黃酒中高級醇含量[12]。高級醇的代謝機理（氨基酸的降解代謝途徑和糖合成代謝途徑）已有研究，但是發(fā)酵過程中的醇類物質(zhì)相互影響，其他醇類物質(zhì)代謝途徑總體研究不深。本文系統(tǒng)綜述了飲料酒中主要高級醇的代謝途徑及誘變育種技術(shù)在釀酒酵母高級醇代謝調(diào)控中的應(yīng)用，特別闡述了代謝工程技術(shù)如基因敲除方法、誘變育種技術(shù)以及發(fā)酵環(huán)境變化在釀酒酵母對醇類物質(zhì)代謝調(diào)控中的應(yīng)用。

2 黃酒釀酒酵母對醇類物質(zhì)代謝調(diào)控的路徑及基因

2.1 釀酒酵母乙醇代謝途徑及調(diào)控基因

乙醇耐受性機制取決于乙醇濃度[13]，在10%vol乙醇下增強的乙醇耐受性可歸因于氨基酸代謝，18%vol 乙醇耐受性是由于脂肪酸代謝[14]。氨基酸在乙醇造成的逆環(huán)境中，可以穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，參與蛋白質(zhì)裝配、折疊、防止蛋白質(zhì)變性[15]。飽和脂肪酸（例如棕櫚酸、硬脂酸）和不飽和脂肪酸（例如油酸）都可以通過增強細胞膜滲透屏障來提高酵母的乙醇耐受性。在不同程度的乙醇脅迫下，通過調(diào)節(jié)膜流動性可以抵消乙醇的破壞性影響[16]。在低濃度下（＜5%vol），乙醇在膜中的分配增加了膜的流動性，對細胞生長幾乎沒有影響。中等和高濃度乙醇（5 %vol～20%vol）的毒性作用往往會降低膜的流動性。在高乙醇脅迫（＞10%vol）下，高耐受性菌株能夠通過增加不飽和脂肪酸的含量來保持相對恒定的流動性。唯一具有與脂肪酸代謝相關(guān)的差異單核苷酸多態(tài)性突變位點的基因OLE1，可以降低膜流動性下降的速度，從而最大限度地減少乙醇毒性的流化影響，使酵母能夠更好地對抗乙醇的破壞性影響[17]。

通過生物信息學(xué)分析，基因g5170 的功能與黃酒酵母菌適應(yīng)乙醇脅迫有關(guān)[18]。通過敲除與過表達g5170 基因兩方面研究與驗證，在高濃度乙醇環(huán)境脅迫下，基因敲除菌株YHJ7-Δg5170 的乙醇耐受性要比原始菌株YHJ7的表現(xiàn)弱很多。利用釀酒酵母表達載體質(zhì)粒pYES2 將新基因g5170 轉(zhuǎn)化到BY4741 酵母菌株中，用半乳糖誘導(dǎo)法誘導(dǎo)新基因在BY4741 重組菌中表達，g5170 的重組酵母菌株對乙醇耐受性明顯比對照菌株強。結(jié)果表明此基因的功能確實與黃酒酵母菌適應(yīng)乙醇脅迫有關(guān)。

2.2 釀酒酵母芳香醇代謝途徑及調(diào)控基因

黃酒中的芳香醇主要由釀酒酵母HJ01 通過Ehrlich 途徑和莽草酸途徑合成，包括31 個基因，負責釀酒酵母中芳香醇的生物合成[19]。在黃酒發(fā)酵的前120 h 中，芳香醇的含量與芳香醇氨基酸的釋放呈正相關(guān)，由于原料和微生物的代謝作用，釀酒酵母水解原料中的氨基酸產(chǎn)生游離氨基酸，隨之基因GAP1HJ01（通透酶）、BAT2HJ01（轉(zhuǎn)氨酶）、PDC1HJ01、PDC5HJ01（丙酮酸脫羧酶）和ADH1HJ01（酒精脫氫酶）形成了整合的Ehrlich 途徑，負責芳香醇的生物合成[20]。在釀酒酵母HJ01中，參與 Ehrlich 通路的基因 GAP1HJ01、BAT2HJ01、PDC1HJ01 和PDC5HJ01 啟動子區(qū)域的突變增加了相關(guān)基因的啟動子強度和轉(zhuǎn)錄水平。添加20 U/g 酸性蛋白酶可以顯著提高Ehrlich 通路相關(guān)基因的表達水平，總芳香醇濃度增加34.7 %[21]。由于酸性蛋白酶具有超強的蛋白質(zhì)內(nèi)切和外切酶活力，使自由氨基氮快速釋放，從而提高芳香族游離氨基酸的釋放[22]。

發(fā)酵末期，由于酵母自溶，大量游離氨基酸和多肽隨著發(fā)酵時間延長而增加[23]。蛋白酶活力越高，黃酒酵母因芳香族游離氨基酸的釋放率和利用率提高，促進芳香醇的合成[24]。以上研究為提高黃酒中芳香醇的含量提供了重要的理論依據(jù)，可通過控制黃酒發(fā)酵中酸性蛋白酶的含量以及控制蛋白酶活力的高低來調(diào)控黃酒中芳香醇的含量。

2.3 釀酒酵母異丁醇代謝途徑及調(diào)控基因

黃酒中含有的多種物質(zhì)會通過抑制乙醇代謝促進黃酒飲后不舒適的體驗，在研究黃酒易上頭時，通過考察不同物質(zhì)對乙醇代謝的影響發(fā)現(xiàn)10種物質(zhì)中異丁醇對乙醇代謝的影響最大[25]。對半干型紹興黃酒中主要的高級醇含量進行檢測分析發(fā)現(xiàn)異丁醇是主要高級醇種類之一[26]，異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇三者含量占黃酒高級醇總量的80 %以上[27]。由于釀酒酵母細胞可通過纈氨酸代謝途徑合成少量異丁醇，自然狀態(tài)下作為釀酒酵母的次級代謝產(chǎn)物，異丁醇的發(fā)酵產(chǎn)量非常低。所以，增強釀酒酵母細胞對異丁醇耐受性并提高其異丁醇的合成能力對微生物發(fā)酵有重要意義。Dickinson 等[28]在1998 年通過13C標記氨基酸首次確定了在自然狀態(tài)下的釀酒酵母可由Ehrlich 途徑中的α-酮戊二酸代謝合成異丁醇，但是是釀酒酵母細胞代謝中產(chǎn)生的微量副產(chǎn)物。Liao 等[29]結(jié)合氨基酸合成途徑、α-酮酸的脫羧和還原途徑，以α-酮酸為底物，利用α酮酸脫羧酶和醇脫氫酶首次通過非發(fā)酵途徑合成了丁醇和異丁醇。Smith 等[30]通過在釀酒酵母細胞中過表達基因KIVD、ADH6 和ILV2，敲除丙酮酸脫羧酶基因PDC6，使釀酒酵母細胞的異丁醇產(chǎn)率達到了6.6 mg/g。Brat 等[31]在細胞質(zhì)中表達由ILV2、ILV5、ILV3、ARO10 和ADH2 組成的代謝途徑，異丁醇產(chǎn)率達到630 mg/g 葡萄糖。Chen 等[32]在釀酒酵母細胞中過表達基因ILV2、ILV5 和ILV3，釀酒酵母細胞在微厭氧發(fā)酵條件下異丁醇的產(chǎn)率由0.28 mg/g 葡萄糖提高到3.86 g/g 葡萄糖，在此基礎(chǔ)上進一步過表達支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶BAT2，結(jié)果顯示，異丁醇的發(fā)酵產(chǎn)量增加了兩倍。

圖1 釀酒酵母通過Ehrlich途徑和莽草酸途徑合成芳香醇

發(fā)酵過程中不斷積累的異丁醇會對細胞生命活動產(chǎn)生抑制作用，也會直接影響異丁醇的產(chǎn)量。溫智慧等[33]利用全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程提高釀酒酵母異丁醇耐受性，優(yōu)化了釀酒酵母細胞的纈氨酸代謝途徑，在釀酒酵母菌株中過表達纈氨酸代謝途徑中的乙酰乳酸合酶基因ILV2，二羥基異戊酸脫水酶的基因ILV3 以及編碼酮異戊酸脫羧酶的基因ARO10，得到的異丁醇產(chǎn)量與對照菌株相比提高了3.06 倍。以上研究為進一步增強釀酒酵母異丁醇耐受性奠定了基礎(chǔ)，進一步探索異丁醇耐受性的分子機制，為提高釀酒酵母的異丁醇發(fā)酵產(chǎn)量提供了新思路，也為黃酒上頭感提供了新的解決方案。

2.4 釀酒酵母異戊醇代謝途徑及調(diào)控基因

高級醇含量過高對人體有毒害作用，異戊醇含量過高，會造成人體神經(jīng)系統(tǒng)充血，而使人產(chǎn)生惡心、嘔吐、頭疼等中毒癥狀[34]。運用誘變育種方法選育分枝鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株，因其不能合成相應(yīng)的氨基酸合成途徑中與高級醇生成相關(guān)的酶，可以減少α-酮酸積累，從而降低高級醇生成量。Rous 等[35]通過紫外誘變的方法選育出一株異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株，用該突變株發(fā)酵時生成的異戊醇含量比出發(fā)菌株降低了50%。王鵬銀等[36]利用N+離子注入技術(shù)誘變并篩選得到1 株亮氨酸應(yīng)用缺陷型釀酒酵母A713，發(fā)酵產(chǎn)物中異戊醇含量降低了39.58 %。但誘變育種缺點明顯，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

基因工程育種有利于提高發(fā)酵產(chǎn)物的生成量，同時遺傳穩(wěn)定性強，結(jié)合異戊醇生成的代謝途徑，Eden 等[37]發(fā)現(xiàn)酵母中支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用受支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶控制，分別為線粒體支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶和細胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的缺失可阻斷或減弱支鏈氨基酸轉(zhuǎn)變成α-酮酸，進而減少亮氨酸生成異戊醇。通過同源重組技術(shù)分別對支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因BAT1 和BAT2敲除，突變株RY1-3生長繁殖受到抑制，產(chǎn)高級醇的含量顯著降低，異戊醇含量降低了25.31%[38]。黃酒釀酒酵母菌株S.cerevisiaeAY15 的LEU1 基因缺失后，異丁醇的生成量提高了41.7%，異戊醇的生成量降低33.7%；LEU2基因缺失后，異丁醇的生成量提高了52.2%，異戊醇的生成量降低了28.7%[39]。佐一含等[40]單敲除工業(yè)啤酒酵母S.cerevisiaeS-6 的LEU2 基因后，異戊醇生成量降低了11.8%。LEU1與LEU2 基因的敲除能夠提高異丁醇的生成量，同時降低異戊醇的生成量[41]。肖冬光等[42]在過表達釀酒酵母編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶ATF1 基因的同時，將釀酒酵母基因組中編碼酯水解酶的IAH1 基因敲除，結(jié)果降低異戊醇含量近一半。

2.5 釀酒酵母β-苯乙醇代謝途徑及調(diào)控基因

作為釀酒酵母的次級代謝產(chǎn)物，目前已有研究證明黃酒酵母產(chǎn)生的β-苯乙醇合成途徑主要與環(huán)境中的氮源種類相關(guān)，當L-苯丙氨酸作為唯一氮源時，Ehrlich 途徑會優(yōu)先合成代謝。L-苯丙氨酸為底物，通過芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用，生成苯丙酮酸，或在苯丙酮酸脫羧酶的作用下生成苯乙醛，進而脫羧生成β-苯乙醇或脫氫生成苯乙酸。當環(huán)境中有更容易轉(zhuǎn)化利用的氮源時，主要通過莽草酸途徑代謝[43]。苯丙酮酸脫羧酶催化苯丙酮酸生成苯乙醛的過程中相關(guān)的基因包括PDC1、PDC5、PDC6、ARO10 和THI3[44]，PDC5 基因編碼釀酒酵母中的丙酮酸脫羧酶，能夠催化丙酮酸脫羧成乙醛，同時具有丙酮酸脫羧酶活性[45]，釀酒酵母菌株敲除PDC5 基因后的突變株不僅阻斷了苯丙酮酸合成苯乙醛的主路途徑，而且加大了支路途徑的末端產(chǎn)物β-苯乙醇的胞外積累。通過敲除釀酒酵母PDC5基因的間接調(diào)控作用，能夠提高合成β-苯乙醇能力。

圖2 釀酒酵母通過艾利希途徑合成β-苯乙醇

研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母HJ01 的PDT 突變導(dǎo)致黃酒中β-苯乙醇濃度較高，比典型釀酒酵母W303 生產(chǎn)更多的β-苯乙醇。在釀酒酵母HJ01 中發(fā)現(xiàn)了PDT中的突變（I161K、L239P 和Q250H），發(fā)現(xiàn)來自釀酒酵母菌株HJ01 和W303 的純化PDT 被L-苯丙氨酸抑制。PDTHJ01 的比活性是PDTW303 的1.27 倍。它還表現(xiàn)出更高的底物親和力、催化效率和熱穩(wěn)定性，但不太容易受到反饋抑制。此研究為黃酒酵母代謝工程提供了一個潛在的目標——生產(chǎn)L-苯丙氨酸的釀酒酵母菌株。還有研究以β-苯乙醇主要合成途徑艾利希途徑的苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶Aro9p，苯丙酮酸脫羧酶Aro10p 以及醇脫氫酶Adh1p 作為研究的重點[46]，發(fā)現(xiàn)β-苯乙醇和乙醇會嚴重抑制苯丙酮酸脫羧酶Aro10p 的催化活性，Aro10pHJ 耐受β-苯乙醇和乙醇的能力略高于釀酒酵母Aro10pS288C。外源添加0～300 mg/L β-苯乙醇的情況下，醇脫氫酶對底物乙醛的催化反應(yīng)仍舊保持高催化活性，且黃酒酵母菌株的Adh1pHJ 耐受β-苯乙醇的能力相對來說高于酵母模式Adh1pS288C。Romagnoli 等[47]研究發(fā)現(xiàn)組合敲除釀酒酵母CEN.PK113-D 的ARO8、TYR1 及ARO3基因，同時分別利用基因ARO4K229L 和ARO7G141S 替代ARO4 與ARO7 基因以解除底物反饋抑制現(xiàn)象，能夠大幅度提高β-苯乙醇的得率。

3 結(jié)論與展望

目前釀酒酵母的主要醇類物質(zhì)代謝途徑已梳理清楚，代謝途徑中的酶系及其編碼基因已基本明確，但對釀酒酵母菌株的改造仍存在基因功能不明確、調(diào)控效果不理想、需要引入外源基因等諸多問題。目前研究集中于用生物調(diào)控法來實現(xiàn)釀酒酵母工業(yè)菌株高級醇代謝的精細化調(diào)控，但黃酒發(fā)酵過程是復(fù)雜的微生物反應(yīng)體系，為達到黃酒釀酒酵母風(fēng)味物質(zhì)比例協(xié)調(diào)、提升黃酒品質(zhì)的目標，可以利用微生物高通量、宏基因組分析、宏轉(zhuǎn)錄及靶標代謝組學(xué)等手段來深入研究釀酒酵母所處的外部環(huán)境條件和與之所對應(yīng)的內(nèi)部生理生化特征，在此基礎(chǔ)上建立代謝調(diào)控系統(tǒng)和定向育種技術(shù)體系，進一步調(diào)控黃酒中的醇類物質(zhì)，特別是乙醇和芳香醇的含量，芳香醇中含量高的揮發(fā)性物質(zhì)（異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇）對黃酒風(fēng)味的影響很大，對產(chǎn)品的品質(zhì)提升和飲后體驗感的改善都十分關(guān)鍵，為黃酒的健康釀造提供理論基礎(chǔ)。本文總結(jié)對于釀酒酵母醇類物質(zhì)代謝調(diào)控系統(tǒng)的建立具有重要理論意義，對深入分析釀酒酵母代謝調(diào)控原理以此通過分子生物學(xué)技術(shù)選育特定酵母菌株，為達到實際生產(chǎn)過程中對生產(chǎn)產(chǎn)物的特定需求提供了重要的理論依據(jù)，為實現(xiàn)黃酒中醇類物質(zhì)含量的精準調(diào)控提供了參考。