GluR4在單側(cè)聾大鼠耳蝸核不同發(fā)育時間的表達(dá)△

原晶晶 閆占峰 周沫 葛鑫穎 劉錦峰 王鑫 鞏政 張瑩 劉思溟 王寧宇

單側(cè)聾患者如果缺乏及時的干預(yù)可能導(dǎo)致單側(cè)聽覺剝奪,并進(jìn)一步干擾雙耳信息的整合,導(dǎo)致聲源定位能力損失及噪聲環(huán)境下言語識別率降低。雖然研究表明單側(cè)聽力損失后雙耳聽力障礙適應(yīng)性不良,但其機(jī)制尚不清楚[1]。聽覺系統(tǒng)通過依賴于聽覺經(jīng)驗表現(xiàn)出可塑性,來適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[2]。可塑性廣泛存在于中樞聽覺系統(tǒng),隨著發(fā)育階段不同,可塑性發(fā)生變化,單側(cè)聾患者聽覺中樞接收兩耳高度不平衡的輸入,會破壞雙耳整合,可能會引起中樞聽覺系統(tǒng)重塑[3,4]。研究表明,發(fā)育關(guān)鍵時期的聽覺剝奪可能導(dǎo)致慢性腦功能障礙,延遲聽覺技能的獲得[5]。早期單側(cè)聽覺剝奪兒童錯過聽覺發(fā)育關(guān)鍵期后,是否可以行人工耳蝸植入,一直是臨床醫(yī)生面臨的難題。因此,對于發(fā)育早期單側(cè)聽覺剝奪所致的中樞重塑特征及其機(jī)制的認(rèn)識顯得尤為重要[6]。

耳聾引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化,可能伴隨著興奮性和抑制性受體表達(dá)的變化。神經(jīng)遞質(zhì)受體的性質(zhì)和數(shù)量的改變可以改變突觸傳遞的效率,從而改變神經(jīng)元之間的連接[7],并且神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)必須保持正常大腦功能的興奮和抑制平衡。在耳蝸核中,α-氨基-3-羧基-5-甲基異唑-4-丙酸(AMPA)型谷氨酸受體亞基介導(dǎo)聽覺通路中的快速突觸傳遞,并被選擇性地靶向于突觸后位點(diǎn)[8],甘氨酸通過激活甘氨酸受體來介導(dǎo)聽覺神經(jīng)的作用[9]。然而,對聽覺神經(jīng)突觸如何適應(yīng)聽力敏感性的變化知之甚少。本研究通過免疫組化方法檢測單側(cè)聾大鼠耳蝸核細(xì)胞中興奮性受體谷氨酸受體4(glutmate receptor 4,GluR4)在造模后1、2、3、4周的表達(dá)變化,以期對單側(cè)聽覺剝奪后聽覺中樞重組的分子機(jī)制研究提供進(jìn)一步參考。

1 實(shí)驗動物及分組

1.1實(shí)驗動物分組及單側(cè)耳蝸毀損造模 實(shí)驗對象選擇健康SPF級別的SD大鼠,由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。所有動物實(shí)驗程序均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(AEEI-2021-015),并嚴(yán)格遵守動物實(shí)驗的各項倫理條例。大鼠分為三組:實(shí)驗組、偽手術(shù)組及對照組。實(shí)驗組出生后12天(P12)進(jìn)行左側(cè)耳蝸毀損手術(shù),過程如下:大鼠麻醉后,行左耳后切口,鈍性分離筋膜及肌肉組織,暴露未完全骨化的聽泡。打開聽泡后在其內(nèi)側(cè)壁可見耳蝸底部。使用顯微鑷損毀耳蝸底,可見少許清亮淋巴液流出。止血、縫合耳后切口,在同側(cè)耳廓做楔形標(biāo)記。同日齡偽手術(shù)組SD大鼠麻醉后,僅做左側(cè)耳后切口,分離肌肉及筋膜組織,暴露聽泡即可,做耳廓楔形標(biāo)記。對照組不進(jìn)行任何干預(yù),同樣環(huán)境下飼養(yǎng)。造模后實(shí)驗組有5只死亡,偽手術(shù)組及空白對照組無死亡,納入后期形態(tài)學(xué)分析實(shí)驗組、偽手術(shù)組各32只,對照組24只。

1.2聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試 SD大鼠造模后1周(P19),三組動物均接受ABR測試。將麻醉后的SD大鼠置于隔聲艙內(nèi),將消毒后的大頭釘分別刺入SD大鼠頭部皮下(矢狀縫與兩外耳道連線)、雙側(cè)耳后皮下,以及SD大鼠尾部遠(yuǎn)端皮下,并分別連接記錄電極、參考電極以及接地電極夾持器。將SD大鼠雙側(cè)外耳道內(nèi)放置插入式耳機(jī),并給予交替短聲刺激。刺激參數(shù)如下:頻率范圍2～8 kHz,濾波帶通為100～2 000 Hz,掃描時間為10 ms,疊加次數(shù)512次,能引出可重復(fù)波形的最小刺激聲定義為閾值,因本實(shí)驗ABR測試旨在驗證模型是否成功,因此選擇給聲強(qiáng)度分別為30、80 dB nHL。ABR測試完畢后,造模失敗的SD大鼠將予脊椎脫臼法處死,不入組。將造模成功的實(shí)驗組大鼠及偽手術(shù)組、對照組大鼠按術(shù)后時間分別處理,術(shù)后1周斷頭取腦的實(shí)驗組和偽手術(shù)組各8只、對照組6只直接處死并取材,其余大鼠放在旋轉(zhuǎn)恒溫箱中,待麻醉蘇醒后繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3各組動物取材 分別取造模后1、2、3、4周后三組大鼠進(jìn)行實(shí)驗,實(shí)驗組及偽手術(shù)組各8只、對照組6只腹腔深麻醉后,大鼠腹面向上固定于蠟盤中,剪開劍突處的皮膚及皮下組織,游離心臟,暴露升主動脈。在心尖(左心室)處剪開一小口,將灌注針從剪口沿左心室后壁順心臟長軸插入升主動脈,打開灌注泵,迅速剪開右心耳,快速灌注0.9%生理鹽水100～150 ml,待大鼠血液排空時,使用4℃ 4%多聚甲醛以同樣速度快速灌注,此時大鼠出現(xiàn)抽搐痙攣現(xiàn)象; 待大鼠停止抽搐后,繼續(xù)緩慢灌注4%多聚甲醛20 min。灌注完成后,剝離顱骨及硬腦膜,去除小腦簾、大腦幕,將腦放入4%多聚甲醛中4°C后固定。脫水,修塊,于大腦背面四疊體中央做一冠狀切面,沿絨球小腦尾側(cè)做另一切面,保留耳蝸核,石蠟包埋。耳蝸核位置見圖1。定位耳蝸核的依據(jù)是大鼠腦立體定位圖譜(第六版),絨球小腦及面神經(jīng)可以協(xié)助辨別核團(tuán)的位置。從頭側(cè)向尾側(cè)做連續(xù)冠狀切片,貫穿耳蝸核,片厚8 μm,隔4張取1張。

圖1 大鼠冠狀位全腦切片,方框中為左側(cè)耳蝸核位置

1.4免疫組化染色 一抗為兔抗GluR 4單克隆抗體(1∶200);二抗為山羊抗兔生物素化抗體,均為ABcam公司產(chǎn)品。將經(jīng)過脫蠟、修復(fù)等處理的切片滴加配置好的一抗,放入4℃冰箱過夜,然后滴加二抗,室溫下反應(yīng)30 min后即可封片。

1.5圖像分析 用OlyVIA V2.9軟件及高倍(×400)顯微鏡觀察,各切片選取3個視野,應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行結(jié)果分析。檢測每張切片GluR4陽性著色的平均光密度值(mean optical density,MOD),MOD值越大GluR4陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1造模后1周三組大鼠ABR結(jié)果 實(shí)驗組大鼠單側(cè)耳蝸損毀1周后(P19)雙耳ABR結(jié)果見圖2,紅色曲線為右側(cè),給予30 dB nHL聲刺激時,ABR波形可引出;藍(lán)色曲線為左側(cè),給予80 dB nHL聲刺激時,ABR波形無法引出(圖2a)。偽手術(shù)組和對照組給予30 dB nHL聲刺激時,雙耳均可引出正常ABR波形(圖2b)。說明造模成功。

圖2 三組ABR測試結(jié)果 a. 實(shí)驗組大鼠單側(cè)耳蝸損毀1周后(P19時)雙耳ABR測試結(jié)果。紅色曲線為右側(cè),給予30 dB nHL聲刺激時,ABR波形可引出;藍(lán)色曲線為左側(cè),給予80 dB nHL聲刺激時,ABR波形無法引出; b. 偽手術(shù)組和對照組ABR結(jié)果。給予30 dB nHL聲刺激時,雙耳均可引出正常ABR波形

2.2免疫組化染色結(jié)果 由圖3可見,GluR4在各組動物耳蝸核中均有不同程度的表達(dá),典型表現(xiàn)為:耳蝸核內(nèi)較多大小不等的球形細(xì)胞,胞質(zhì)豐富,核仁深染,表現(xiàn)為免疫反應(yīng)陽性,陽性沉積物主要位于胞漿及胞膜上,呈棕黃色顆粒狀,在核周胞質(zhì)亦有表達(dá)。

圖3 實(shí)驗組及對照組造模后1、2、3、4周耳蝸核GluR4表達(dá)變化(免疫組化染色×400)

2.3各組GluR4陽性著色的MOD值 通過Image J軟件分析各組GluR4表達(dá)的MOD值,結(jié)果見表1。

表1 造模后不同時間各組耳蝸核的GluR4平均光密度值

2.3.1各組健側(cè)與術(shù)側(cè)耳蝸核GluR4的表達(dá)差異 實(shí)驗組術(shù)后1、2、3周雙側(cè)GluR4表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),術(shù)后4周雙側(cè)耳蝸核GluR4表達(dá)無明顯差異(P>0.05);偽手術(shù)組及對照組大鼠術(shù)后1、2、3、4周雙側(cè)對比,耳蝸核GluR4表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。

2.3.2不同組間耳蝸核GluR4的表達(dá)差異 術(shù)后1、2、3、4周偽手術(shù)組術(shù)側(cè)(左側(cè))與對照組左側(cè)、偽手術(shù)組健側(cè)(右側(cè))與對照組右側(cè)之間GluR4的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。實(shí)驗組術(shù)側(cè)分別與偽手術(shù)組術(shù)側(cè)和對照組左側(cè)相比GluR4的表達(dá)在1周時無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),術(shù)后2、3及4周均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);實(shí)驗組健側(cè)分別與偽手術(shù)組健側(cè)和對照組右側(cè)相比GluR4的表達(dá)在1周時有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),2、3及4周均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

2.3.3不同發(fā)育時間耳蝸核GluR4的表達(dá)差異 實(shí)驗組術(shù)側(cè)耳蝸核中GluR4的表達(dá)在術(shù)后2與3周相比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而術(shù)后1周與2周、3周與4周相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),說明在造模后3周出現(xiàn)升高,4周仍維持在一個較高的水平。實(shí)驗組健側(cè)術(shù)后2周與3周相比表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),術(shù)后3周與4周相比表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明耳蝸核中GluR4表達(dá)在造模后2周及3周持續(xù)升高,4周時下降。偽手術(shù)組雙側(cè)耳蝸核GluR4的表達(dá)術(shù)后1周與2周、2周與3周相比差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);對照組雙側(cè)耳蝸核GluR4的表達(dá)術(shù)后1周與2周、2周與3周相比差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明偽手術(shù)組及對照組耳蝸核GluR4的表達(dá)在術(shù)后2周升高,3周后下降。

3 討論

谷氨酸受體是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體[10],包括AMPA、kainate、delta和NMDA等類型。關(guān)于可塑性的分子機(jī)制的研究,AMPA受體受到越來越多的關(guān)注,AMPA受體包括GluR1-4四種亞單位,介導(dǎo)快速的興奮性神經(jīng)傳遞[11]。在耳蝸腹核中,GluR1抗體很少或不染色,GluR2抗體輕染色,GluR2/3和GluR4抗體中等染色[11,12];在耳蝸背核中,GluR4免疫標(biāo)記也廣泛存在,但有些在外層的可能被掩蓋。AMPA4受體在聽覺神經(jīng)元中的顯著存在可能是大腦快速激活和失活動力學(xué)的基礎(chǔ),這些特征在編碼聲音的時間特性的背景下是必要的[13]。

本研究中偽手術(shù)組及對照組在予以30 dB nHL聲刺激時,ABR可引出可重復(fù)波形;免疫組化結(jié)果示偽手術(shù)組及對照組在術(shù)后1、2、3、4周雙側(cè)耳蝸核間GluR4表達(dá)無明顯差異;組間比較偽手術(shù)組術(shù)側(cè)與對照組左側(cè)、偽手術(shù)組健側(cè)與對照組右側(cè)之間對比1、2、3、4周GluR4的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(>0.05),提示偽手術(shù)操作對大鼠的聽力及中樞形態(tài)學(xué)沒有影響。偽手術(shù)組及對照組雙側(cè)耳蝸核GluR4的表達(dá)術(shù)后1周與2周相比,2周與3周相比差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示偽手術(shù)組及對照組耳蝸核GluR4的表達(dá)在造模后2周升高,3周后下降。在正常大鼠的耳蝸核中,單個AMPA受體亞單位的表達(dá)隨著年齡增長而逐漸增加,成年模式在出生后的前4周內(nèi)緩慢出現(xiàn)[6]。對照組及偽手術(shù)組在術(shù)后2周時對AMPA受體的需求增加,這可能與這些細(xì)胞核的特定發(fā)育過程有關(guān)。

與偽手術(shù)組及對照組不同,實(shí)驗組經(jīng)過ABR驗證,均成功造模為單側(cè)聾大鼠。實(shí)驗組健側(cè)耳蝸核中GluR4的表達(dá)在造模后兩周升高,4周時下降;實(shí)驗組術(shù)側(cè)耳蝸核中GluR4的表達(dá)在造模后3周升高,4周仍維持在一個較高的水平,提示單側(cè)耳蝸毀損后,雙側(cè)耳蝸核中最先出現(xiàn)異常改變的部位是對側(cè)耳蝸核,在造模成功后第2周即出現(xiàn)GluR4表達(dá)的異常增高,但低于正常組及偽手術(shù)組,第3周開始高于這兩組;毀損側(cè)耳蝸核在術(shù)后3周出現(xiàn)GluR4表達(dá)增高;與偽手術(shù)組及對照組相比,實(shí)驗組雙側(cè)耳蝸核出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)遞質(zhì)受體亞單位的不對稱性改變。分析其原因,可能為大鼠左側(cè)耳蝸毀損后,左側(cè)聽覺輸入被破壞,聽覺中樞賴以發(fā)育和成熟的聽覺經(jīng)驗完全依賴于對側(cè)聽覺正常耳,為了維持中樞獲得信號刺激的程度,從而不影響聽覺中樞的發(fā)育,中樞代償性地增加了對側(cè)耳蝸核內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá)量。但隨著對側(cè)耳蝸核內(nèi)AMPA4受體的表達(dá)增加,其輸入電活動進(jìn)一步增強(qiáng),而毀損側(cè)依然缺乏有效的信號輸入,這就造成了雙側(cè)耳蝸核電活動的不對稱性進(jìn)一步增加,嚴(yán)重破壞了雙側(cè)聽覺通路的生理平衡,因此在此基礎(chǔ)上,中樞為重新實(shí)現(xiàn)雙側(cè)平衡,代償性地增加了毀損側(cè)耳蝸核內(nèi)AMPA4受體的表達(dá),而且這種增高狀態(tài)持續(xù)至第4周,而對側(cè)耳蝸核的AMPA4受體表達(dá),在第4周時已經(jīng)出現(xiàn)下降趨勢。

褚銅等[14]在實(shí)驗中發(fā)現(xiàn),單側(cè)耳蝸損傷術(shù)后2 h即可觀察到術(shù)側(cè)蝸核胞漿中AMPA2/3受體表達(dá)增強(qiáng),6 h達(dá)到高峰,以后逐漸減弱,至第3 d時低于正常水平。Whiting等[15]通過單耳耳塞置入耳道1 d制造單側(cè)傳導(dǎo)性聽力下降模型,單側(cè)聽力約下降20 dB,發(fā)現(xiàn)患側(cè)耳蝸核興奮性遞質(zhì)受體GluR3亞基表達(dá)上調(diào),以響應(yīng)突觸活動的減少或阻斷,一旦耳塞被移除,這些表達(dá)水平的變化是完全可逆的;表明這些活動影響了突觸上受體的運(yùn)輸,提示受聽神經(jīng)支配的耳蝸核神經(jīng)元能夠通過重新分配特定的AMPA和甘氨酸受體亞基,對聲音水平的微小變化作出反應(yīng)。但以上實(shí)驗均為短期觀察,本實(shí)驗對大鼠發(fā)育過程中四個時間段AMPA4受體亞單位在耳蝸核的表達(dá)進(jìn)行分析,揭示了神經(jīng)遞質(zhì)受體的改變與聽覺中樞的重組相關(guān)。

本實(shí)驗初步證明了單側(cè)聾大鼠雙側(cè)耳蝸核GluR4表達(dá)的不對稱改變,本研究只選擇了聽覺通路中耳蝸核一個部位,其它聽覺核團(tuán)如LSO及聽皮層神經(jīng)遞質(zhì)及受體是否也發(fā)生了類似的改變,相應(yīng)的改變是否具有可逆性,相關(guān)的研究工作正在進(jìn)行之中。