響應(yīng)面法優(yōu)化黑果腺肋花楸酒釀造工藝及成分研究

楊 晶，高曉晨，孫 堯，李 航，楊佳圓，徐 祎，高 冷*

(1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117)

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)又名黑果花楸，也稱野櫻莓、不老莓，薔薇科腺肋花楸屬植物，原產(chǎn)于北美、歐洲等地，20 世紀(jì)90 年代引種至我國，現(xiàn)東北地區(qū)有全國最大的黑果花楸種植基地，是集藥用、食用及生態(tài)價(jià)值一體的珍貴經(jīng)濟(jì)樹種[1]。黑果腺肋花楸果實(shí)中富含脂肪、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、碳水化合物、多種維生素和礦物類元素、糖類等豐富營養(yǎng)物質(zhì)[2]，同時(shí)含有大量的多酚類化合物[3]，如花青素[4]、類黃酮等，具有較強(qiáng)的抗氧化[5]、防衰老等功效，同時(shí)具有抗炎抑菌[6]、降血糖[7]、降壓[8]、抗癌和抗抑郁等功效。

黑果花楸進(jìn)行酒精發(fā)酵是提高其利用價(jià)值的方式之一。果酒是以新鮮水果或果汁為原料，經(jīng)過發(fā)酵調(diào)配制作而成的飲用酒。果酒在制備過程中保留了原有的風(fēng)味物質(zhì)，富含有機(jī)酸[9]、氨基酸[10]、維生素[11]、礦物元素以及多酚[12]類營養(yǎng)成分，具有抗氧化[13]、抗衰老[14]等調(diào)節(jié)功能，日益受到消費(fèi)者的關(guān)注和歡迎。

通過發(fā)酵，創(chuàng)造一個(gè)更利于黑果花楸功能性成分富集和保護(hù)的環(huán)境，使其充分發(fā)揮功效和作用。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果花楸酒的發(fā)酵工藝；利用HPLC-MS/MS 對黑果花楸酒多酚類物質(zhì)進(jìn)行成分分析；利用氣相色譜對黑果花楸酒香氣成分進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

黑果花楸：長春金荷藥業(yè)有限公司；AB-8大孔樹脂：天津南開大學(xué)化工廠；果酒酵母：安琪酵母有限公司；白糖：市售。

試劑及耗材：亞硫酸鈉、碳酸鈉，江西博浩源化工有限公司；無水乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)等，哈爾濱盛達(dá)生化儀器有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷、矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-木糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，青島捷世康生物技術(shù)有限公司；福林酚試劑(分析純)，上海源葉生物科技有限公司。

儀器設(shè)備：PHS-3C 型pH 計(jì)，濟(jì)南鑫露生物技術(shù)有限公司；TU-1800PC 型紫外可見分光光度計(jì)，上海雙旭電子有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱，北京海富達(dá)科技有限公司；MJ-BL25C3 攪拌機(jī)，廣東美的電器制造公司；HX2002T 型電子天平，慈溪市天東衡器廠；LC2040/MS-8045 型HPLC-MS/MS、7890B 氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檢測方法

總酸：電位滴定法；總糖：斐林試劑法；總酚：Folin-酚試劑法[15]；酒精度：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.2.2 生產(chǎn)工藝

黑果腺肋花楸果→挑選→清洗→瀝干→破碎打漿→加入果膠酶→加入亞硫酸鈉→糖→酵母→發(fā)酵→過濾→陳釀→過濾→調(diào)整成分→過濾→成品

1.2.3 操作要點(diǎn)

破碎打漿：挑選較為飽滿的黑果花楸果實(shí)破碎打漿。

酶解：按30 mg/L 加入果膠酶，在35 ℃下酶解2 h，使果漿更具流動(dòng)性，使果汁澄清。

抑菌：向果漿中加入亞硫酸鈉，攪拌均勻，抑制雜菌生長。

糖度調(diào)整：加入適量白砂糖，調(diào)整發(fā)酵液初始糖度。

發(fā)酵：接種果酒酵母，恒溫發(fā)酵，發(fā)酵中期間接性攪拌，發(fā)酵4～9 d，每24 h 測定酒精度及糖度，當(dāng)二者不再發(fā)生變化時(shí)，判定發(fā)酵結(jié)束。

陳釀：過濾處理，恒溫避光環(huán)境下貯藏。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

黑果花楸果漿總糖含量為7%，分別考察發(fā)酵液含糖量12 %、14 %、16 %、18 %、20 %、22 %，接種0.7 g/L 酵母，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵7 d；發(fā)酵溫度20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃，接種0.7 g/L酵母，發(fā)酵液含糖量18 %，發(fā)酵7 d；發(fā)酵時(shí)間4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，接種0.7 g/L 酵母，發(fā)酵液含糖量18%，發(fā)酵溫度26 ℃；酵母接種量0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L，發(fā)酵液含糖量18%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵7 d。以果酒酒精度、感官評價(jià)分值為評價(jià)指標(biāo)，確定各因素的最佳條件。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化黑果腺肋花楸酒的發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以發(fā)酵液含糖量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)及酵母接種量(D)為自變量，以酒精度(Y)為響應(yīng)值，每個(gè)因素取三個(gè)水平，進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化黑果腺肋花楸酒發(fā)酵最佳工藝。選擇的因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化分析因素表格

1.2.6 感官評價(jià)

參考葡萄酒感官評分[16]，選擇10人組建感官評定小組，依據(jù)感官評分標(biāo)準(zhǔn)對黑果腺肋花楸酒進(jìn)行感官評定，取其平均值作為最終評分結(jié)果。感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 黑果腺肋花楸酒感官評定

1.2.7 黑果花楸多酚類化合物的含量測定方法

根據(jù)李斌[17]的方法，用AB-8 大孔吸附樹脂純化黑果花楸中的多酚物質(zhì)。以沒食子酸為對照品，取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配置成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用福林酚試劑與碳酸鈉試劑顯色法[17]，在765 nm波長下測定吸光度，回歸方程為y=0.1314x-0.0567，R2=0.9985。

式中：C 為待測液濃度，N 為稀釋倍數(shù)，V 為待測液體積，m為黑果花楸質(zhì)量。

1.2.8 黑果花楸酒成分分析

高效液相色譜條件參考劉憲軍實(shí)驗(yàn)條件[18]：色譜柱為C18色譜柱；流動(dòng)相A 為乙腈；流動(dòng)相B 為0.2%甲酸水溶液；流速1 mL/min，柱溫箱30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，設(shè)置檢測波長為520 nm。

質(zhì)譜條件[19]：正離子模式，全自動(dòng)二級質(zhì)譜掃描，掃描范圍m/z 50～1000；干燥氣壓力207 kPa；流速12 L/min；溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓3500 V。

1.2.9 黑果花楸酒香氣成分鑒定

氣相色譜條件：色譜柱TR-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，恒定流速為1 mL/min，升溫程序：起始溫度25 ℃，以5 ℃/min 升至120 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 升至220 ℃保持5 min，進(jìn)樣模式為不分流。

表3 梯度洗脫時(shí)間表

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析采用Design-Expert 8.0軟件、Origin 9.0軟件等。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果花楸酒單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵液含糖量對黑果腺肋花楸酒發(fā)酵的影響

由圖1 可知，當(dāng)發(fā)酵液含糖量較低時(shí)，產(chǎn)生的酒精量較少，隨著發(fā)酵液含糖量的增加，酒精度逐漸達(dá)到最佳值；當(dāng)發(fā)酵液含糖量超過18%時(shí)，酒精度開始呈下降趨勢，由于糖含量過高，發(fā)酵液的滲透壓增大，對酵母產(chǎn)生了抑制作用[20]。酒精度在16%vol～20%vol 變化不大，且此時(shí)感官評價(jià)分值最高，因此，確定最佳發(fā)酵液含糖量為18%。

圖1 發(fā)酵液含糖量對黑果花楸酒酒精度的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對黑果腺肋花楸酒發(fā)酵的影響

由圖2 可知，溫度對發(fā)酵有較大影響，酵母菌在低溫環(huán)境下發(fā)酵能力較弱，當(dāng)發(fā)酵溫度低于20 ℃時(shí)，產(chǎn)生的酒精量較少；隨著發(fā)酵溫度的增加，酒精度逐漸達(dá)到最佳值；當(dāng)發(fā)酵溫度超過26 ℃時(shí)，對發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，酒精度開始呈下降趨勢。酒精度在23～29 ℃時(shí)變化不大，且此時(shí)感官評價(jià)分值最高，因此，確定最佳發(fā)酵溫度為26 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對黑果花楸酒酒精度的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對黑果腺肋花楸酒發(fā)酵的影響

由圖3 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，酒精度逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于7 d時(shí)，果酒隨著發(fā)酵時(shí)間延長，感官評價(jià)逐漸上升，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間等于7 d 時(shí)，酒精度達(dá)到最大，香氣和諧，感官評價(jià)最佳，發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長，酒精度逐漸降低。酒精度在發(fā)酵時(shí)間6～8 d 變化不大，且此時(shí)感官評價(jià)分值最高，因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間7 d。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對黑果花楸酒酒精度的影響

2.1.4 酵母接種量對黑果腺肋花楸酒發(fā)酵的影響

由圖4 可知，當(dāng)酵母接種量較低時(shí)，代謝繁殖速度緩慢，產(chǎn)生的酒精量較少，隨著酵母接種量的增加，當(dāng)酵母接種量為0.7 g/L 時(shí)，酒精度達(dá)到最佳值，繼續(xù)添加酵母，酒精度開始呈下降趨勢，感官評價(jià)明顯降低，可能是因?yàn)檫^多的糖導(dǎo)致酵母自溶，不利于發(fā)酵。酒精度在酵母添加量0.6～0.8 g/L 變化不大，且此時(shí)感官評價(jià)分值最高，因此，確定最佳酵母接種量0.7 g/L。

圖4 酵母接種量對黑果花楸酒酒精度的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化黑果腺肋花楸果酒的發(fā)酵工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 軟件，采用Box-Behnken Design 建立數(shù)學(xué)模型，以發(fā)酵液含糖量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)、酵母接種量(D)為自變量，酒精度(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面優(yōu)化果酒發(fā)酵工藝試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸方程與方差分析

由表5 所示，該模型P＜0.0001，極顯著，且失擬項(xiàng)P=0.5592＞0.05 不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.9788，校正系數(shù)R2Adj=0.9576，說明回歸模型擬合狀況良好，不存在失擬因素，可以利用此模型對黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵過程中酒精度的變化進(jìn)行分析和預(yù)測。根據(jù)F 值可知，各因素對酒精度的影響順序(從大到小)為：發(fā)酵液含糖量(A)＞發(fā)酵溫度(B)＞酵母接種量(D)＞發(fā)酵時(shí)間(C)。

表5 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

由圖5 可知，發(fā)酵液含糖量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)及酵母接種量(D)之間交互變化時(shí)，果酒的酒精度呈現(xiàn)相應(yīng)的變化。根據(jù)等高線可知交互效應(yīng)的大小，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著，因此可知加糖量和發(fā)酵溫度對果酒影響最大，發(fā)酵時(shí)間及酵母接種量次之。通過Design-Expert 8.0 軟件預(yù)測得到的最佳生產(chǎn)方案為：發(fā)酵液含糖量17.29%、發(fā)酵溫度25.53 ℃、發(fā)酵時(shí)間6.97 d、酵母接種量0.784 g/L。實(shí)際操作選取發(fā)酵液含糖量17 %、發(fā)酵溫度25.5 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 d、酵母接種量0.8 g/L。進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，果酒平均酒精度為8.5%vol。

2.3 感官指標(biāo)

2.3.1 感官品評

在最佳條件下制得的黑果花楸酒呈紅寶石色，澄清透明，口感醇厚，果香味與酒香味協(xié)調(diào)，感官評價(jià)達(dá)85分。

2.3.2 理化指標(biāo)

酒精度為8.5%vol，多酚類物質(zhì)含量為3.580mg/mL，總糖含量為14.45 g/L。

2.4 黑果花楸酒多酚類物質(zhì)的成分分析

通過HPLC-MS/MS 對黑果花楸酒多酚類物質(zhì)的成分進(jìn)行分析(總離子流圖見圖6)，根據(jù)各個(gè)化合物的出峰時(shí)間及離子碎片查閱參考文獻(xiàn)可知，黑果花楸多酚類物質(zhì)中有矢車菊-3-O-半乳糖苷[21]、矢車菊-3-O-葡萄糖苷[22]、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷[23]、矢車菊-3-O-木糖苷[24]、槲皮素-3-O-蕓香糖苷[25]、金絲桃苷[26]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷[27]，其中矢車菊-3-O-半乳糖苷含量最高。

圖6 黑果花楸酒多酚類物質(zhì)總離子流圖

如表6 所示，通過化合物的保留時(shí)間及化合物的特征碎裂方式共計(jì)找到7 個(gè)化合物，矢車菊素主要有矢車菊-3-O-半乳糖苷、矢車菊-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊-3-O-木糖苷，其中矢車菊-3-O-半乳糖苷含量最高，化合物存在主要離子峰m/z 287。M/z 287 是由矢車菊-3-O-半乳糖苷、矢車菊-3-O-葡萄糖苷失去一分子葡萄糖苷形成的，矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷(m/z 419)失去一分子阿拉伯糖苷形成的，矢車菊-3-O-木糖苷(m/z 419)失去一分子木糖苷形成的。從上述圖表中，可以得出，矢車菊素的碎裂方式主要是去葡萄糖醛酸，這與報(bào)道過的多酚類化合物裂解方式一致[21-24]。

表6 黑果花楸酒多酚類物質(zhì)成分組成

2.5 黑果花楸酒易揮發(fā)成分分析

圖7 標(biāo)準(zhǔn)品香氣成分色譜圖

由表7 可知，黑果花楸酒中檢測出12 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，含量較高的香氣物質(zhì)有乙酸乙酯、異戊醇、苯甲醇、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、異丁醇等。

表7 黑果花楸酒香氣成分組成

3 結(jié)論

黑果腺肋花楸酒最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵液含糖量17 %、發(fā)酵溫度25.5 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 d 以及酵母接種量0.8 g/L，此時(shí)酒精度為8.5 %vol，多酚類物質(zhì)含量為3.580 mg/mL。MS/MS 結(jié)果顯示黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)主要有有矢車菊-3-O-半乳糖苷、矢車菊-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其中矢車菊-3-O-半乳糖苷含量最高，為后續(xù)功能性研究提供基礎(chǔ)。氣相色譜結(jié)果表明，該果酒主要包含12種香氣成分，主要是乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇、苯甲醇、乙酸、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、異丁醇等。該果酒香氣成分豐富，感官評價(jià)極佳。該工藝為黑果花楸產(chǎn)品生加工利用提供了一個(gè)途徑，為農(nóng)民提供了增產(chǎn)增收的條件。

圖8 黑果花楸酒香氣成分色譜圖